文摘
胰岛素样生长因子1 (IGF1)据说反对chemotoxicity尤因肉瘤的肿瘤(ESFT)细胞。然而,IGF1的影响细胞凋亡诱导细胞凋亡配体2 (Apo2L) /肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)还有待建立。我们发现相反的部分生存影响短期IGF1治疗,长期IGF1治疗放大Apo2L / TRAIL-induced凋亡Apo2L / TRAIL-sensitive但不耐ESFT细胞系。值得注意的是,特定的IGF1受体(IGF1R)抗体-IR3功能相当于IGF1。短期IGF1孵化的细胞刺激生存激酶AKT和增加细胞凋亡的抑制(XIAP)蛋白质与Apo2L /小道阻力。相比之下,长期IGF1孵化了XIAP镇压变化蛋白质通过神经酰胺(Cer)形成来源于从头合成与Apo2L /跟踪敏感相关。增加神经酰胺合成酶(cer)抑制剂fumonisin B1在治疗长期IGF1 XIAP镇压和Apo2L / TRAIL-induced细胞凋亡减少。值得注意,抵抗常规化疗药物维持细胞内后慢性IGF1治疗。总的来说,结果表明,慢性IGF1治疗呈现ESFT细胞容易Apo2L / TRAIL-induced细胞凋亡,可能具有重要意义的生物以及耐火ESFT的临床管理。
1。介绍
尤因肉瘤的肿瘤家族(ESFT)的骨骼和软组织包括尤因肉瘤,外围原始neuroectodermal肿瘤和肿瘤的Askin小儿恶性肿瘤的最积极的。尽管耐多药化疗结合手术和/或辐射,转移患者的长期生存率和复发性疾病仍然是惨淡的(1]。洞察机制改善恶性肿瘤仍然是一个高优先级在ESFT研究和鉴定新的靶向治疗的先决条件。
一些证据表明IGF1在扩散中扮演关键角色,转移和生存ESFT [2]。特异类型1和类型2 IGF受体(IGF1R和IGF2R)表达在ESFT细胞和代谢等操作的刺激葡萄糖运输、糖原合成和胸苷并入DNA IGF1和IGF2通过IGF1R传输(3]。一个IGF1-IGF1R自分泌电路提出在某些ESFT细胞和添加IGF1R抗体抑制细胞增殖引起的(4]。IGF-binding蛋白3 (IGFBP3)生产压抑ESFT细胞致癌融合蛋白,这可能允许IGF1R通过增加配体激活绑定(5]。重要的是,IGF1呈现ESFT细胞抵抗化疗药物(6,7]。Hofbauer et al。6)发现血清IGF1负责化学抗性的诱导ESFT细胞体外。Toretsky et al。7)报道,人类重组IGF1可以保护ESFT化疗所致的细胞通过一种蛋白激酶的激活细胞死亡,一个磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K)监管的丝氨酸/苏氨酸激酶生存。然而,没有研究IGF1 ESFT细胞的活性与Apo2L / TRAIL对治疗的反应。
Apo2L /小道是细胞因子肿瘤坏死因子超家族的一员,代表了一种癌症治疗,因为它最有价值的候选人启动细胞凋亡最好是在肿瘤细胞在正常细胞,在体外和体内都在非人灵长类动物和老鼠8- - - - - -10]。此外,Apo2L /轨迹是由不同的免疫细胞和视为' host-defence机制对早期癌症(11]。临床研究正在评估的安全性和抗肿瘤活性Apo2L /跟踪[12]。迄今为止,这些细胞最容易Apo2L /小道源自ESFT凋亡反应在32 40(80%)建立细胞系的体外和3 3例(100%)patient-derived细胞体外从而表明这种治疗概念的隆起(13]。Apo2L /跟踪触发凋亡与特定交互死亡受体(TRAILR1 / DR4和/或TRAILR2 / DR5)其次是激活剂caspase-8和随后的激活效应还存在3和7(外在或死亡受体凋亡途径)14]。Apo2L /小道也可以启动caspase-8-dependent线粒体功能障碍导致激活caspase-9(内在或线粒体凋亡途径)。固有细胞凋亡可以调节消极mitochondria-associated凋亡bcl - 2家族的成员,而外在细胞凋亡主要是被抑制细胞凋亡蛋白(IAP)的家庭成员包括XIAP结合直接催化地活跃的网站还存在效应(15,16]。XIAP直接下游AKT的目标和IGF1细胞生存的一个重要中介17,18]。XIAP水平变化增加蛋白质和/或一种蛋白激酶活性与抗Apo2L /小道在各种癌症细胞类型19- - - - - -22]。
