文摘

术后生存时间和生活质量的结肠癌患者腺癌(COAD)差别很大。为了做出准确的决定手术后,临床医生需要区分不同的患者预后趋势。然而,我们仍然缺乏有效的方法来预测COAD患者的预后。积累的证据表明,抑制过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)和他们的目标基因的一部分与COAD的发展有关。我们的研究发现,一些的表达PPAR pathway-related基因与COAD患者的预后有关。因此,我们开发了一个评分系统(名为PPAR-Riskscore)可以预测病人的结果。PPAR-Riskscore由单变量Cox回归基于4基因的表达(TNFRSF1A NR1D1,同类,任)在肿瘤组织。与典型的TNM分级系统相比,PPAR-Riskscore具有更好的预测精度和灵敏度。系统的可靠性测试六个外部验证数据集。此外,PPAR-Riskscore能够评估每个肿瘤的免疫细胞浸润和化疗敏感性样本。 We also combined PPAR-Riskscore and clinical features to create a nomogram with greater clinical utility. The nomogram can help clinicians make precise treatment decisions regarding the possible long-term survival of patients after surgery.

1。介绍

结肠腺癌(COAD)是世界第二最常见癌症和癌症死亡的第三个最大的原因(1]。尽管COAD手术的快速进步和辅助治疗,65%的患者有严重COAD将经历复发和转移,5年生存率不到10%。结果,有效地预测COAD患者的预后和区分高风险和低风险病人已成为最紧迫的临床问题。患者低生存前景可以大大受益于及时跟踪和采用有效的治疗方案。患者更大的生存机会,减少侵入性测试和降低化疗药物剂量可以提高生活的质量。虽然血液生物标志物如CA19-9(碳水化合物抗原胜负和CEA(癌胚抗原)通常受雇于COAD诊断和预后,其敏感性和特异性较低。我们仍然需要寻求更可靠的指标预测患者的预后CC,这将有助于指导临床护理,同时也为探索新药提供新的机遇。

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)核受体蛋白是一组在1990年发现的。他们存在于三个不同的亚型,PPARα(NR1C1), PPARβ/δ(NR1C2)和PPARγ(NR1C3)和配体依赖性转录因子(TF)可以作为3]。最近的研究表明,PPARs有抗癌效果除了他们的代谢效率(4- - - - - -5]、[2,6]。此外,许多研究已经发现,PPARs和PPAR目标基因表达异常往往与癌症的发展和进展(7- - - - - -9PPAR通路,受体激动剂,如thiazolidinediones,通常认为肿瘤细胞的抗增殖(10]。

PPAR的参与途径及其在COAD下游靶基因还有待发现。在这项研究中,我们发现PPAR通路和下游靶基因通常是压抑在结肠癌组织中通过微阵列和RNA-seq数据。此外,我们发现了一个重要的表达之间的相关性PPAR pathway-related基因在癌症组织和COAD患者的预后。我们可以预测患者的预后以及他们对某些化疗药物的敏感性基于这些基因的表达。这一发现将带来巨大可能性COAD患者预后预测和准确的术后治疗。

2。材料和方法

2.1。结肠腺癌数据采集

四个数据集(GSE6988, GSE14297、GSE15781 GSE44076)包含对结肠癌基因表达数据和相关临床数据组织和正常肠上皮细胞从基因表达综合下载(地理;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。归一化数据被用于分析PPAR通路和下游基因表达模式在正常和肿瘤组织之间。总共有456 COAD RNA-seq TCGA数据下载的数据门户(https://portal.gdc.cancer.gov/)[11]。六个数据集包括COAD患者的预后信息作为外部验证军团(GSE12945、GSE17536 GSE33133, GSE39084, GSE39582,和GSE103479)也从地理下载。

2.2。通路富集分析

之间的差异表达基因结肠癌组织和正常肠上皮细胞是由使用R limma包”。“然后,”clusterProfiler“包(12在R被用来执行基因集富集分析(GSEA)。我们选择了四个途径最与PPARs密切相关分析(KEGG_PPAR_SIGNALING_PATHWAY PPAR-alpha目标基因,PPAR-delta目标基因,和目标基因γ- ppar)。通路基因集被从数据库中检索出来的分子签名(MSigDB) [13]或PPAR基因数据库。

