谷胱甘肽对机械触诱发痛和中枢敏感化的影响在慢性缺血后大鼠疼痛

文摘

背景。慢性postischemia疼痛(CPIP)模型是一个使用缺血/再灌注损伤动物模型,模拟复杂区域疼痛综合征的症状类型i .谷胱甘肽(GSH)防止缺血/再灌注损伤,清除自由基。我们进行了本研究探讨谷胱甘肽的保护作用CPIP老鼠通过改变机械触诱发痛和n -甲基- d受体亚基GluN1 phospholyration。方法。我们将45老鼠分成5组:骗局,CPIP, CPIP +谷胱甘肽100毫克/公斤,CPIP +谷胱甘肽200毫克/公斤,CPIP +谷胱甘肽500毫克/公斤。老鼠在假针灸和CPIP组织生理盐水和老鼠在指定其他组收到了谷胱甘肽剂量再灌注前三十分钟。退出阈值进行评估之前sugery 1、3,手术后7天。pGluN1在脊髓水平也是衡量。结果。谷胱甘肽治疗大鼠表现出显著增加的撤军阈值后爪与CPIP组剂量依赖性。pGluN1的表达在谷胱甘肽治疗大鼠显著降低相比CPIP组(所有P< 0.05)。结论。这些发现表明,谷胱甘肽抑制机械触诱发痛和中枢敏感化的发展CPIP老鼠。

1。介绍

我复杂区域疼痛综合征类型(crp)是一种毁灭性的疾病,通常影响肢体和不伴有临床可核查的神经损伤(1]。crp我一般发展扭伤后,关节镜手术,过于严格的铸件,水肿的软组织损伤。许多不同的作用机制发展的crp我一直建议。这些包括炎症过程,集中中转的交感神经刺激,中央敏感的疼痛,一种自身免疫性的过程,神经源性炎症、缺血再灌注损伤(2]。

慢性postischemia疼痛(CPIP)是一种动物模型,模拟crp的症状我3]。在这个模型中,后爪缺血再灌注(IR)损伤产生持续的机械和冷触诱发痛、水肿、微血管功能障碍大鼠后爪没有伴随神经损伤的证据。红外受伤发生在组织的血液供应返回后一段时间内血流量不足。长期缺血导致的累积一氧化氮(NO)和次黄嘌呤在受影响的组织4]。分子的重新引入O₂缺血性组织再灌注后结果生产超氧化物(通过黄嘌呤氧化酶()和黄嘌呤5]。的反应没有结果过氧亚硝基的生产()[6]。是一种强氧化剂,发挥其毒性作用通过脂质过氧化反应,线粒体损伤,蛋白质硝化和氧化,谷胱甘肽(GSH)储备耗尽,DNA损伤(7]。的形成缺血性组织导致血管功能障碍和组织损伤8]。也参与炎症等生理过程,神经损伤,阿片类药物诱发痛觉过敏,红外损伤(9,10]。在CPIP老鼠,参与开发触诱发痛和n -甲基- d(门冬氨酸)受体介导的中枢敏化11]。

细胞中的谷胱甘肽是最丰富的抗氧化剂。缺血再灌注损伤耗尽组织和补充谷胱甘肽,谷胱甘肽被发现减少相关组织损伤(12,13]。谷胱甘肽也已减少相关的损伤(14]。然而,没有先前的研究评估谷胱甘肽的影响红外受伤后机械触诱发痛的发展。我们推测,谷胱甘肽的保护作用相关损伤可以减弱机械触诱发痛和中枢敏感化的发展CPIP老鼠模仿人类crp的症状。因此,我们进行了本研究探讨谷胱甘肽的保护作用CPIP老鼠通过提取阈值的变化后的后肢机械刺激和脊髓激活的n -甲基- d(门冬氨酸)受体亚基GluN1 (pGluN1)。

2。材料和方法

2.1。动物

45男性Sprague-Dawley老鼠(320 - 340 g)被用于这项研究(Koatech、京畿道、韩国)。所有的老鼠被安置在动物保健设施在特定的无菌条件下。他们被允许免费获取食物、水和暴露在光明与黑暗周期,每12小时。保健提供了根据美国国立卫生研究院的指导方针在实验室动物福利。大鼠适应他们的笼子前7天开始实验。

2.2。试验协议

机构庆北国立大学动物保健和使用委员会批准了实验性的协议。总共有45个雄性老鼠五组之间均匀分布,每组9个老鼠:()虚假的集团()CPIP集团()CPIP +谷胱甘肽100毫克/公斤集团()CPIP +谷胱甘肽200毫克/公斤,和()CPIP +谷胱甘肽组500毫克/公斤。虚假的组的老鼠接受了虚假的过程,而其他组的老鼠接受CPIP过程。老鼠在假针灸组和CPIP组腹腔注射1毫升的生理盐水再灌注前30分钟。老鼠在CPIP +谷胱甘肽100毫克/公斤,CPIP +谷胱甘肽200毫克/公斤集团和CPIP +谷胱甘肽500毫克/公斤组腹腔注射指定剂量的谷胱甘肽与1 cc的生理盐水混合再灌注前30分钟(图1)。