在目前的研究中,我们调查了IGF1的作用在调节细胞凋亡诱导Apo2L / ESFT细胞。我们表明,根据治疗时间IGF1最初作为凋亡因子和随后的上下文中作为proapoptotic因素Apo2L /杀伤力。值得注意的是,IGF1R抗体α-IR3 IGF1拟态。此外,我们目前的这部小说发现IGF1可以放大Apo2L / TRAIL-induced凋亡通过XIAP镇压新创神经酰胺(Cer)的形成。这个新的见解IGF1的作用提供了有趣的线索发展创新组合方法治疗难治性ESFT。
2。材料和方法
2.1。试剂
IGF1 (PeproTech落基山,新泽西州),α渥曼青霉素,-IR3,阿霉素,z-VAD-fmk z-DEVD-fmk AKTi-1/2 (AKT抑制剂八世;默克化工、达姆施塔特,德国),fumonisin B1(德国汉堡Biomol)和脂肪无酸的牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich、Taufkirchen、德国)从指定的供应商购买。鞘脂类的d17:0-sphinganine、d17:1-sphingosine d18:1 / C17:0-Cer, d18:1 / C17:0-sphingomyelin来自两代情极性脂质(美国艾尔雪花石膏)。依托泊苷是慷慨地提供通过Medac Cipla公司(印度孟买)(威德尔,德国)。Apo2L /小道慷慨提供的基因泰克(美国旧金山,CA)。
2.2。细胞培养和孵化条件
以下人类ESFT细胞系进行了研究:A9423(提供盖Triche、洛杉矶、钙、美国),es 2(由托马斯看,孟菲斯,TN,美国),35圈(由凯蒂Scotlandi、博洛尼亚、意大利),和A17/95(由乌苏拉安德利果汁,柏林,德国)。ESFT细胞系RD-ES和SK-ES-1从写明ATCC获得(罗克维尔市,医学博士,美国),和CADO-ES-1 MHH-ES-1来自德国的微生物和细胞培养(德国布伦瑞克)。ESFT细胞系vh - 64, - 68年以前建立的一个人(F.v.V。) [3]。临床数据和所有的细胞系的细胞遗传学特性了(23]。细胞被维护在rpmi - 1640中补充10%胎牛血清(FCS), 1%的抗生素抗真菌的混合物(10毫克/毫升链霉素10000 U /毫升青霉素和25μg / mL两性霉素B), 2毫米谷酰胺(美国纽约Gibco,大岛)(即。,血清中)在37°C在湿润的气氛中有5%的公司2。细胞在25厘米的亚文化2组织培养烧瓶用0.05%胰蛋白酶/ 0.02% EDTA在冰球的盐水(Gibco)。细胞(8×104/厘米2)被播种在96 -孔板细胞生存能力,在白96 -半胱天冬酶化验光度计板块,在板材12-well凋亡分析,在板材6-well蛋白质提取,和75年——厘米2鞘脂类提取的组织培养瓶。所有合成文化制品(猎鹰塑料、奥克斯纳德、钙、美国)collagen-coated (5μ克/厘米2;美国NH BioConcept,萨勒姆)所描述的13]。IGF1的影响的分析,文化被清洗和维护在无血清培养基代替血清0.2%脂肪无酸的牛血清白蛋白(BSA);Sigma-Aldrich Taufkirchen、德国)24小时直到实验。细胞使用IGF1紧随其后Apo2L /跟踪显示治疗时间。评估药理抑制剂的影响,这些代理在指定的浓度添加到文化IGF1和/或治疗前30分钟Apo2L /跟踪。
2.3。细胞凋亡和细胞生存能力分析
fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)分析细胞凋亡,细胞分离与5毫米EDTA在PBS和洗包含0.2% BSA PBS。细胞培养与R-phycoerythrin-conjugated annexin-V (1: 100;表达载体,达姆施塔特,德国)和7-amino-actinomycin D (7-AAD, 1: 200;在黑暗中表达载体)在室温下。20分钟后细胞被洗在冰冷的PBS含有叠氮化钠0.5%和分析FACS-Calibur (BD生物科学、海德堡、德国)使用CellQuest Pro软件(BD生物科学)。特定的细胞凋亡是计算如下:100×[实验细胞凋亡(%)−自发凋亡(%)/ 100%−自发凋亡(%)]。对于评估细胞的生存能力,光度法转换3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(麻省理工;使用一个维克多Sigma-Aldrich)测量3德国1420 Multilabel计数器(PerkinElmer Rodgau)在550海里。比例的细胞生存能力的公式计算出100×(吸光度实验井/吸光度控制井)。
2.4。半胱天冬酶化验
Casapase-8、caspase-9 capase-3/7 Caspase-Glo-8活动进行了分析,Caspase-Glo-9,分别Caspase-Glo-3/7化验(WI Promega,麦迪逊,美国)。细胞暴露于IGF1的时代表示,随后孵化与Apo2L 4小时/跟踪。此后,同等体积的Caspase-Glo-8 Caspase-Glo-9,或Caspase-Glo-3/7试剂添加到细胞和文化孕育了一个额外的45分钟。公布的aminoluciferin caspase-mediated乳沟使用维克多proluminogenic衬底的决心3板读者(PerkinElmer)。背景发光决心利用reactions-lacking细胞。半胱天冬酶活性表达为褶皱增加半胱天冬酶活动之间的相对光单元比治疗细胞与未经处理的细胞(归一化相对单位1.0)。
2.5。鞘脂类识别和定量
细胞被胰蛋白酶化收获,洗在冰冷的PBS和颗粒状,并储存在液氮中。脂质提取,细胞颗粒冻干,使用乙酸乙酯的混合物提取:异丙醇:水(60:30:10 v / v / v) (24]。鞘脂类的样本飙升内部标准d17:0-sphinganine组成的混合物(50 pmol), d17:1-sphingosine (150 pmol), d18:1 / C17:0-Cer (250 pmol),和d18:1 / C17:0-sphingomyelin (500 pmol)。鞘脂类被量化高性能液相色谱与电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS / MS)在4000年一个API三重四极质谱仪(应用生物系统公司,达姆施塔特,德国)。细胞鞘脂类水平正常化活细胞数。
2.6。免疫印迹分析
在100年PBS包含收获细胞被冲洗μ米纳3签证官4在4°C和lyzed 30分钟特里同x - 100缓冲区(20毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,150毫米氯化钠,1毫米EDTA, EGTA 1毫米,2.5毫米焦磷酸钠,1毫米β甘油磷酸盐,1毫米Na3签证官4,1μ1毫米PMS g / mL亮抑酶肽,1% Triton x - 100)。蛋白表达决心全细胞溶解产物(50 - 100年μ使用洗涤剂兼容Bio-Rad蛋白质测定g)。蛋白质溶解在Laemmli缓冲区,解决12% sds - page凝胶,并转移到PVDF。与5%的免疫印迹膜被封锁阻止缓冲区和孵化与相应的抗体。主要抗体是兔子anti-AKT多克隆抗体(1:500),兔子anti-pAKT (Ser473)多克隆抗体(1:100),兔子anti-Mcl-1多克隆抗体(1:500;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),鼠标anti-XIAP马伯(1:250),和兔子anti-Bax多克隆抗体(1:1000;BD生物科学Pharmingen,德国海德堡)。