2.3。PPAR Pathway-Related基因采购

我们收集了69 PPAR信号通路基因在基因和基因组的京都百科全书KEGG数据库KEGG_PPAR_SIGNALING_PATHWAY名义。此外,144 PPAR目标基因(40 PPAR-alpha目标基因,64 PPAR-delta目标基因,和69年目标基因)γ- PPAR从PPAR基因数据库下载(http://www.ppargene.org/)。在一起,我们有180 PPAR信号通过十字路口pathway-related基因预后信息。最后,我们把低表达基因( )140年获得PPAR信号pathway-related基因(PPAR-related基因)进行进一步分析。

2.4。预后分析

找到COAD预后相关基因的140个基因参与了PPAR信号通路,我们首先利用单变量Cox比例风险回归分析分析COAD患者的总体生存率(OS)基于这些140个基因的表达水平。最终,多变量Cox比例风险回归分析用于确定一个优化预测模型。我们叫这个评分模型作为“PPAR-Riskscore。”

患者的PPAR-Riskscore COAD成立由以下方程: ,在哪里表明基因的表达值 ;与此同时,意味着基因的系数产生的多变量Cox回归分析。根据风险评分的中值,样本分为两组(高和低风险组)。我们雇了一个接受者操作特征(ROC)曲线时间评估基因标记的特异性和敏感性预测1年,3年,5年OS COAD和他们其他临床指标相比,诸如年龄、性别、细分,和TNM阶段(II和III)。这种基因标记的预测能力是最终确认GSE12945, GSE17536, GSE33133 GSE39084, GSE39582, GSE103479军团。

2.5。GSVA和肿瘤浸润免疫细胞分析

调查PPAR-Riskscore之间的关系和生物通路,single-sample基因集富集分析(ssGSEA)曾使用“GSVA”R包分析这些样本的相关基因表达模式。分数相应功能,以及这些功能之间的相关性和风险评分,计算每个样本。GSVA,基因设置文件”http://c2.cp.kegg.v7.3.symbols。通用汽车从MSigDB获得的”。意义阈值被设定为 。此外,考虑到肿瘤免疫微环境的意义,CIBERSORT算法是用来评估22的渗透类型的免疫细胞。

2.6。化疗敏感性预测

我们利用GDSC数据库来确定每个COAD half-maximal抑制浓度(IC50)病人化疗药物预测化疗药物敏感性使用包检查化疗敏感性不同组之间的差异。统计学意义是定义为一个值< 0.05。

2.7。建设列线图

找出是否PPAR-Riskscore COAD患者是一个独立的预后因素,我们使用单变量和多变量Cox回归分析方法。组成的列线图风险评分和TNM阶段创建基于多元分析的结果predicting1, 3 - 5年的操作系统。和校准块用来评估真正的操作系统和nomogram-predicted之间的精度值。

2.8。统计分析

比较正态分布数据,学生的 - - - - - -测试或单向方差分析测试是利用。的Mann-Whitney测试或克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用于访问非正态的分布数据。nomogram-predicted建成使用“pRRophetic”包“rms”和Iasonos的指南。6.0 R软件(版本4.0.3)或GraphPad棱镜是用来进行统计检验和视觉分析。

3所示。结果

3.1。基因集富集分析PPAR结肠癌组织和正常肠上皮细胞之间的通路

我们选择四PPAR-related通路MSigDB调查PPAR的状态在结肠癌通路,包括“KEGG PPAR信号通路,”“PPAR-alpha目标基因,”“PPAR-delta目标基因,”和“目标γ- PPAR基因。“这些通路的改变在四个微阵列:检查GSE6988: 53 COAD与28日正常,GSE14297: 18 COAD与7正常,GSE15781: 22 COAD与20正常,和GSE44076: 98 COAD vs 98正常。GSEA的结果表明,这四个途径明显结肠癌组织中表达下调但正常上皮细胞(图1)。其中,PPAR-alpha目标是最显著下调(NES的值是最小的在三个军团,和它的值是显著的三四个军团)。另一方面,PPAR-delta目标未达到统计上的显著水平的三四个军团,和目标是γ- ppar的抑制趋势不明显。根据调查结果,PPAR途径和目标基因在结肠癌经常表达下调。我们可以发现更好的治疗目标和预后指标通过研究这些基因。

