文摘

肝缺血/再灌注(I / R)损伤是主要肝脏手术的主要并发症。我们之前的研究蛋白质组分析显示,PPAR信号级联肝缺血/再灌注期间显著调节。阐明PPAR的潜在机制α参与I / R损伤,我们使用oleoylethanolamide (OEA)的过氧物酶体proliferator-activatedα受体(PPARα)受体激动剂,在这项研究中。我们演示了一个保护作用OEA肝脏I / R损伤通过使用小鼠模型的局部热缺血再灌注和hypoxia-reoxygenation肝细胞模型。这些效应是由于改善肝损伤,降低血清ALT和AST水平,减少肝细胞的凋亡。此外,机械的研究表明OEA监管压力通过激活PPAR内质网(ER)α,从而降低ER跟压力减弱肝脏I / R损伤细胞凋亡。简单地说,这些数据首先提出,OEA-mediated PPARα激活可能是一个有效的疗法对肝缺血/再灌注损伤。

1。介绍

肝缺血再灌注(I / R)损伤是一种常见的病理过程在临床条件下,品种包括休克、创伤、移植、肝切除(1]。肝脏I / R损伤是复杂的,与厌氧代谢有关,Ca2 +过载,线粒体结构和功能损伤,氧化应激反应(2]。众所周知,肝脏中肝细胞是主要的细胞类型,产生大量的蛋白质。考虑大要求蛋白质合成,肝细胞含有丰富的内质网(ER)结构和容易ER扰动和ER应激。内质网环境的失衡会导致ER应激,导致激活的蛋白质反应(UPR)。UPR是一种防御机制对错误折叠的蛋白质。受ATF6,咖啡馆,和IRE-1,而三个ER膜传感器被绑定到Grp78不活跃。UPR构成高度保守的和复杂的监管途径,维持体内平衡。长期或过量ER应激时,通过不同的经纪人UPR促进凋亡细胞死亡,包括C / EBP同源蛋白质(切)和Caspase12。然而,在肝脏I / R损伤,过度缺氧,缺血,氧化应激和其他因素可能加剧ER应激反应(3]。因此,抑制过度的ER应激可能提供一个潜在的治疗肝脏I / R损伤。

过氧物酶体proliferation-activated受体(PPAR)是核激素受体,即ligand-dependent细胞内蛋白质。有三种亚型的PPAR,包括PPARα,PPARβ/δ,PPARγ(4]。PPARα高度表达的各种组织包括肝脏和脂肪酸氧化中起着重要的作用5]。PPAR通常与9-cis-retinoic酸受体二聚化(RXR)形成一个复杂的,然后作用于目标基因的启动子区域。当激活受体激动剂,heterodimeric复杂招募转录辅活化因子和调节基因转录控制脂类和碳水化合物代谢6]。Oleoylethanolamide (OEA)是一种内源性脂质介质,源自于单一不饱和脂肪酸。众所周知,各种各样的生物功能,包括脂质代谢、清除自由基和抗炎过程(7]。许多积极作用OEA被认为依赖PPAR的激活α(8]。我们先前的研究显示,PPAR信号级联肝缺血/再灌注期间显著调节。因此,它是有价值的调查OEA在肝脏I / R的影响。在此,我们报告一个保护OEA肝脏I / R损伤,体现在改善肝损伤,降低ALT和AST水平,减少肝细胞的凋亡。因此,我们进一步调查的潜在机制OEA在预防肝脏I / R损伤。