2.3。后爪缺血和再灌注

CPIP过程进行描述,Coderre et al。3]。麻醉诱导在所有老鼠在腹腔内注射苯巴比妥钠的50毫克/公斤。与注入苯巴比妥钠麻醉维持20毫克/公斤/小时。一次麻醉,腈70硬度计o形环(o型环西、西雅图、佤邦),5.5毫米内直径周围放置左后肢只是近端中的每个老鼠的内踝CPIP组。三个小时后o形环的位置,删除和再灌注被允许发生。o形环放置相同的老鼠在虚假的组,但是设备被切断,因此它包围了脚踝松散,没有封闭的血流量爪子。所有大鼠在30分钟内完全康复的o形环(图2)。

2.4。后爪机械触诱发痛

允许适应环境,老鼠被单独测试笼子里(23×16×24厘米³)和网状金属地板每天1小时开始前2天的开始实验。实验开始前三十分钟老鼠又可以适应。后评估了侧后肢机械触诱发痛。机械触诱发痛阈值是通过测量评估50%戒断反应·冯·弗雷丝(美国IL Stoelting、木材Dale)使用向上/向下的改性方法(15]。冯·弗雷细丝被应用于足底的后爪表面的中心10秒或更少,如果老鼠回应刺激通过撤军,闪烁,冲压,或者舔爪子。实验开始时灯丝生产2 g的力,持续提升(消极反应)或降序(积极回应)。的最小刺激强度利用率为0.25 g和最大15 g。50%的响应阈值(g)计算从响应模式和产生的力量最终的灯丝。后肢都进行测试。基线记录提取阈值的获得1小时前施加的红外受伤。第一、第三和第七天后CPIP受伤,我们评估了退出阈值来确定谷胱甘肽的影响。所有的测试是由研究员治疗失明。

2.5。免疫印迹分析

手术后三天,从每组三只老鼠被随机选择。所有的老鼠都完全麻醉,然后迅速牺牲。从每个老鼠L4-5脊髓段,然后分为左和右。脊髓部分被立即在液态氮。左边的脊髓样本均质在100年μl裂解缓冲(20毫米Tris-HCl pH值8.0,150毫米氯化钠,EDTA 1毫米,2毫米Na₃签证官₄0.5毫米德勤,10%甘油、1%诺乃清洁剂p 40)加蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板(罗氏诊断,曼海姆,德国)。溶菌产物是离心机在13000 g×25分钟在4°C。收集上清液和蛋白质是量化使用布拉德福德方法(蛋白质测定装备我Bio-Rad大力神,Ca,美国)。蛋白质样品(40μg)溶解在缓冲溶液(0.1 M Tris-HCl, 10%甘油、2% SDS和0.1%溴酚蓝)。蛋白质样品在100°C加热5分钟,然后加载到10% SDS-polyacrylamide凝胶。由SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离后,转移到硝酸纤维素和蛋白质堵塞与Tris-buffered盐水(50毫米Tris-HCl pH值7.4和10毫米氯化钠)在3%的脱脂牛奶在室温1小时。这些墨迹孵化了anti-phospho-NR1抗体(1:500年,Ser897 ABN99,微孔,Billerica,妈,美国)和反β肌动蛋白抗体(1:5000,β肌动蛋白,sc - 47778,圣克鲁斯生物技术、达拉斯、美国TX)一夜之间在4°C。这些墨迹洗了洗缓冲区(50毫米三pH值7.4和10毫米氯化钠)然后孵化anti-mouse辣根过氧化物酶共轭二次抗体(1:2000年,anti-mouse IgG-HRP, 7076年代,细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)为1小时21°C。增强化学发光的墨迹开发工具包(英国Amersham Amersham淀粉微球的生物技术)。β肌动蛋白是作为内部控制。蛋白质印迹的密度是量化使用图像J 1.50我软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

2.6。统计分析

提出了测量数据的平均值±标准平均误差(SEM)和使用统计软件SPSS统计分析了Windows,版本21.0 (SPSS, IBM公司,阿蒙克,纽约,美国)。分析随时间变化的多个组使用双向执行与一个重复测量方差分析(时间)图基测试紧随其后。多个组之间的差异值测试使用单向方差分析(当比较两组以上)图基测试紧随其后。随时间变化的一组测试使用单向重复测量方差分析。 显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。后爪机械触诱发痛

撤军后爪阈值都在基线组没有差异。没有明显的变化同侧和对侧的撤军的阈值后爪子虚假的组在整个研究期间。谷胱甘肽治疗前30分钟再灌注与显著增加有关撤军后爪再灌注后的阈值。撤军的阈值后爪子CPIP和CPIP +谷胱甘肽的剂量100毫克/公斤,200毫克/公斤,而谷胱甘肽500毫克/公斤团体第一,第三,第七天再灌注后显著降低而虚假的集团在这些相同的时间点( )。500毫克/公斤CPIP +谷胱甘肽组有显著提高提取阈值比CPIP +谷胱甘肽组(100毫克/公斤 )在两个后爪子,第三,和再灌注后第七天(图3)。