3.2。PPAR-Related基因的转录UCEC患者的预后有关

考克斯140年PPAR-related基因分析以识别PPAR-related TCGA基因与操作系统相关的数据集。首先,使用单变量Cox回归分析,7 PPAR-related基因显示出强烈的联系与COAD患者(图的结果2(一个))。然后,以确保7预后基因可靠、多变量cox单变量回归分析用于筛选基因没有过度拟合。最后,我们创建了一个名为PPAR-Riskscore的评分系统预测COAD病人的预后时间根据每个基因(图的相关系数2 (b))。

病人被分为高风险和低风险组基于PPAR-Riskscore中值。PPAR-Riskscore和病人生存状况的分布数据所示2 (c)和2 (d)。NR1D1一帮人被发现高危人群中高度表达,而TNFRSF1A和任是强烈表示低风险组,根据四种基因的表达模式的热图(图2 (e))。kaplan meier (km)曲线显示,患者的存活率低风险组显著大于患者的高危人群(图2 (f))。曲线下的面积(AUC)值为1年,3年,和5年生存的PPAR-Riskscore TCGA数据集分别为0.741,0.745和0.797,分别根据时间ROC分析,符合满意的模型性能( ;图2 (g))。因此,这些结果表明,我们可以成功地建立一个PPAR-related COAD预后模型有一定的适用性,其中NR1D1(核受体亚科1 D组1)成员,家族(integrin-linked激酶),TNFRSF1A(肿瘤坏死因子受体超家族,成员1 a),并任(肾素)可以有效的COAD患者预后因素。

3.3。独立PPAR-Riskscore的预后价值

之后,我们看着COAD病人临床特征之间的关系,风险评分,结果TCGA的队列证实PPAR-Riskscore-independent预后价值。使用单变量Cox回归分析,结果表明:TNM阶段(II和III)和风险与患者生存相关的得分都显著( )(图3(一个))。其他临床指标和操作系统有一定的相关性,但是他们没有达到统计学意义。这三个变量后来被添加为协变量的多变量Cox回归分析,结果显示PPAR-Riskscore是一个重要的独立危险因素COAD病人(图的操作系统3 (b))。PPAR-Riskscore的预测能力( ,95% - - - - - -1.685, )甚至高于TNM II期和III期。PPAR-Riskscore ( ,95% - - - - - -1.685, )COAD病人操作系统是一个独立的预测因素。

3.4。PPAR-Riskscore的外部验证

为了确定PPAR-Riskscore适用于其他COAD军团,我们利用外部数据来验证我们的发现。确认分析结果的准确性,我们就读六组,每50多个样本(GSE12945、GSE17536 GSE33133, GSE39084, GSE39582,和GSE103479)。基于PPAR-Riskscore,我们使用相同的程序将患者分为高位低风险组。不出所料,高危组患者有更高的死亡率在所有验证组( )(图4)。此外,我们使用PPAR-Riskscore预测患者的1 -,3 -和5年操作系统。PPAR-Riskscore AUC是0.6或更高版本在大多数ROC分析。根据研究结果,PPAR-Riskscore具有一些特定的实际应用价值在预测COAD病人预后。

3.5。PPAR-Riskscore识别患者的生物学特性不同

进一步评估患者的生物行为特征不同PPAR-Riskscore我们使用GSVA富集分析。PPAR-Riskscore高,患者的糖脂代谢,ECM-receptor交互,轴突引导,和粘着斑明显激活患者相比,低PPAR-Riskscore(图5)。看来高PPAR-Riskscore患者更有可能与癌症相关的信号通路有关,而嗅觉转导和细胞因子受体相互作用在患者高纯度低PPAR-Riskscore和更有可能与其他信号通路有关。

3.6。不同浸润患者的免疫细胞在肿瘤组织中不同PPAR-Riskscore

免疫细胞浸润时,CIBERSORT算法被用来调查如果PPAR-Riskscore可以准确地描述肿瘤微环境的特点(图6)。结果显示,患者的比例明显高于高PPAR-Riskscore M0巨噬细胞,而患者低PPAR-Riskscore CD4记忆T细胞的比例明显高于休息。众所周知,肿瘤相关巨噬细胞(tam) protumorigenic属性。此外,许多研究已经证明,CD4记忆T细胞激活是肿瘤治疗的一个关键工具。它可以杀死癌细胞直接或间接通过刺激和招募CD8 T细胞和其他免疫细胞14]。这表明PPAR-Riskscore,通过控制免疫细胞浸润,可能在COAD的发生和发展中发挥作用。

