封锁Erythropoietin-Producing人类肝细胞癌的受体在脊髓背角B1减轻大鼠内脏痛

文摘

客观的。这个实验是为了确定erythropoietin-producing人类肝细胞癌(以弗所书)受体参与内脏疼痛的发展。方法。成年男性Sprague-Dawley老鼠被随机分为三组接受不同的治疗(n每组)= 16:intracolonic车辆(对照组)、intracolonic 2, 4, 6-trinitrobenzene磺酸(TNBS) (TNBS组),和intracolonic TNBS和鞘内EphB1受体阻断剂(TNBS + EphB2-Fc集团)。内脏痛觉过敏和量化评估的结直肠扩张引起的内脏痛阈。脊髓的表情EphB1 ephrinB2和水平的磷酸化形式(p-EphB1和p-ephrinB2)评估免疫印迹和免疫组织化学。结果。TNBS-treated老鼠开发重要的内脏痛觉过敏。EphB1脊髓表达式,p-EphB1、ephrinB2和p-ephrinB2显著增加TNBS组与对照组相比,但内脏痛觉过敏和脊髓EphB1高程和p-EphB1表情显然是减轻鞘内政府的EphB2-Fc TNBS + EphB2-Fc组。EphB1——和p-EphB1-immunopositive细胞的数量,平均光学(AO) EphB1的价值,及其磷酸化形式在脊髓背角显著增加TNBS组比对照组,但他们显然EphB2-Fc减少囊内的管理。ephrinB2数量没有显著差异,p-ephrinB2-immunopositive细胞和AO ephrinB2价值及其磷酸化形式TNBS和TNBS + EphB2-Fc组。结论。EphB1受体在脊髓背角发挥关键作用的内脏疼痛和可能被视为一个潜在的目标治疗内脏痛。

1。介绍

腹痛是一个主要的和麻烦的胃肠道疾病的特征,如胃肠道肿瘤、炎症性肠病、肠易激综合症。内脏痛觉过敏,这指的是内脏痛阈降低机械膨胀,被认为是一个关键的球员腹痛的发展(1- - - - - -3]。增加的分子机制的研究试图揭示内脏痛觉过敏(4- - - - - -8),但这个问题仍不完全清楚。

Erythropoietin-producing人类肝细胞癌(以弗所书)受体,包括类型(A1-A10)和B (B1-B6)是最大的跨膜受体酪氨酸激酶亚科(rtk)。已经表明,弗受体及其配体Eph-receptor相互作用蛋白质(ephrin)发挥重要作用在神经系统的发展,如调节轴突指导(9,10]。目前,它已经知道ephrin配体有两种类型:glycosylphosphatidylinositol (GPI)固定型(ephrinA1-A10)和跨膜型(ephrinB1-B3)。最近,越来越多的证据表明,ephrinB / EphB信号通路是一个至关重要的球员发展的各种慢性疼痛,包括炎性疼痛、神经性疼痛、骨癌疼痛,和viscerovisceral牵涉性痛(11- - - - - -20.]。这一信号通路不仅可以调节突触的功能(21- - - - - -26),但也调节慢性疼痛与n -甲基- d交互(NMDA)受体(20.,26- - - - - -28)以及其他目标(29日- - - - - -31日]。然而,这个信号通路的重要性主要是确定发展的躯体疼痛。到目前为止,只有少数的研究集中在ephrinB2 / EphB1信号通路参与内脏疼痛的发病机制(32,33]。例如,以前的工作使用pelvic-urethra-related疼痛模型发现ephrinB2强pelvic-urethra反射由于磷酸化EphB1和/或通过Src激酶2 (32]。最近,另一项研究使用ephrinB2基因敲除动物证明ephrinB2和EphB1在2中,扮演重要角色的4,6-trinitrobenzene磺酸- (TNBS)诱导慢性(postinflammatory)内脏疼痛,但只有ephrinB2参与应激内脏疼痛的发展(33]。最重要的是,目前尚不清楚政府是否特定的受体阻滞剂打断的磷酸化EphB1 ephrinB2会减弱和/或表达发自内心的痛苦。因此,这个实验的目的是评估脊髓的表情EphB1 ephrinB2和磷酸化水平在鼠模型引起的内脏疼痛intracolonic注入TNBS并确定使用EphB1受体阻断剂的影响发展的内脏疼痛和脊髓EphB1受体的表达。