2。材料和方法

2.1。材料和试剂

OEA, DMSO、PEG300和渐变- 80从σ购买化学(美国)。衣霉素(TM)购买的多国评价(美国新泽西州)。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)和胎牛血清(的边后卫)从万岁购买细胞生物科学(中国)。PMSF里帕裂解缓冲,细胞计数Kit-8 (C0037),用辣根过氧化物酶颜色开发工具包,乳酸脱氢酶(LDH)、细胞毒性试验装备,和TUNEL细胞凋亡检测设备(C1086)从Beyotime购买(中国)。PPARα抗体(猫:15540 - 1 - ap), Grp78抗体(猫:11587 - 1 - ap),切抗体(猫:15204 - 1 - ap),半胱天冬酶12抗体(猫:55238 - 1 - ap), cleaved-Caspase 3(猫:19677 - 1 - ap), Bcl2(猫:12789 - 1 - ap)抗体,伯灵顿抗体(猫:50599 - 2 - ig),β肌动蛋白抗体(猫:66009 - 1 - ig)和HRP-conjugated山羊anti-mouse /兔免疫球蛋白(SA00001-1/2)从Proteintech购买(中国)。ALT测定工具包(C009-2-1)和AST分析工具包(C010-2-1)购自建成生物工程研究所(中国南京)。膜联蛋白V体育细胞凋亡检测设备(559763)从BD Pharmingen购买(美国新泽西州)。Lipofectamine™3000和试剂盒购自表达载体。从豆类SYBR绿色®预混料购买。化学发光试剂盒购自不合格品生物技术(苏州、中国)。

2.2。动物

男性BALB / c老鼠(6 - 8周,汽车出行g)从安徽购买实验动物中心(合肥,中国)。这些老鼠被安置在隔离器的笼子里,免费获取食物和水的环境中与标准温度(20 - 25°C)、湿度(40 - 60%)和照明条件(12 h光/暗周期)。所有实验动物保健和使用委员会批准安徽医科大学(20190214,LLSC2019022)。

2.3。鼠标温暖肝脏I / R损伤模型和实验设计

简要麻醉小鼠戊巴比妥,左边和中间的血液供应肝脏叶(大约70%)被使用防止损伤的剪辑。肝脏缺血后1 h,防止损伤的夹被轻轻地对再灌注和再灌注6 h后小鼠安乐死(3,9- - - - - -11]。肝组织和血清收集立即进行后续分析。虚假的操作组接受相同的操作除了血管闭塞。OEA(20毫克/公斤体重)溶解在溶液(10% DMSO + 40% PEG300 + 5%渐变- 80 + 45%生理盐水)腹腔注射1小时前肝缺血手术。OEA的用量是初步研究的基础上确定的。TM(1毫克/公斤体重)溶解在一个相同的解决方案是腹腔内注射肝缺血前24小时,TM的剂量和给药途径,根据先前的报道12]。注入同等体积的载体控制的解决方案。老鼠被分配到六组:(1)骗局,I / R, (2) (3) vehicle-I / R, (4) OEA-I / R, (5) TM-I / R, (6) TM-OEA-I / R。所有实验至少重复三次。

2.4。血清样本的分析

血清ALT和AST的表达水平,肝损伤的指标,是衡量商业工具根据制造商的协议。

2.5。组织病理学

肝脏组织和4%多聚甲醛固定的48小时内,嵌入在石蜡,切成5μ米厚的部分。肝脏组织苏木精和伊红染色(他)和坏死区域分析与ImageJ V1.8.0软件。每个鼠标的坏死面积的百分比总面积是盲目地量化/ 5视图的字段13]。

2.6。免疫组织化学

5.0μ米厚的肝脏部分从石蜡包埋组织准备,deparaffinized和水化。抗原检索后,用3%的过氧化氢,内在的过氧化物酶活动受阻和3% BSA屏蔽特定的抗体结合网站。部分是与特定的孵化主要抗体在4°C 12 h。洗后,与二次孵化的部分抗体在大约20°C, 1 h和免疫反应性的细胞可视化使用轻拍。显微镜下观察染色部分。

2.7。TUNEL染色

检测细胞缺血再灌注诱导细胞凋亡,TUNEL执行使用TUNEL细胞凋亡测定工具根据制造商的协议。TUNEL-positive细胞量化使用ImageJ V1.8.0软件。

2.8。细胞培养

HepG2,人类肝癌细胞系,从美国购买类型文化集合(写明ATCC,美国)。细胞在DMEM培养补充10%的边后卫,和细胞保持在湿润的气氛中5%的股份有限公司2。

2.9。Oxygen-Glucose剥夺和复氧(OGD / R)和药物管理局

模拟缺血再灌注损伤在体外,OGD / R模型根据执行先前描述(14]。HepG2细胞培养在血清/ glucose-free DMEM湿润的氛围下5%的股份有限公司2和95% N21 h,然后恢复正常培养基和条件。TM (1μg / ml,溶解在DMSO)添加到中6 h之前OGD和OEA (10μM,溶解在DMSO)之前添加1 h。TM的剂量是决定基于之前的研究(15),和OEA剂量的确定是基于一个试点研究。DMSO作为车辆控制。