二次抗体应用是山羊anti-mouse免疫球蛋白g (1: 5000;DakoCytomation、德国汉堡)和山羊anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 5000;DakoCytomation)。增强化学发光(通用电气医疗集团,弗莱堡,德国)是用于信号检测。 Unless otherwise indicated, equal protein loading was monitored by immunodetection ofβ使用鼠标反肌动蛋白β肌动蛋白马伯(1:25000;Sigma-Aldrich)。
2.7。免疫测定评价蛋白质
表达pAKT (Ser473)和总一种蛋白激酶在细胞溶解产物被PathScan验证夹心酶联免疫吸附试验(ELISA);细胞信号技术,贝弗利,妈,美国)。XIAP定量测定变化是由TiterZyme酶immunometric测定(环评;试验设计,安阿伯市,美国MI)。细胞裂解缓冲与蛋白酶抑制剂补充鸡尾酒(p - 8340;Sigma-Aldrich)。光密度测定使用维克多在450和570海里3板读者(PerkinElmer)。数据被表示为pAKT / AKT总额比率。XIAP表达蛋白质浓度是每10毫微克6可行的细胞。可行的细胞数量决定使用卡西计数器(罗氏应用科学,潘茨堡,德国)制造商的协议。
2.8。统计分析
差异实验方差分析和图基组评估因果测试使用SigmaStat 3.5软件(Systat软件公司,圣何塞、钙、美国)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
我们首先检查的时间效应IGF1 Apo2L / ESFT细胞杀伤力。作为显示在图1(一),孵化的vh - 64细胞与50 ng / mL IGF1导致渐进的保护从50 ng / mL Apo2L / TRAIL诱导细胞凋亡,与重大阻力观察24小时后IGF1加法。孵化的然而,随着时间的持续,IGF1造成明显放大Apo2L / TRAIL诱导细胞凋亡,开始48小时后IGF1加法。72小时后,IGF1引起凋亡细胞的比例增加三倍与未经处理的控制。IGF1为单一的代理没有vh - 64细胞中诱导细胞死亡,即使在细胞暴露与IGF1(图72小时1(一))。
(一)
(b)
(c)
除了细胞系vh - 64,另外ESFT细胞系也显示时间的双重监管Apo2L IGF1 /轨迹灵敏度。总结了结果数据1 (b)和1 (c)。而24小时IGF1治疗引起抑制Apo2L杀伤力(图/痕迹1 (b)),72小时的IGF1治疗引起放大Apo2L /杀伤力(图1 (c))ESFT细胞系A17/95 A9423, es 2, 35圈,MHH-ES-1,像vh - 64 - 68,这都是敏感Apo2L /跟踪[13]。相比之下,IGF1治疗24小时和72小时并不影响Apo2L /跟踪反应ESFT细胞系CADO-ES-1, SK-ES-l和RD-ES(数字1 (b)和1 (c)),这都是耐Apo2L /跟踪[13]。IGF1(仅100 ng / mL)引发了很少,如果有的话,细胞凋亡在ESFT细胞系研究(数据1 (b)和1 (c))。这些结果表明,根据治疗时间IGF1最初抑制细胞凋亡,随后促进Apo2L / TRAIL诱导细胞凋亡。
接下来,IGF1浓度响应实验研究。如图2(一个),IGF1范围在3 - 100 ng / mL诱导细胞凋亡抵抗Apo2L /跟踪与IC vh - 64细胞50~ 10 ng / mL IGF1期间24小时的潜伏期。当量浓度的IGF1 (3 - 100 ng / mL)和IC50(~ 10 ng / mL IGF1)放大Apo2L / TRAIL在72小时的潜伏期(图杀伤力2 (b))。IGF1R的单克隆抗体α-IR3范围100 - 1000 ng / mL也引起了两相的影响Apo2L / TRAIL-induced细胞凋亡导致抑制在24小时的潜伏期和放大在72小时的潜伏期(数字2(一个)和2 (b))。在每个孵化条件下,抗体是低效率10倍(IC50~ 100 ng / mLα比IGF1 -IR3)。使用时在高峰浓度,α少-IR3 ~ 2倍强大而IGF1。这一发现表明,IGF1R-binding网站类似的亲和力受体激动剂负责转导相反的生物反应。