2。数据和方法

2.1。动物

实验协议批准后动物保健和使用委员会首都医科大学宣武医院,成年男性Sprague-Dawley (SD)老鼠,年龄在8 - 10周,体重150 - 250克,被用于实验。此外,所有动物实验的动物实验中心宣武医院。动物们被安置在塑料笼子里柔软的床上用品在室温和12:每天12小时的光暗周期。他们免费获得食物和水和适应水土3天前的实验。通过使用一个随机数字表,老鼠被分成三个组接受不同的治疗(n每组)= 16:intracolonic车辆(对照组)、intracolonic TNBS (TNBS组),和intracolonic TNBS和鞘内EphB1受体阻断剂(TNBS + EphB2-Fc集团)。

2.2。结肠痛觉过敏模型的建立

在这个实验中,结肠痛觉过敏模型建立了注入TNBS (Sigma-Aldrich,密苏里州,美国),如前所述[34,35]。短暂,老鼠和2%异氟烷麻醉和系在仰卧位。聚乙烯导管直径(1.2毫米)插入到结肠,与远端提示6厘米远没有肛门。100年的TNBS解决方案μl在25%乙醇(14 - 16毫克/毫升)是通过导管注入结肠TNBS和TNBS + EphB2-Fc团体,100年和汽车解决方案μl包括只有25%乙醇注射的对照组。然后,老鼠身体的下半部分是高架,持续30秒。

2.3。结肠损伤的组织学评估

结肠损伤的程度之前评估管理TNBS(基线),1天TNBS管理局(炎症阶段)和15天后TNBS管理局(postinflammatory阶段)。四个动物安乐死在每个时间点和2%异氟烷麻醉。1厘米远端结肠切除,与生理盐水冲洗,4%福尔马林固定,嵌在石蜡中。的部分全层结肠癌样本(8μ米厚)与苏木精染色(徕卡生物系统)和伊红(徕卡生物系统)和显微镜下观察。结肠损伤的水平得分根据先前描述的标准文献[36,37粘膜架构损失(0 - 3);杯状细胞耗竭(0,缺席;1、现在);隐窝脓肿(0,缺席;1、现在);细胞浸润(0 - 3);膜和肌层增厚(0 - 3)。

2.4。EphB2-Fc准备和鞘内注射

这个实验用老鼠重组嵌合体EphB2-Fc(美国MN Bio-Techne)作为EphB1受体阻断剂,在以前的研究报道大鼠(17,18,24]。通过结合内生ephrinB, EphB2-Fc可以导致EphB1替换和裂解,然后导致EphB1的下游信号的封锁。EphB2-Fc嵌合体制备当天鞘内注射(100μ在无菌PBS g / ml)。14日、15和16天后intracolonic注入TNBS或车辆,老鼠和2%异氟烷麻醉,进行腰椎穿刺在L4-5椎间空间。当成功的鞘内穿刺证实了一个典型的tail-flick EphB2-Fc 5μl在TNBS + EphB2-Fc组和车辆管理(无菌PBS) 5μl其他组,每天一次连续三天。

2.5。行为测试

在每一个动物,结直肠扩张(CRD)进行了17天后intracolonic注入TNBS或车辆,如前所述[4,33,38]。简而言之,一个乳胶double-lumen导管连接到一个气球扩张器直径5毫米。润滑扩张器是轻轻插入降结肠直到其远端提示从肛门6厘米。然后,CRD被注入增加维护空气(0.1 - -5.0毫升)。老鼠被放置在一个小璐彩特小隔间中,他们不停地醒来,习惯在CRD前30分钟。

腹部撤军反射(心田)反应,称为突然和持续的腹部肌肉收缩腹部升空平台,被观察者评价忽视组分配。注入空气的体积,引起一个可见的心田是用来量化内脏痛阈。对于每个老鼠,行为测试了三次的间隔5分钟。三个测量的平均价值作为内脏痛阈。

2.6。西方墨点法

行为测试后,动物安乐死以2%异氟烷麻醉,然后在腰骶脊髓水平(L6-S1)新鲜提取并存储在液氮中。ephrinB2量化EphB1的表达水平,及其磷酸化形式(p-EphB1和p-ephrinB2)在免疫印迹的脊髓,脊髓样本均质在冰冷的(4°C)包含50 mM Tris-HCl裂解缓冲,150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 0.5%脱氧胆酸盐,0.1% SDS, 0.2毫米EDTA,氟化钠10毫米,10μg / ml抑肽酶,1μ10 g / ml亮抑酶肽,μg / ml抑肽素,4 - 0.4毫米(2-amino-ethyl) -benzenesulfonyl氟化物和1毫米原钒酸钠(pH值7.5)。接下来,降水过程进行匀浆。蛋白质浓度进行了分析使用BCA蛋白质分析工具包(美国马皮尔斯生物技术)。这些蛋白质与8%或10% sds - page分离,然后转移到硝化纤维膜。