2.10。细胞生存能力和细胞毒性试验

细胞生存能力是由细胞计数Kit-8试验根据制造商的指示。96孔板的细胞培养。在治疗结束时,CCK-8试剂添加和孵化37°C 1 h。细胞的生存能力是决定通过测量吸光度在450 nm,和细胞毒性是由LDH释放。治疗后,上层清液收集立即确定LDH活性通过测量吸光度在490海里。

2.11。流式细胞术

HepG2细胞凋亡分析,膜联蛋白V-PE / 7-AAD工具被用来量化凋亡细胞根据指令然后孵化 缓冲区包含7-AAD和PE膜联蛋白V,持续15分钟。流式细胞术检测后1小时内染色,细胞染色阳性PE膜联蛋白V被选为细胞凋亡。

2.12。西方墨点法

细胞或肝组织由同质化在里帕裂解缓冲含有1% phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF)。溶菌产物是在sds - page电泳,然后转移到硝化纤维膜。膜被封锁的5%脱脂牛奶和孵化主要PPAR抗体α,Grp78,排骨,Caspase12、cleaved-Caspase3 Bcl2,伯灵顿,β肌动蛋白在一夜之间在4°C。然后,膜与HRP-labeled孵化二级抗体1 h,并观察蛋白质ECL化学发光设备。定量分析免疫印迹被ImageJ执行软件。

2.13。RNA提取和定量实时PCR

用试剂盒总RNA提取试剂和反向转录成互补脱氧核糖核酸。RT-qPCR执行使用SYBR绿色®工具。mRNA的表达水平分析了罗氏LightCycler®96检测系统。相对表达式值规范化β肌动蛋白控制。引物序列表中列出1。

表1
引物序列中存在。
2.14。PPARα核转染

HepG2细胞培养在6-well板块在适当的密度。Lipofectamine™3000(英杰公司)与PPAR均匀混合α核和NC-siRNA (GenePharma有限公司,中国)Opti-MEM和添加到转染6-well板。24小时孵化后,转染细胞进行不同的处理。药品管理局和OGD / R之后,收集细胞蛋白质进行进一步分析。

2.15。统计分析

数据被表示为 值。的 - - - - - -测试或单向方差分析应用于使用SPSS 16.0分析组之间的差异。 被认为是统计学意义,然后呢 表明强烈的显著差异。

3所示。结果

3.1。OEA治疗保护肝脏I / R损伤

确定是否《奥亚报》现已保护作用,在活的有机体内部分热缺血再灌注模型被用来确定OEA防止肝脏I / R损伤的老鼠。发现在20毫克/公斤OEA治疗在肝缺血显示显著降低血清ALT和AST水平(补充图1A和B)。肝组织学分析显示,处理OEA展出保存较为完好的肝组织架构和小得多的坏死面积相比,车辆控制(数字1(一)和1 (b))。此外,OEA-treated老鼠显示显著降低血清ALT和AST(数字1 (c)和1 (d))。

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图1
OEA治疗保护肝脏I / R损伤。OEA治疗小鼠是由腹腔内(20毫克/公斤)缺血前1 h。肝组织和血清收获再灌注后6 h。OEA治疗HepG2细胞(20μ米)之前进行1 h OGD / R。再灌注后6 h (a)代表HE-stained图像或虚假的组。(b)的坏死区域。(c和d)血清ALT和AST水平。(e和f)后细胞HepG2细胞的生存能力和细胞毒性OGD / R OEA或DMSO溶液治疗测量。 和 。

检测OEA在肝细胞的影响,OGD / R模型HepG2细胞采用模拟I / R损伤在体外。细胞CCK-8分析显示,细胞生存能力大大降低控制比正常组。与OEA预处理(10μ米)显著抑制OGD / R-induced肝细胞的死亡(补充图2)。额外的化验显示,OEA治疗显著提高细胞生存能力和减少细胞毒性(数字1 (e)和1 (f))。这些观察表明,OEA治疗肝脏I / R损伤的保护。