(一)
(b)
得到进一步洞察IGF1的机制调节Apo2L /小道ESFT细胞杀伤力,我们调查是否caspase-like蛋白酶参与Apo2L / TRAIL-induced细胞凋亡。如图3(一个),caspase-3/7拮抗剂z-DEVD-fmk阻止Apo2L vh - 64细胞/小道杀伤力剂量依赖性的方式IGF1-treated和未经处理的细胞。
(一)
(b)
然后我们检查IGF1的影响在不同的半胱天冬酶级联的组件。激活caspase-8,外在和内在的细胞凋亡的关键上游中介,caspase-9,下游中介的内在细胞凋亡,caspase-3/7,外在和内在的细胞凋亡的关键效应还存在被发光分析监控。IGF1孵化vh - 64细胞的抑制激活caspase-8和caspase-3/7 Apo2L /小道后24小时,但增加他们的活动后48 - 72小时(图3 (b))。IGF1未能修改caspases-9 Apo2L /小道的激活。在整个潜伏期,IGF1本身并没有显着影响的半胱天冬酶活动vh - 64细胞。
我们接下来研究了IGF1能否调节特定的凋亡和proapoptotic蛋白质的表达可能在ESFT细胞调节Apo2L /跟踪信号。孵化IGF1的vh - 64细胞刺激XIAP表达变化的蛋白质(图12 - 24小时之内4(一))。然而,长期培养的细胞与IGF1透露,XIAP刺激只是瞬态抑制IGF1加法后48小时。Mitochondria-related proapoptotic伯灵顿出现在24 - 48小时和凋亡mcl1出现少比在时刻0在24 - 48小时。XIAP免疫测定评价变化确认IGF1展出两相的影响XIAP表达:12 - 24小时后IGF1孵化XIAP蛋白质含量增加,其次是减少基底以下水平(图48 - 72小时4 (b))。
(一)
(b)
AKT介导的生存ESFT IGF1(引起的细胞7]。此外,丹et al。17)报道,XIAP AKT的直接目标。我们首先研究了IGF1 AKT活动的影响。如图5(一个)孵化的vh - 64细胞,IGF1导致磷酸化pAKT在6小时。然而,连续培养的细胞与IGF1导致逐步抑制AKT活动,展示的hypophosphorylation pAKT 48小时。pAKT / AKT总比率分析还揭示了一种蛋白激酶活性的双重监管IGF1: 6小时后IGF1添加比例增加,其次是其降低基底以下值(图48 - 72小时5 (b))。与500 nM渥曼青霉素治疗的细胞,一个特定的PI3K抑制剂,减少了基底pAKT / AKT总比率来,这是与细胞的比例获得孵化后72小时独自IGF1 (50 ng / mL)(例如,)。此外,渥曼青霉素完全阻止pAKT / AKT总比率的增加的细胞治疗后IGF1长达24小时(数据没有显示)。
(一)
(b)
(c)
(d)
然后我们检查是否一种蛋白激酶活性的抑制渥曼青霉素可能会改变在ESFT Apo2L / TRAIL诱导细胞凋亡细胞。vh - 64细胞的治疗与渥曼青霉素浓度的方式增强Apo2L / TRAIL-induced细胞凋亡。敏化Apo2L /小道在未经处理的细胞更有效,而细胞治疗IGF1(图24小时5 (c))。
评估的重要性AKT活动由IGF1 XIAP表达诱导,我们测量XIAP vh - 64细胞中蛋白质含量接受渥曼青霉素和特定的AKTi-1/2 AKT抑制剂。如图5 (d)渥曼青霉素(500 nM)和AKTi-1/2 (2μ米)本构XIAP水平降低XIAP和部分抑制刺激变化引起IGF1后24小时。
整体而言,这些结果表明,激活PI3K-AKT XIAP表达增加有关和Apo2L /电阻在vh - 64细胞急性IGF1刺激的反应。