3.7。化疗反应分析

术后辅助化疗是主要的治疗方法对COAD病人;因此,我们研究了PPAR-Riskscore是否可以用来预测的敏感性高,低风险患者三种化疗药物通常用于COAD病人(图7)。基于PPAR-Riskscore,所有COAD样品被分成两组:那些在高风险和低风险。GDSC数据库的分析后,发现的IC50值常用化疗药物5 -氟尿嘧啶、伊立替康,铂与对照组相比升高COAD组。之间的关系这三个药物的IC50, PPAR-Riskscore然后使用相关分析研究。结果表明,PPAR-Riskscore越高,降低5 -氟尿嘧啶的IC50 ( )。结果表明,5 -氟尿嘧啶对高PPAR-Riskscore病人可能是一种有效的药物。

3.8。建设一个预后列线图

之后,我们开发了一种计算图表合并TNM阶段和PPAR-Riskscore作为两个独立的预后指标相关COAD病人1 - 3 - 5年的操作系统。这允许我们评估的能力PPAR-Riskscore可靠地预测临床预后,促进临床使用COAD(图8(一个))。患者的预后可能被加起来计算方程中的每一项的得分贡献。如图8 (b),幸存的时间点的标定块,表明诺模图有很好的预测能力。决定曲线研究的结果表明,我们的列线图的临床适用性超过了临床特征(图以压倒性优势胜出8 (c))。它表明,与临床结合PPAR-Riskscore参数预测预后,更多的患者可能受益于它。

4所示。讨论

PPARs已经从完全未知的受体主要演员在各种生理过程和病理的情况下在过去的二十年。这些受体在细胞分化和癌症是其最重要的功能之一。众多报道表明PPARs作为肿瘤抑制或肿瘤加速器,表明它们可能是用作癌症预防和治疗药物目标(15- - - - - -21]。PPAR的相关影响肿瘤的发展一直与细胞周期抑制相关基因如p18, p21和p27。它可以诱导细胞凋亡,抑制b细胞lymphoma-2 (bcl - 2),它还可以减少血管生成通过抑制血管内皮生长因子(VEGF) [22,23]。PPARα表达肝细胞、心肌细胞、近端肾小管细胞,褐色脂肪组织(24]。PPARβ/δ表达在一些组织和一些物种差异,而PPARγ在白色和褐色脂肪组织表达,肠道,免疫细胞与脂肪形成,脂质存储和葡萄糖稳态(25]。最近,一项研究表明,PPAR表达式是明确管制在结直肠癌(CRC), PPARα和PPARδ过表达,而PPARγ是CRC抑制肿瘤组织。更重要的是,PPAR异常在肿瘤组织中表达水平似乎与CRC发展和预后不良(26]。因此,我们需要发现,可靠地预测预后的生物标志物COAD病人为了保证病人得到更合适的和成功的治疗。

找到与PPAR COAD预后指标,140个基因涉及PPAR信号通路研究本研究利用COAD病人数据通过生物信息学方法。随后,我们确定小说的四个基因模型(TNFRSF1A NR1D1,同类,任),建立了一个名为PPAR-Riskscore预后模型。使用风险评分,COAD病人分为两组:那些在高风险和低风险。存活曲线分析显示,患者在高危人群比低风险组相当贫穷的结果。中华民国曲线表明,该模型具有良好的1 - 3 - 5年生存预测精度。根据多变量Cox回归分析,PPAR-Riskscore COAD是一个独立的危险因素。

PPAR-Riskscore基因中,NR1D1是研究最多的,它是PPAR-gamma-related通路的目标。核受体亚科1 D组的成员(NR1D1;REV-ERBα)是核受体,控制各种生理功能(27]。它也被认为有在癌症中的作用。许多恶性肿瘤被药理激活NR1D1 [28]。一个研究发现,NR1D1干扰DDR复合物受损DNA的招聘地点,因此损害正常的DNA修复。除了这个,这是表明NR1D1改善乳腺癌细胞DNA损害化疗的敏感性,因此增加的可能性PCR在乳腺癌患者29日]。另一个研究表明,NR1D1抑制激活JAK / STAT3信号通路的移植SOCS3的表达,从而抑制卵巢癌细胞生长和诱导细胞凋亡。通过使用免疫组织化学和其他技术,x王等人发现REV-ERB的表达在胃癌组织减少。在胃癌中,研究者发现REV-ERB表达式是显著相关的分化较差,TMN阶段,淋巴结转移。此外,它已被证明,REV-ERB表达与患者生存时间显著相关,表明REV-ERB胃癌预后的可能是一个因素在一个独立的基础上(30.]。