蛋白质含量检测到抗体包括anti-EphB1(圣克鲁斯技术、钙、美国),anti-phosphorylated EphB1(圣诞老人),anti-ephrinB2 (bios生物、马、美国),和anti-phosphorylated ephrinB2 (bios)抗体。膜被5%的牛奶Tris-buffered生理盐水1 h,孵化与anti-phosphorylated EphB1(1: 1000)和anti-phosphorylated ephrinB2(1: 1000)抗体,然后用辣根孵化peroxidase-conjugated二级抗体。乐队是由增强化学发光试剂处理(微孔、马、美国)。相同的膜被剥夺和处理主要抗体EphB1(1: 1000)和ephrinB2 (1: 1000)。

电影数字化,光密度定量免疫反应性的乐队是由使用图像J1.51软件(西班牙巴塞罗那Softonic国际)。一个特定的蛋白质的表达的规范化β微管蛋白。

2.7。免疫组织化学

腰骶脊髓样本在4%福尔马林固定石蜡和嵌入。部分8μ米厚被孵化的兔多克隆抗体anti-EphB1(1: 200年,圣诞老人),anti-ephrinB2(1: 200年,圣诞老人),anti-phosphorylated EphB1(1: 200年,圣诞老人),和anti-phosphorylated ephrinB2(1: 200年,圣诞老人)。anti-rabbit IgG抗体(1:200年,σ)是用来孵化组织部分。组织的幻灯片后孵化与ABC试剂(1:200年,热费希尔科学),他们紧张diaminobenzidine解决方案1 - 2分钟,然后冲洗蒸馏H₂O₂。接下来,组织幻灯片与苏木精紧张解决方案1到2分钟,然后冲洗在蒸馏H₂O₂一次。正常山羊血清作为消极背景控制。最后,EphB1和ephrinB2 immunopositive脊髓背角细胞数和集成光密度值是衡量IPP 6.0软件(媒体控制论)。平均光(AO)值的计算是通过集成光密度的比值/区域的组织。

2.8。统计分析

所有数据都表示为均值的平均值±标准误差(SEM)。脊髓的差异表达水平的检测蛋白质和内脏疼痛的阈值组间分析使用单向方差分析(方差分析)与SPSS软件(版本20.0,国际商业机器公司,纽约,美国)。一个P小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。结肠损伤

如图1结肠损伤的微观分数明显增加后1天TNBS与基线。然而,微观结肠损伤的生活质量得分显著降低后15天TNBS与TNBS管理后1天。此外,没有差别在结肠损伤的微观分数之间的基线,TNBS管理后15天。

3.2。行为测试

如图2,内脏痛阈显著降低TNBS组与对照组相比。鞘内管理EphB2-Fc明显减毒TNBS-induced内脏痛觉过敏。

3.3。脊髓的表情EhpB1 ephrinB2, p-EphB1, p-ephrinB2

与对照组相比,脊髓EphB1表达水平和p-EphB1 TNBS组明显升高,而这些表达评估明显减少了鞘内管理EphB2-Fc TNBS + EphB2-Fc组(图3(一个))。

与对照组相比,脊髓ephrinB2的表达水平显著增加TNBS组的显著upregulation p-ephrinB2表达式。然而,鞘内管理EphB2-Fc未能抑制两种蛋白质的表达TNBS-induced upregulation(图3 (b))。

3.4。免疫组织化学分析EhpB1, ephrinB2 p-EphB1,脊髓背角p-ephrinB2

当山羊血清代替第一抗体-背景控制,没有注意到(图immunopositive细胞4(一))。代表的免疫组织化学染色图像EphB1、ephrinB2及其磷酸化形式分布在脊髓背角图所示4 (b)。这些蛋白的表达水平明显增加TNBS组与对照组相比。EphB1的表达水平和p-EphB1 TNBS + EphB2-Fc组明显减少TNBS组相比,但表达水平ephrinB2和p-ephrinB2 TNBS没有差异和TNBS + EphB2-Fc组。

EphB1——的数量和脊髓背角p-EphB1-immunopositive细胞显著增加TNBS组与对照组相比,但是他们显然减少了鞘内EphB2-Fc管理。ephrinB2——p-ephrinB2-immunopositive细胞的数量显著增加TNBS组与对照组相比。没有显著差异的数量ephrinB2——TNBS之间和p-ephrinB2-immunopositive细胞和TNBS + EphB2-Fc组(图5)。