鞘脂类分子神经酰胺(Cer)一直在与proapoptotic信号响应IGF1 (25]。此外,Cer的形成与抑制一种蛋白激酶信号XIAP的差别,对这些基因的蛋白表达(26,27]。评估的重要性Cer代Apo2L /小道敏感,XIAP抑制和引起的一种蛋白激酶抑制慢性IGF1刺激,我们第一次测量细胞内的Cer vh - 64细胞接受IGF1水平。几个Cer的物种被发现,尤其是C16: 0,使用C18: 0 -, C22: 0 - C24: 0 - C24: 1 - c C16: 0-Cer是最丰富的化合物由HPLC-ESI-MS /女士(数据6(一)和6 (b))。Cer的水平被IGF1在24小时内没有改变。然而,细胞治疗与IGF1 48 - 72小时导致1.5 - 2倍增加Cer的形成。细胞内Cer的形成来源于两个主要途径:在神经酰胺合成酶(Cer)依赖Cer新创通路和CerS-dependent Cer救助途径(28]。描绘的途径是利用IGF1增加Cer的一代,我们测量的表达sphinganine,新创的前体Cer通路,鞘氨醇,Cer救助途径的前兆。作为显示在图6 (c),添加特定的cer抑制剂fumonisin B1 (FB1)在治疗IGF1导致sphinganine但不是鞘氨醇的积累。此外,细胞治疗与FB1完全封锁了刺激IGF1(图的Cer的形成6 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
然后我们调查了使用FB1功能后果IGF1的Cer的一代。如图7(一)添加FB1抑制Apo2L /小道杀伤力IGF1-treated但不是未经处理的细胞。评估是否Cer形成放大Apo2L / TRAIL-induced XIAP通过抑制细胞凋亡变化水平,我们调查的影响FB1 XIAP表达长期IGF1-stimulated细胞。作为显示在图7 (b)XIAP FB1逆转,镇压变化蛋白质浓度的方式IGF1-treated但不是未经处理的细胞。在这些条件下,FB1没有调节后IGF1引起的一种蛋白激酶活性的抑制72小时(图7 (c))。
(一)
(b)
(c)
整体而言,这些结果表明,Cer形成通过从头合成介导XIAP抑制和Apo2L /放大在应对慢性IGF1 vh - 64细胞的刺激。
ESFT细胞的研究表明短期IGF1治疗(≤24小时)提供了耐阿霉素(阿霉素)和依托泊苷(VP16) [6,7),这证实了我们(数据未显示)。然后,我们评估了chemotoxicity慢性IGF1的治疗效果。如数据所示8(一个)和8 (b)、曝光的vh - 64细胞IGF1 (100 ng / mL) 72小时诱导抗阿霉素(1 - 10μ米)和VP16 (10 - 100μ米)。评估化疗所致毒性的模式显示,z-DEVD-fmk和pan-caspase拮抗剂z-VAD-fmk并没有阻止阿霉素和VP16-induced细胞死亡(图8 (c))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
在这项研究中,我们调查了IGF1的作用在调节ESFT的响应性细胞Apo2L / TRAIL诱导细胞凋亡。我们的调查显示,时间是一个重要的因素在决定是否IGF1可能作为生存因素或proapoptotic因素的背景下,Apo2L / TRAIL-induced细胞凋亡。结果表明,慢性IGF1刺激增强Apo2L /跟踪响应Apo2L / TRAIL-sensitive但不耐ESFT细胞系,表明IGF1行为通过促进Apo2L /轨迹灵敏度而非换向Apo2L小道阻力本身。