3.2。OEA防止肝脏I / R创伤性肝细胞凋亡

细胞凋亡是一种重要的机制诱导肝细胞死亡在肝脏I / R损伤(16]。探索OEA对肝脏I / R损伤,TUNEL染色和免疫组织化学染色cleaved-Caspase3被执行。与虚假的集团相比,乳沟Caspase3和TUNEL-positive细胞的百分比显著增加I / R组,由OEA减毒治疗(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。免疫印迹分析的结果的差别进一步显示对这些Bcl2(凋亡)和伯灵顿upregulation (proapoptotic) I / R组,表明I / R介导细胞凋亡在活的有机体内。然而,Bcl2水平增加,而伯灵顿是减少OEA治疗组(数字2 (e)和2 (f))。一致,OEA治疗产生同样的效果在OGD / R-treated HepG2细胞在体外(数据2 (g)和2 (h))。这些结果表明,OEA治疗肝细胞在肝脏I / R损伤细胞凋亡减少。

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图2
OEA预处理变弱在肝脏I / R损伤细胞凋亡。(a和b) TUNEL染色,TUNEL-positive细胞的比例,分别评估在肝脏部分。(c和d) Cleaved-Caspase3染色和cleaved-caspase3-positive细胞的比例,分别评价肝脏部分。(e和f) Bcl2和伯灵顿表达的蛋白免疫印迹分析肝脏组织。(g和h)免疫印迹分析Bcl2和伯灵顿在HepG2细胞表达OGD / R。 和 。
3.3。OEA激活PPARα改善细胞凋亡

OEA高亲和性的PPAR激动剂α。我们发现PPAR的蛋白表达α在再灌注后6 h是表达下调,OEA治疗显著调节它和它的目标基因表达(补充图吗3)。此外,cleaved-Caspase3水平显著降低在OEA-treated组相对于对照组(数字3(一个)和3 (b))。同时,免疫印迹结果发现同样的现象在OEA-treated HepG2集团(数字3 (c)和3 (d))。此外,流式细胞仪分析结果表明OEA治疗缓解凋亡OGD / R-treated HepG2细胞(数字3 (e)和3 (f))。这些结果表明,OEA治疗改善肝细胞在肝脏I / R损伤的细胞凋亡。

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图3
OEA激活PPARα改善细胞凋亡。OEA治疗HepG2细胞(20μ米)之前进行1 h OGD / R。(a和b) PPAR的免疫印迹分析α和cleaved-Caspase3肝脏I / R损伤。(c和d) PPAR的免疫印迹分析α和cleaved-Caspase3表达OGD / R-treated HepG2细胞。(e)从表示团体被流式细胞术检测细胞凋亡。(f)数据是基于三个独立化验( )。 和 。
3.4。OEA-Induced PPARα激活减弱ER跟压力细胞凋亡

过多或长期激活ER应激对肝脏缺血再灌注损伤的发病机制至关重要。ER应激引发Caspase12无常的激活,参与ER-associated细胞凋亡。因此,调查是否OEA减少肝细胞凋亡,取决于在I / R损伤,ER应激相关的凋亡标记,Grp78,排骨,Caspase12, cleaved-Caspase3,进行了分析。我们的研究结果证实,OGD / R诱导ER跟压力凋亡就是明证Grp78的表达,排骨,Caspase12, cleaved-Caspase3。细胞用OEA预处理时,相关蛋白的表达明显减少(数字4(一)和4 (b))。TM激活UPR在哺乳动物细胞通过抑制N-linked新生蛋白质的糖基化,这是常用的诱导过度ER应激,介导ER跟压力凋亡[17- - - - - -20.]。探索是否OEA保护肝细胞免受ER在OGD / R的相关细胞凋亡,细胞HepG2之前使用TM OGD / R治疗。结果表明,TM Grp78的表达增加,切,Caspase12和cleaved-Caspase3, OEA治疗明显抑制相关蛋白的表达(数字4 (c)和4 (d))。此外,OEA-OGD / R组相比,mRNA的Grp78的表达,排骨,和Caspase12 TM-OEA-OGD / R组显著增加,PPARα信使rna表达这两组(图没有区别4 (e))。这些发现表明,OEA-induced PPARα激活减弱ER在OGD / R的相关细胞凋亡。