EphB1的AO值、ephrinB2和脊髓背角的磷酸化形式如图所示6。与对照组相比,AO EphB1值和p-EphB1 TNBS组明显升高。鞘内管理EphB2-Fc显著抑制TNBS-induced增加AO EphB1和p-EphB1的价值观。ephrinB2 AO值和p-ephrinB2 TNBS组明显高于对照组,但他们不是EphB2-Fc减少囊内的管理。

4所示。讨论

本试验旨在评估EphB1受体封锁的影响发展的内脏痛觉过敏和脊髓表情EphB1和ephrinB2 TNBS引起的内脏痛大鼠模型。与我们的研究结果表明,EphB1受体封锁EphB2-Fc可以显著减轻内脏痛觉过敏,降低脊髓EphB1的表情。

越来越多的证据表明,ephrinB / EphB信号是一个关键的球员发展的体细胞和神经性疼痛。EphB1的表达是调节热痛觉过敏和痛觉的行为和/或机械触诱发痛应用引起的皮肤炎症(27),周围神经损伤(11,14,16,24),或癌细胞接种(17,18,39]。由慢性收缩所引起的神经性疼痛模型神经损伤(12- - - - - -14)和/或局部神经结扎(13),然而,这些疼痛的行为可以通过中断来减轻EphB1信号通路EphB1小干扰RNA (14)或基因敲除技术12,13]。此外,封锁EphB1受体已被证实能产生一个说减轻这些疼痛的行为在啮齿动物诱发慢性收缩神经损伤(12,24,29日,30.),肿瘤细胞植入(18,39),或皮下remifentanil输液27,31日]。通过使用一个内脏痛觉过敏引起的模型intracolonic TNBS,这个实验表明,鞘内管理EphB1受体阻断剂显著减轻脊髓EphB1差别内脏痛觉过敏,对这些基因的表达。这是符合最近的一项研究的结果(33),引起的内脏痛觉过敏intracolonic TNBS在野生型小鼠并没有发生在ephrinB2基因敲除小鼠。

我们的研究结果也表明,intracolonic TNBS-provoked内脏痛觉过敏,与一个重要upregulation脊髓p-EphB1表达式。EphB1受体阻断剂不仅减轻脊髓EphB1 upregulation表达式,也减少了在大鼠脊髓p-EphB1水平TNBS-induced内脏疼痛。这表明EphB1受体磷酸化可能发挥重要作用的发展postinflammatory内脏痛觉过敏。即使先前的研究表明,EphB1受体激动剂可以引起大鼠的瞬态热痛觉过敏(18,24,28,29日),以增加磷酸化水平NR2B (NMDA受体亚基)在脊髓18,28),逆转通过预处理Src-family激酶抑制剂(28]。这种瞬态热痛觉过敏并不总EphB1 upregulation相关,但依赖EphB1的激活,显示的upregulation磷酸化NR1 (NMDA受体亚基)和NR2B的(18]。此外,预处理与NMDA受体拮抗剂可以消除热痛觉过敏和机械触诱发痛大鼠接受一个鞘内管理EphB1受体激动剂(ephrinB1-Fc) [27]。同样,击倒ERK5抑制激活cAMP-responsive元件结合蛋白(分子)和缓解热痛觉过敏和机械触诱发痛引起鞘内政府EphB1受体激动剂(ephrinB2-Fc) [29日]。这些发现,先前的研究表明NMDA受体,Src-family激酶,和ERK /分子可能是潜在的EphB1受体下游信号传感器,和EphB1受体之间的相互作用及其下游信号传感器的发展可能是至关重要的痛觉过敏和鞘内引起的异常性疼痛管理EphB1受体激动剂。本实验的结果类似于松弛从先前的研究结果和他的同事们(28),预处理与EphB1受体阻断剂减毒热痛觉过敏和机械触诱发痛和抑制磷酸化NR2B表达的upregulation intraplantar注射角叉菜胶引起的炎性疼痛模型。此外,彭和他的同事们(20.)报道,与Src抑制剂预处理可以反向Src和NR2B受体磷酸化和减轻尿道反射敏感芥末原油带来的大鼠急性结肠炎。描述的结果也与之前的一项研究中预处理使用NMDA受体拮抗剂的老鼠接受鞘内ephrinB2管理局(32]。EphB受体阻断剂的预处理不仅可以产生这些影响通过预处理和Src抑制剂或NMDA受体拮抗剂也扭转EphB1/2[的磷酸化20.,32]。此外,预处理与NMDA受体拮抗剂已被证实能消除热痛觉过敏和机械触诱发痛大鼠接受intraplantar注入remifentanil [27]。这些以前的研究结果表明,NMDA受体和Src-family激酶可能EphB1受体下游信号传感器,通过EphB1受体调节炎性疼痛和viscerovisceral称为疼痛。