目前的研究涉及到的另一个有趣的方面α-IR3。这个IGF1R抗体被用来定义IGF1的特异性和IGF2绑定在ESFT IGF1R细胞体外(3]。α-IR3也被用来影响ESFT细胞的生长在体外和体内4,29日,30.]。长期的抑制细胞增殖α-IR3治疗已经建议由于封锁IGF1R激活的生长因子产生的细胞自分泌的方式。在我们的实验中,α-IR3表现部分激动剂,模仿IGF1的反和proapoptotic效果Apo2L /小道杀伤力vh - 64细胞。据报道,这些细胞会释放少量的IGF1 (~ 1 - 3 ng / 106细胞)serum-depleted文化传媒(23]。此外,使用的条件下,α-IR3并不影响vh - 64细胞的生长(未公开的数据)。有关α-IR3与受体激动剂的特点,一些研究已经表明,在正常和恶性细胞α-IR3可以刺激多种生物事件包括磷酸化/ / IGF1R的内化,差别激活和对这些血管内皮生长因子的释放,IGFBPs合成,细胞增殖,凋亡的保护,和诱导细胞凋亡25,31日- - - - - -35]。
我们的研究结果与先前的账户康科德PI3K-AKT-dependent防止死亡的诱导刺激ESFT细胞(7,36]。我们已经表明,抑制PI3K-AKT渥曼青霉素和AKTi-1/2导致敏化Apo2L /小道,这表明PI3 K-AKT信号防止Apo2L /跟踪有效诱导细胞凋亡。我们证明了渥曼青霉素和AKTi-1/2减少XIAP蛋白表达。然而,渥曼青霉素和AKTi-1/2没有完全防止IGF1 XIAP刺激变化,这意味着另类生存信号通路也参与了XIAP刺激变化IGF1的蛋白表达。我们已经表明,孵化渥曼青霉素24小时不影响vh - 64细胞生存能力,表明一种蛋白激酶失活本身不诱导细胞凋亡。因此,研究结果表明,增加XIAP PI3K-AKT蛋白表达的是一种机制Apo2L /电阻在ESFT细胞应对短期IGF1刺激。
我们表明,长期IGF1治疗引起的失活AKT XIAP和抑制变化vh - 64细胞中蛋白质含量。同时,相同的治疗结果新创Cer的形成,这与相关Apo2L /轨迹灵敏度的进展。尽管我们已经表明,AKT激活与XIAP upregulation早期IGF1刺激,一种蛋白激酶的抑制由IGF1差别并不完全占XIAP对这些在后期。我们发现de novo-generated Cer介导XIAP镇压变化水平AKT的下游。的机制Cer ESFT XIAP的差别可能导致对这些细胞目前未知。研究b细胞淋巴瘤细胞受体(BcR)激活显示新创Cer XIAP形成诱导降解变化proteasome-dependent的方式(27]。同时,AKT的失活机制应对慢性IGF1刺激尚不清楚。研究表明,慢性IGF1刺激哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)结果的反馈抑制PI3K-AKT通过磷酸化和随后的蛋白酶体降解胰岛素受体底物2 (IRS2) [37]。
除了一种蛋白激酶活性和XIAP蛋白表达,caspase-8 caspase-3/7活动也IGF1的双重调控。相比之下,激活caspase-9 Apo2L /记录并不是影响尽管慢性IGF1刺激减少了伯灵顿和增加mcl1表达式。在一起,这些结果表明,IGF1 Apo2L /轨迹灵敏度的两相的效果在很大程度上依赖于调制的外在而非内在细胞凋亡的途径。
证据表明,de novo-generated Cer本身可以触发细胞死亡,还存在(例如,通过刺激38]。在这项研究中,新创Cer形成的细胞治疗72小时后IGF1并未导致细胞凋亡。这个观察与Cer-species新创积累在其他系统以应对各种细胞外因素。例如,形成新创C16 -和/或C24-Cer淋巴瘤细胞发生凋亡,以应对BcR触发(27),在前列腺癌的细胞雄激素剥夺和MDA-7 / IL-24刺激[39,40),血清中性粒细胞的损耗(41]。另外,除了其生物效应作为胞内第二信使,Cer也可能生物物理效应通过膜的稳定脂质筏影响受体的定位和它们的功能(42]。相对于这种可能性,这是感兴趣的,提出了膜脂质筏隔离proapoptotic从凋亡IGFR1信号通路43]。此外,新出现的证据表明,再分配Apo2L /小道死亡受体脂质筏构成最优的重要监管事件激活凋亡的死亡程序(44]。显然,Apo2L / TRAIL-induced凋亡的IGF1-mediated监管机制是复杂的。然而,合理的建议Cer-XIAP信号构成Apo2L /跟踪的关键通路敏化ESFT细胞反应慢性IGF1刺激。