3.2。测量pNR1脊髓

的相对密度pGluN1 CPIP和CPIP +谷胱甘肽100毫克/公斤组明显高于在虚假的集团。相对密度的pGluN1 CPIP +谷胱甘肽200毫克/公斤,CPIP +谷胱甘肽500毫克/公斤组明显低于CPIP组。相对密度的pGluN1 CPIP +谷胱甘肽组明显低于500毫克/公斤,在CPIP +谷胱甘肽组(图100毫克/公斤4)。

4所示。讨论

我们的研究表明,谷胱甘肽治疗再灌注前减毒机械触诱发痛和抑制脊髓磷酸化的GluN1 CPIP老鼠存在剂量依赖的相关性。这些发现表明,异常性疼痛的发展CPIP老鼠结果从中枢敏化二级GluN1磷酸化,并与谷胱甘肽治疗以剂量依赖性的方式抑制致敏。

crp我是微血管损伤的发病机理提出,结果从一个持久深层组织缺血再灌注后和随后的炎症反应(16]。受影响肢体的微血管损伤激活外围痛觉受器,启动和维护NMDA介导中枢敏化17]。CPIP模型包括完整的阻塞血液流动的后爪和结果延长再灌注后反应性充血和水肿。老鼠在这个模型开发冷触诱发痛,机械痛觉过敏,和血管异常没有神经损伤的证据,这是类似于c反应蛋白的发现我的病人18]。长期缺血CPIP老鼠氧化酶类积累的结果。黄嘌呤氧化酶积累负责超氧化物再灌注期间的生产过剩。激活的一氧化氮合酶在缺血导致的生产从血管内皮一氧化氮(NO)和中性粒细胞19]。超氧化物正迅速被超氧化物歧化酶(SOD),并没有迅速扩散到血红细胞(6]。没有和过氧化物的邻近血管空间可以促进代在早期再灌注(20.]。

是一个极其短暂的细胞毒性氧化剂。它的半衰期为1.9秒在pH值为7.4,这是体内更短(21]。尽管其半衰期短,能够扩散通过几个细胞和诱导脂质过氧化反应和DNA和蛋白质损伤(22]。损害毛细血管内皮细胞及红外损伤后动脉平滑肌细胞。内皮细胞肿胀,并用毛细管腔中受了伤。毛细血管闭塞和再灌注组织产生红外损伤(23]。内皮细胞功能障碍减少生产导致动脉血管痉挛(18,24]。微血管功能障碍后红外受伤导致肌肉缺血的爪子,和异常性疼痛与肌肉缺血CPIP老鼠(25]。据报道,导致慢性疼痛的发展,周边的管理已被证明诱导炎症痛觉过敏(9]。周围神经损伤导致的生产 ,和清除已经被证明可以缓解痛觉过敏和神经变性10]。预处理的CPIP老鼠分解催化剂已被证明会降低触诱发痛和防止中枢敏化衰减NMDA受体激活(11]。

谷胱甘肽是一种胞内三肽硫醇。它是一个主要水溶性抗氧化剂和调制的过程中扮演着重要的角色一氧化氮(9,26]。谷胱甘肽转换更少的有害副产品如S-nitrosoglutathione [27]。的存在 ,谷胱甘肽(放松血管壁,)刺激内皮细胞中鸟苷酸环化酶的活性,()变弱引起溶血,()抑制血小板聚集14]。这些行动通过谷胱甘肽可能减少内皮细胞损伤和改善微循环。管理体内谷胱甘肽据报道,增加细胞内谷胱甘肽水平,并注入谷胱甘肽已被证明会降低外周动脉疾病患者的疼痛和改善微循环(28]。在我们的研究中,谷胱甘肽注射前30分钟再灌注导致提取阈值的增加,抑制pGluN1剂量依赖性的方式表达。这些结果表明,谷胱甘肽减少疼痛和中枢敏感化红外受伤后减少诱导毒性CPIP老鼠。

在这项研究中,我们没有对谷胱甘肽对肌肉缺血和微血管损伤的影响存在剂量依赖的相关性。然而,红外受伤是减少骨骼肌谷胱甘肽的浓度(29日),后爪CPIP后肌肉缺血损伤的程度与机械触诱发痛的发展(25]。在这项研究中,补充和再灌注前谷胱甘肽抑制异常性疼痛的发展。这个结果表明谷胱甘肽可能减弱疼痛减少微血管损伤后红外受伤。

总之,本研究的结果表明,政府的谷胱甘肽再灌注之前减轻机械触诱发痛和脊髓的磷酸化GluN1 CPIP老鼠。我们的研究表明,谷胱甘肽中和红外受伤后微血管功能障碍。还需要进一步的研究来获得显著的可译性评估谷胱甘肽的antinociceptive潜在的类似物在正在进行的临床试验CPIP老鼠和crp我的病人。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Jinseok杨参加概念设计的研究和写批判性修订后的手稿。胡恩荣格进行动物实验和样品采集。Hyerim李极度修订后的手稿和执行统计分析。

确认

这项工作是由生物医学研究所格兰特,庆北国立大学医院(2014)。

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