如克莱因所述40],ephrin-Eph系统功能双向的方式,可以向ephrin-expressing细胞,引发反向信号转发信号到Eph-expressing细胞,或双向信号到细胞;即弗可以作为配体和受体ephrin配体也可以发挥受体作用。然而,这个实验表明,EphB1阻断剂未能减少脊柱的upregulation ephrinB2 TNBS-treated老鼠和p-ephrinB2表情。这表明EphB1阻断剂可能通过抑制扮演前锋角色激活下游相关的受体激酶。先前的研究在骨癌痛模型和CCI-induced神经性疼痛模型表明,EphB1受体拮抗剂缓解痛觉过敏和异常性疼痛NR1表达下调磷酸化,NR2B, Src, ERK MK2型,或减少分子激活ERK5 /分子在脊髓18,29日]。因此,类似的信号机制也可能归因于postinflammatory TNBS引起的内脏痛觉过敏在这个实验。事实上,EphB1受体在脊髓已确定,定位在神经元11,16- - - - - -18[]、星形胶质细胞和小胶质细胞17]。因此,详细的脊髓EphB1受体磷酸化作用在内脏疼痛权证未来研究的发展。

作为疼痛信号中继站,脊髓背角有许多信号传感器涉及疼痛。在骨癌痛模型中诱导肿瘤细胞植入(17,39)和慢性收缩引起的神经性疼痛模型神经损伤(11]或挤压脊髓神经损伤(16),免疫染色和/或免疫荧光评估显示,EphB1受体主要分布在脊髓背角。在大鼠肿瘤细胞implantation-evoked骨癌疼痛的免疫印迹(39),此外,ephrinB2配体已经观察到主要位于脊髓背角。在这个实验中,因此,EphB1的数字,ephrinB2, p-EphB1, p-ephrinB2 immunopositive背角细胞,通过免疫组织化学方法评估AO价值进一步确定脊髓背角的表情的变化。类似于我们的免疫印迹结果,鞘内管理EphB1受体阻断剂显著减毒内脏痛觉过敏,用EphB1和p-EphB1差别明显对这些表达式在脊髓背角TNBS-treated老鼠。然而,鞘内EphB1阻塞管理试剂未能减少upregulation ephrinB2和p-ephrinB2表情在脊髓背角TNBS-treated老鼠。这些结果进一步支持EphB1受体在脊髓背角发挥关键作用的发展TNBS-induced内脏疼痛。

必须指出,在这个实验的设计有一些局限性。首先,鞘内政府EphB1受体阻断剂显示无法改变感知疼痛正常大鼠(18),一群动物接收EphB1受体阻断剂14日,15日和16天后intracolonic车辆不包括在内。第二,行为测试之前执行初始干预,这是无法干预前后比较内脏疼痛阈值。第三,这个实验主要是集中在ephrinB2-EphB1信号通路的作用发展的内脏疼痛。它不能提供任何线索相关的下游信号通路的可能贡献的发展内脏痛觉过敏。因此,仍然需要进一步的实验来解决这些问题。

总之,这个实验表明,脊髓的封锁EphB1受体能够减轻脊柱的内脏痛觉过敏和减少upregulation EphB1 TNBS-provoked内脏痛大鼠模型中的表达。它表明脊髓EphB1受体发挥着至关重要的作用在内脏疼痛和可能发展的一种很有前途的内脏疼痛治疗的目标。

缩写

弗:	Erythropoietin-producing人类肝细胞癌
rtk:	受体酪氨酸激酶
EPHRIN:	Eph-receptor相互作用的蛋白质
谷歌价格指数:	Glycosylphosphatidylinositol
门冬氨酸:	n -甲基-
TNBS:	2、4、6-Trinitrobenzene磺酸
SD:	Sprague-Dawley
他:	Hematoxylin-eosin
CRD:	结直肠扩张
的心田。	腹部撤军反射
AO:	平均光
扫描电镜:	平均数标准误差
方差分析:	方差分析
分子:	营反应元件结合蛋白。

数据可用性

上可用的数据请求。

信息披露

福山雪和Jia-Xiang倪是通讯作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

陈莉太阳大大导致了实验的设计和实现,数据收集、分析、解释和起草了手稿。福山雪和Jia-Xiang倪同样导致了实验的概念和设计和基金收购,帮助起草手稿和批判修正它。单音词,侬中朝唐,他和李Xiu-Liang充分参与实验的实现,数据采集和解释。所有作者都阅读和批准最后的手稿。

确认

本研究支持的基础和临床研究合作首都医科大学(没有的基础。303-01-007-0169)和北京市医院管理局青年项目(没有。008 - 0113)。

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