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OEA induced-PPARα激活减弱ER跟压力细胞凋亡。TM治疗HepG2细胞(1μg / ml)进行6 h,和OEA治疗(20μ米)之前进行1 h OGD / R。蛋白质在复氧后6 h收获。(a和b) PPAR的免疫印迹分析αGrp78,排骨,Caspase12 cleaved-Caspase3表达式。(c和d) HepG2细胞治疗与TM 6 h或OEA 1 h之前OGD / R操作。西方墨点法PPAR的分析αGrp78,排骨,Caspase12 cleaved-Caspase3表达式。(e)的相对PPAR的mRNA表达αGrp78,排骨,Caspase12。 和 。
3.5。OEA抑制ER跟压力保护肝脏I / R损伤细胞凋亡

考虑到PPARα激活的OEA改善ER跟压力凋亡,我们下决定确认OEA可以发挥肝I / R的保护在活的有机体内。OEA治疗显著改善I / R损伤,TM预处理逆转肝保护OEA引起,建议至少部分OEA的保护特性是由ER跟压力细胞凋亡(数字5(一个)和5 (b))。按照组织数据,OEA-I / R组相比,ALT和AST水平TM-OEA-I / R组显著增加(数据5 (c)和5 (d))。一致,西方墨点法表明Grp78的表达,排骨,Caspase12, cleaved-Caspase3 OEA治疗组(数字下降5 (e)和5 (f))。同时,OEA-I / R组相比,Grp78的表达,排骨,Caspase12, cleaved-Caspase3 TM-OEA-I / R组显著增加(数据5 (g)和5 (h))。这些发现表明,OEA减毒ER跟压力通过激活PPAR在I / R损伤细胞凋亡α。

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OEA抑制ER跟压力保护肝脏I / R损伤细胞凋亡。腹腔内的老鼠接受TM(1毫克/公斤)24 h,和OEA治疗之前进行1 h缺血的开始。肝脏组织和血清在再灌注后6 h收获。TM治疗HepG2细胞(1μg / ml)进行6 h,和OEA治疗(20μ米)之前进行1 h OGD / R。蛋白质是收获后6 h再氧化。(a和b))染色和肝坏死区域的部分的百分比。(c和d)血清ALT、AST水平。(e和f) PPAR的免疫印迹分析αGrp78,排骨,Caspase12 cleaved-Caspase3 OEA或车辆治疗后表达。(g和h) TM政府在缺血前24小时和收获组织蛋白质在再灌注后6 h。西方墨点法PPAR的分析αGrp78,排骨,Caspase12 cleaved-Caspase3表达式交替。 和 。
3.6。可拆卸的PPAR的α加剧了ER跟压力细胞凋亡和逆转OEA的保护效果

我们使用PPARα进一步探索PPAR是否可以阻止α参与ER跟压力细胞凋亡。结果表明,PPAR的表达α在PPAR显著降低α核集团(数据6(一)和6 (b))。此外,小干扰rna(-)相比,在-OEA-OGD / R组,Grp78蛋白表达,切,Caspase12, cleaved-Caspase3 PPAR显著增加αsiRNA-OEA-OGD / R组(数字6 (c)和6 (d))。因此,所有这些观察证实,OEA保护肝脏对肝脏I / R损伤,通过激活PPAR至少部分α抑制ER跟压力细胞凋亡。

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可拆卸的PPAR的α加剧了ER跟压力细胞凋亡和逆转OEA HepG2细胞的保护作用。PPAR (a和b)α蛋白表达转染后核(-)或PPARα核。(c和d) Grp78的表达水平,切,Caspase12, cleaved-Caspase3通过免疫印迹和PPAR HepG2细胞转染α然后OEA处理。 和 。