同类,PPAR的目标β/δ有关的通路,是一个59 kDa丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,结合整合蛋白的胞质域β1,β3和细胞膜附近分布在细胞质中。致癌作用的过程中,进展和转移过程,它有双重对细胞的影响。一系列信号转导途径是由家族,也形成了一个支架与细胞骨架蛋白质复杂,所有这些都是至关重要的细胞活性、肿瘤生长和入侵31日]。家族是最近发现的过表达在一些癌症(前列腺32),卵巢33],乳腺癌[34),结肠(35)、肺(36),和甲状腺37]),导致其扩散、入侵和转移通过调节EMT-related基因。EMT是一个关键的过程驱动癌症发生和进展。目前,它已经证明,亲属与结直肠癌相关。病理结果所示,同类高表达水平与CRC阶段,淋巴结转移,和患者生存38]。体外CRC沈等人的研究也显示,过度的亲属可能刺激CRC细胞(EMT的发展35]。此外,相同的表达式是调节在卵巢癌,并且与肿瘤发展正相关。人类卵巢癌细胞的体内肿瘤发生是由相同的基因沉默抑制(33]。相反,据报道,失去亲属废除mechanosensing能力和致瘤的转移性乳腺癌细胞和块潜在的(34]。

肿瘤坏死因子-α和任也PPAR-gamma-related通路的目标,和TNF -α是一个高度活跃的细胞因子参与坏死或凋亡细胞的信号通路(39]。肿瘤坏死因子-α是一种内源性肿瘤促进剂,是由肿瘤细胞或细胞肿瘤微环境。TNFRSF1A被认为是占主导地位的信号受体细胞因子TNF -α。当肿瘤坏死因子-α结合TNFRSF1A,激活转录因子NF-B,介导细胞凋亡,调节炎症(40]。在这项研究中,杨et al .,识别TNFRSF1A WGCNA等生物信息学分析表明,TNFRSF1A是神经胶质瘤样本中高度表达的表达与正常的大脑样本。此外,TNFRSF1A的表达水平与年级和其他相关临床参数,并显示一个独立预测因素。击倒的TNFRSF1A抑制神经胶质瘤细胞株体外增殖和迁移。这些发现表明,TNFRSF1A可能是一个有前途的生物标志物的诊断、治疗和预后的间叶细胞亚型神经胶质瘤(41]。由于任肿瘤抑制功能的破坏人类成神经管细胞瘤所示,是否这个基因是参与小脑gcp的形成。通过超表达和功能基因敲除研究,阿金逖等人证明了任促进经济增长停滞,分化,细胞凋亡和显示,任损失可能释放的抑制Hedgehog途径,促进肿瘤发生。

根据上面的信息,目标基因用于构造模型的研究已经获得了不同程度的关注和调查各种癌症。PPAR-Riskscore(图是一个独立的预后因素3)。所示的工具是能够进一步预测肿瘤患者生存概率相同的阶段,所以它有一个高水平的临床价值。我们进行了基因变异分析(图5)不同PPAR-Riskscore理解患者的生物学特性。结果表明,醣脂类代谢等途径ECM-receptor交互,轴突引导,和粘着斑PPAR-Riskscore明显调节患者高。此外,我们开发了一种计算图表来提高预测精度,便于临床应用。对癌症的预后,诺模图被广泛使用。使用统计方法,它结合了参数来预测患者的预后。校准曲线是用来分析图表和决定我们的诺模图。结果表明,计算图表更准确,可以造福更多的病人比简单地使用一个因素。

值得注意的是,这项研究提出了限制:(1)转录组数据用于模型通过测序获得的。参数可能需要调整,如果微阵列和qPCR是用来计算PPAR-Riskscore。(2)需要确定一个合适的截止值与一个更大的群体。(3)病人人口是异构的回顾性分析。因此,需要更多的临床研究来验证预测的效率在这项研究中开发的工具和计算图表。

5。结论

总之,我们的PPAR基因表达评分系统是一个有价值的工具,用于预测COAD病人生存。它也可以帮助治疗化疗通过评估分数。然而,需要更多的临床试验来证实我们的发现。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(82072620)、广东省自然科学基金(2021 a1515011357)和广州市科技项目(202102010158)。