文摘

病变引起的高葡萄糖(HG)、缺氧/再灌注(H / R)和心肌细胞共存的条件与生产过剩的活性氧(ROS),造成不可挽回的损害,心肌细胞及其超微结构的大分子。非诺贝特,一个过氧物酶体proliferator-activatedα受体(PPARα)受体激动剂,促进有益活动抵消心脏损伤。因此,这项工作的目的是确定潜在的保护作用的非诺贝特心肌细胞暴露于汞、H / R)和HG + H / R。心肌细胞培养被分成四个主要组:(1)控制(CT), (2) HG(25毫米),(3)H / R,和(4)HG + H / R。我们的研究结果表明,细胞生存能力减少心肌细胞发生汞、H / R)和两种情况下,而非诺贝特提高细胞生存能力在任何情况下。非诺贝特也能减少ROS生产以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH)亚基表达。关于抗氧化防御,超氧化物歧化酶(SOD铜^{2 +}/锌^{2 +}和SOD Mn^{2 +})、过氧化氢酶和抗氧化能力的下降在HG, H / R)和HG + H / R-exposed心肌细胞,而非诺贝特增加这些参数。核转录因子的表达红色的两个相关因子2 (Nrf2)显著增加细胞治疗,而病态抑制剂Keap1的表达增加。氧化应激在fenofibrate-exposed心肌细胞线粒体损伤较低。内皮一氧化氮合酶也喜欢在心肌细胞与非诺贝特治疗。我们的研究结果表明,非诺贝特保留了抗氧化状态和心肌细胞的超微结构发生HG, H / R)和HG + H / R防止损害重要大分子参与心肌细胞的正常运转。

1。介绍

糖尿病是变得越来越流行,提高心血管风险发展心肌缺血和慢性心力衰竭预后差和生存1]。葡萄糖代谢和恶化糖尿病心肌缺血再灌注损伤的提高氧活性物种(ROS)的生产,导致氧化应激,导致生化和结构损害心脏功能的变化2,3]。

高血糖和低氧诱导生产过剩的阴离子超氧化物破坏细胞器和大分子重要细胞生存脂质、酶、蛋白质和DNA (4]。这个过程的关键参与者是各种NADPH氧化酶的活化在心血管细胞亚型(5,6]。在这方面,生产过剩的活性氧被广泛报道促进以挪士的解偶联二聚体;进一步增加超氧化物阴离子生产(7]。此外,存在低氧诱导因子- 1 (HIF-1α)增加缺氧,为了调节大量基因,帮助细胞应对氧限制(8]。为了减少活性氧的生产,需要激活和/或增加抗氧化防御或减少氧化应激(9]。因此,新颖的治疗策略需要保护心肌对缺血再灌注(I / R)损伤的影响在高血糖的条件。

药理目标来对抗氧化应激损伤可能是过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)核蛋白质作为转录因子(10,11]。除了参与脂类代谢PPARs扮演一个数量的多效性的影响,包括心肌健康的重要作用,并影响生产的细胞因子和生长因子释放,导致抗炎和抗增殖效果(12]。三个主要类型的PPARs由单独的基因编码,其产品已确定PPARα(PPARα),PPARγ(PPARγ),PPARβ/δ(PPARβ/δ)[13]。PPAR的激活α介导作用的分解代谢脂肪酸通过刺激线粒体脂质氧化(14]。在以前的作品(15,16我们表明,在活的有机体内激活PPARα调节心脏生产活性氧、抗氧化酶的表达。非诺贝特,PPARα受体激动剂,临床上用于30多年来降低甘油三酯和胆固醇水平在患者心血管疾病的风险,显示成功保护的有害影响I / R在实验设置(17,18]。值得注意的是,非诺贝特拥有PPARα介导的抗炎、抗氧化剂和antifibrotic效果可能占其直接护心(10,11]。此外,非诺贝特支持心脏功能,改善缺血后功能恢复在食源性肥胖老鼠19]。另外,非诺贝特治疗防止isoproterenol-induced心肌梗死(20.),但也可以抑制reperfusion-induced心律失常在孤立的老鼠的心脏21]。

然而,到目前为止,没有一项研究分析了非诺贝特的影响在培养的心肌细胞进行H / R, HG,这些条件的组合(HG + H / R)。后者可以允许我们繁殖在活的有机体内观察到的特性和可能是一个在体外模型进行进一步的研究。因此,研究的目的是描述非诺贝特治疗对氧化应激的影响和结构损伤心肌细胞受到hypoxia-reperfusion、高葡萄糖和两种情况下的组合。