IGF1的proapoptotic能力的环境中死亡ligand-induced对ESFT细胞凋亡并不是唯一的。IGF1报道放大Fas antibody-induced人类成骨细胞凋亡,促进肿瘤坏死因子α全身的细胞凋亡在小鼠成肌细胞和preadipocytes,和增强Apo2L / TRAIL-induced人类结肠癌细胞凋亡(43,45- - - - - -47]。
我们已经表明,Apo2L / TRAIL-insensitive vh - 64细胞后转换为敏感慢性IGF1刺激,而他们对阿霉素的敏感性和VP16是永久性地削弱了。后者事件发生尽管AKT的失活。至于耐阿霉素和VP16而言,早期的AKT激活IGF1可能无法挽回的地步。然而,选择生存信号通路激活IGF1不妨促进抵抗化疗,所讨论的Toretsky et al。7]。通过使用细胞转染AKT-MYR,这些作者表明,持续激活AKT只是部分占在ESFT chemotoxicity细胞的抑制。
此外,我们表明,阿霉素- VP16-induced细胞死亡并不是阻止细胞凋亡蛋白酶抑制剂浓度(20μ米),预防Apo2L / TRAIL-induced细胞凋亡。这个结果意味着阿霉素的主要模式——VP16-mediated vh - 64细胞中细胞死亡至少是半胱天冬酶独立的。我们发现对比研究z-DEVD-fmk和z-VAD-fmk被证明阻止ESFT毒性VP16诱导的细胞(48]。应该注意的是,这些作者采用半胱天冬酶抑制剂浓度(100μ米),可以抑制noncaspase蛋白酶特异性的方式(49]。显然从我们的发现,除了它在药物抗性中的作用,IGF1可以绕过这个阻力,使敏感ESFT细胞选择性凋亡引发Apo2L /跟踪。
我们的研究结果的生理意义尚未显示。越来越多的证据指向明显的监管职责IGF1的先天免疫系统(50]。lymphohematopoietic因素,IGF1报道刺激淋巴细胞增殖和生存,加速cytokine-stimulated NK细胞活性,并支持monocyte-derived树突状细胞成熟(51- - - - - -53]。最近的研究表明,淋巴细胞复苏是一个独立的预后指标高风险ESFT [54]和ESFT细胞是高度敏感的杀戮树突细胞自体和同种异体NK细胞在体外和体内55,56]。因此,IGF1的结合的可能性和Apo2L /长期跟踪不仅可以直接促进ESFT细胞死亡,但也可能促进anti-ESFT免疫反应的诱导体内值得考虑。
最近,兴趣都集中在使用IGF1R ESFT抗体作为潜在的治疗患者(57]。更加与众不同等。58]报道从I / II期临床试验的初步结果评估的有效性人性化IGF1R抗体作为单药,治疗的106例先进ESFT导致温和的总体响应率为14.2%,平均生存8.9个月。考虑我们的结果说明了细胞凋亡的敏化效果α-IR3在long-term-treated ESFT细胞体外,人们很容易推测IGF1R抗体疗法的临床益处可能扩展到更多的病人时结合Apo2L / TRAIL-based方案。
5。结论
尽管改进过去二十年ESFT的治疗,复发或转移性疾病患者的生存寿命仍低。是公认的IGF1 ESFT细胞生存和药物抗性有关。然而,目前矛盾的研究表明慢性IGF1刺激可以绕过药物抗性和支持细胞死亡结合Apo2L /跟踪。因此本研究提供了新颖的见解的动态角色IGF1-IGF1R系统在调节ESFT细胞的命运。我们的发现表明IGF1R抗体显示IGF1-mimitic行为可能具有重要意义的设计Apo2L / TRAIL-based疗法治疗难治性ESFT。
利益冲突
作者认为他们没有利益冲突。
确认
这项工作是由欧洲共同体的第六框架计划具体的有针对性的研究项目PROTHETS (503036) f·范·瓦伦和BMBF (TranSaRNet 01 gm0869) m . Hotfilder美国德克森和h .更加与众不同。f·范·瓦伦希望Drs表达他个人的感激之情。j·g . Grandjean心胸外科手术和f·h·a·f·德曼医疗特文特频谱,心内科恩斯赫德,荷兰,救命的手术。