4所示。讨论

目前的研究表明,OEA保护肝脏I / R损伤在活的有机体内和在体外。结果表明,OEA改善肝脏I / R损伤,表明《奥亚报》现已激活PPAR强有力的保护作用α。从力学上看,我们发现OEA抑制ER跟压力细胞凋亡(图7),这可能为新的治疗靶点提供线索的肝脏I / R损伤。


图7
OEA减轻肝脏I / R损伤机制。OEA上调PPARα表达,促进核PPAR的翻译α,抑制ER跟压力细胞凋亡,减轻肝脏I / R损伤。

肝脏I / R损伤是一种严重的并发症,发生循环衰竭和肝移植后,导致高死亡率和发病率。OEA是PPAR的内源性配体α,它扮演着保护的角色在脑I / R损伤21- - - - - -23]。然而,没有报道OEA肝脏I / R损伤的功能。在我们的研究中,我们的数据表明,OEA减轻肝脏缺血再灌注损伤。

越来越多的证据表明,ER跟压力细胞凋亡在肝脏I / R损伤中起着至关重要的作用。通过三个主要途径:ER应激介导细胞凋亡Caspase12物和转录的激活途径切/ GADD153基因(24]。具体来说,Grp78分开时受体ER应激激活和修复正常功能的ER通过激活相关信号通路,提高蛋白质折叠(25,26]。切是一个关键的转录因子促进ER stress-mediated细胞凋亡。在正常情况下,切保持低水平,而ER应激过度砍的表达增加,最终生成细胞凋亡27]。切会使Bcl2转录和移植伯灵顿表达式,连接ER应激与细胞凋亡的线粒体(28]。Caspase12称为发起者和关键因素参与ER跟压力凋亡[29日]。在这里,我们发现OEA降低ER在肝脏I / R损伤相关细胞凋亡。因此,抑制过度的ER应激反应可能是一个理想的预防和干预策略肝脏I / R损伤。

我们发现PPARα显著抑制肝脏I / R损伤。OEA PPAR的表达水平显著增加α和减少细胞凋亡的肝细胞,表明PPAR的重要作用αhepatoprotection。先前的研究已经表明PPARα严重降低ER应激激活肝细胞凋亡在急性肝衰竭30.]。在这项研究中,人们发现I / R损伤或OGD / R可以显著加剧ER跟压力细胞凋亡。切的表达水平,Caspase12 cleaved-Caspase3明显高于对照组。此外,与OEA预处理可以减轻ER跟压力细胞凋亡,就是明证的减少相关蛋白质在活的有机体内和在体外。此外,PPAR击倒α呃跟压力增加细胞凋亡和废除OEA的保护效果。因此,PPARα在hepatoprotection信号是重要的调制,表明OEA可能防止临床肝脏I / R损伤。

综上所述,我们的数据表明,PPARα信号通路在肝I / R的发病机制的关键。OEA-mediated PPARα激活减弱肝脏I / R损伤,至少部分是通过抑制ER跟压力细胞凋亡。此外,ER应激是视为一个有吸引力的潜在目标,这可能会改善病理过程通过抑制肝脏I / R ER应激。OEA可以作为一个潜在的王亚南代理在缺血的临床和器官保护。

数据可用性

生成的数据集/分析在当前的研究中是可用的。

的利益冲突

作者宣称没有利益竞争。

作者的贡献

Lijian陈和剑Du设计研究。顺利气、漆和甄王整理数据,进行数据分析,而且提出初稿的手稿。刘邓和Mengting詹起草修订手稿,手稿。所有作者同意最后提交的手稿。顺利气、漆和甄王的贡献同样这项工作和分享第一作者。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(号。81970542,82072300,81871674)。

补充材料

补充材料1:OEA的最佳浓度在活的有机体内。我们虚假的集团相比,汽车集团和OEA组进行不同浓度和检测血清ALT和AST水平的群体。结果展示如下。我们发现20毫克/公斤OEA的最佳浓度在活的有机体内。补充材料2:OEA的最佳浓度在体外。我们发现细胞生存能力通过测量吸光度在450 nm确定OEA的最佳浓度。我们发现,10μM是OEA的最佳浓度在体外。补充材料3:PPAR的引物序列α目标基因中存在和PPAR的信使rna表达水平α目标基因。(补充材料)