2。材料和方法

2.1。动物

新生儿男女Wistar鼠(1 - 3天),由动物设施提供研究和先进的研究中心全国理工学院(CINVESTAV),被用来获得心肌细胞。后的协议进行了机构伦理委员会的指导方针(协议编号0270/18),以及那些墨西哥官方标准的实验动物的使用和护理笔名动物园- 062 - 1999。

2.2。新生大鼠心肌细胞(NRCM)隔离和文化

如前所述(22从心脏),医疗保险是孤立的1 -抱Wistar鼠。全部去除心被剁碎,心室消化四次15分钟用胰蛋白酶(美国0.25%的表达载体,卡尔斯巴德,CA)在一个无菌的环境。在细胞培养中细胞孵化90分钟烧瓶,允许非心脏细胞(主要是心脏成纤维细胞)坚持塑料。医疗保险在不会培养介质(1 x)营养混合物(火腿)与谷酰胺(美国Gibco沃尔瑟姆,MA)包含5.5更易/ L d -葡萄糖补充heat-inactivated 10%胎牛血清(美国的边后卫,表达载体,卡尔斯巴德,CA), 100 U /毫升的青霉素和链霉素的100 mg / L(美国Gibco沃尔瑟姆,MA)。医疗保险( 细胞)被置于six-well培养板和孵化37°C在湿润的气氛中(5%股份有限公司₂/ 95%啊₂)。实验进行殴打和汇合的单层膜的第3,第5天文化。细胞培养被细分为以下实验组:(1)控制处理车辆DMSO溶液(0.1%)(control-DMSO),(2)控制与非诺贝特治疗(10μ米)(control-Feno),(3)控制治疗甘露醇(19.5毫米)(control-mannitol),(4)缺氧/再灌注处理DMSO溶液(0.1%)(H / R-DMSO), (5) H / R与非诺贝特治疗(10μ米)(H / R-Feno),(6)高葡萄糖(25毫米)处理DMSO溶液(0.1%)(HG-DMSO),(7)高葡萄糖(25毫米)与非诺贝特治疗(10μ米)(HG-Feno),(8)高葡萄糖(25毫米)+缺氧/再灌注治疗DMSO溶液(0.1%)(HG + H / R-DMSO)和(9)高葡萄糖25毫米与非诺贝特(10 +缺氧/再灌注治疗μ米)(HG + H / R-Feno)(图1)。高葡萄糖是由孵化细胞48小时不会中包含25更易/ L的葡萄糖(在200 g / L(+)葡萄糖,Gibco,沃尔瑟姆,妈,美国)。生产H / R,细胞培养是盖玻片覆盖了两个小时(23,24]。之后,盖玻片被除去,这些细胞被reoxygenated 1小时。车辆(DMSO溶液,0.1%)或非诺贝特(10μ米, ,Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)是根据图管理1。

为了探索hyperosmolarity,细胞暴露于甘露醇(19.5毫米,D-mannitol Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.3。细胞生存能力

细胞生存能力是根据闪光灯和克劳利et al。25,26]。体积为0.1毫升的0.4%台盼蓝加入1毫升的细胞( 细胞)。一个整除的50μL细胞加载在纽鲍尔室(纽鲍尔,Marienfeld, 0.0025毫米²;Wollerspfad Lauda-Konigshofen、德国)和立即在放大10倍显微镜下检查。中细胞的数量(死亡)和细胞数的总数。细胞生存能力必须至少有95%认为健康的对数期的文化。

2.4。实时聚合酶链反应

使用试剂盒试剂(美国热费希尔科学,罗克福德,IL), RNA是隔绝的 从不同的实验组,每组细胞。RNA的完整性检查1%的琼脂糖凝胶。首先,用逆转录酶反应(RT)为2.5μg 200 U的存在的总RNA逆转录酶(RT) Moloney小鼠白血病病毒(MMLV)(美国英杰公司)进行。HIF-1的数量α信使rna被实时PCR在7000年ABI棱镜量化序列检测系统(TaqMan ABI,促进城市、钙、美国)通过反应SYBR绿色。作为一个内生控制,GAPDH和HIF-1的序列α矿车使用以下:ATACCAGCAGTAACCAGCCG(意义)和CTGTGGCTGAGAGTCCTTCG(反义)。计算方法HIF-1的数量α是(增加循环阈值)27]。

2.5。ROS生产

心肌细胞( )从不同的实验与PBS组清洗和孵化30分钟在黑暗中与CellRox™绿色试剂(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)的最终浓度5μm .孵化后,介质被移除,PBS的细胞被洗两次,1毫升的PBS刮掉,放置在黑暗的埃普多夫管。随后,发出的荧光CellRox指示器的自由基的相互作用决定了流式细胞分析仪(加利福尼亚州圣何塞FACSCalibur模型、BD生物科学,美国)和CellQuest分析程序(BD生物科学、圣地亚哥、钙、美国)。结果计算的几何平均荧光(MF) 3000年FL1事件,通过地区及其荧光直方图,荧光峰的位移在哪里观察根据每个单元中的治疗组含有CellRox指标,他们所有人与一群细胞的固有荧光相比没有孵化的指标(28,29日]。

2.6。通过免疫印迹蛋白质表达

总蛋白质含量的文化由BCA蛋白量化分析工具(美国马皮尔斯,沃尔瑟姆)之前报道(30.]。蛋白质从细胞溶解产物(80μ克的蛋白质)受到12% sds - page凝胶分离为2小时(100 V),其次是electrotransfer到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(0.45μm,微孔,Billerica,妈,美国)在10 V 1小时。为了阻止非特定的绑定,膜是孵化5%脱脂牛奶(Bio-Rad、大力神、钙、美国)PBS-Tween 0.1%报道。墨迹是探测特定的抗体β肌动蛋白(1:5000),HIF-1α(1:100),SOD铜^{2 +}/锌^{2 +}(1:100),SOD锰^{2 +}(1:100),p47phox (1: 100), NOX4(1: 100),以挪士(1:100),p-eNOS^{Ser 1177}(1:100),PPARα(1:50),Nrf2 (1: 50), Keap1(1: 50)(圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国),和p-PPARα^Ser12(Abcam,剑桥,英国)。西方化学发光信号被检测到的止动剂合衬底(美国微孔,Billerica的)。图像从每部电影获得了gs - 800密度计(包括数量从Bio-Rad实验室、一个软件公司,大力神,CA,美国)。屁股被和reincubatedβ肌动蛋白抗体作为负载控制。每个乐队的密度值表示为任意单位。

2.7。抗氧化能力测定

总抗氧化能力测定的方法描述Apak et al。31日]。简单地说,一个暂停 细胞之前离心机1500 rpm / 10分钟与145年被稀释μL 0.1磷酸盐缓冲剂的pH值7.5和震动500 rpm为200秒。100年μ50 L的稀释样本进一步处理μL (CuCl 0.01米₂和震动500 rpm,持续200秒。然后,50μL 0.01 batocuproin添加和涡在500 rpm为200秒。铜的浓度^{2 +}减少到铜⁺光谱仪的测量通过490海里(美国DW2000, SLM-Aminco乌尔班纳,IL)。总抗氧化能力表示为μ铜的摩尔/升^{2 +}减少到铜⁺和计算如下: TAC是总抗氧化能力,发出的荧光差异( ),DF是稀释系数( ),铜和extinction-emission的动力学因素^{2 +}batocuproin复杂是641.8629μmol / L。

2.8。量化的丙二醛

丙二醛(MDA)是由心肌细胞的毛细管区带电泳( 从每个实验组细胞)获得,被Sanchez-Aguilar et al。30.]。样本与冷甲醇脱去蛋白质(1:1),离心机 15分钟,透过一个0.22μm硝化纤维膜过滤器(美国微孔,Billerica的)。与冷稀释(1:10)氢氧化钠(0.1米)和分析在P / ACE™最小检测量毛细管电泳系统(美国加州贝克曼库尔特)在下列条件:样本下注入流体压力在0.5 psi / 10 s。分离了-25 kV 4分钟267海里。运行与0.1之间的毛细管被氢氧化钠2分钟,2分钟的蒸馏水,磷酸盐缓冲4分钟。MDA是表达的浓度μM和决心用标准曲线插值。

2.9。量化的8-Hydroxy-2 - - - - - -脱氧鸟苷

8-Hydroxy-2 - - - - - -脱氧鸟苷(8-OH-2dG)是由毛细管区带电泳和紫外检测,通过所述二极管阵列Sanchez-Aguilar et al。30.]。心肌细胞的样本( 从每个实验组细胞)与20%三氯乙酸脱去蛋白质(10:1)。这是离心机在 15分钟和0.22过滤μm硝化纤维膜过滤器。样本分析P / ACE™最小检测量毛细管电泳系统(美国贝克曼库尔特,CA)。毛细管的先决条件是通过2 M氢氧化钠溶液为30分钟,然后去离子水为30分钟,最后运行缓冲(10毫米硼酸盐,pH值9.0)30分钟。下的样本注入流体压力在0.5 psi / 10 s。分离进行了20 kV 8分钟200海里。之间的毛细管被运行和2 M氢氧化钠为2分钟2分钟和蒸馏水。结果表达pmol /毫升。8-OH-2dG决心的浓度标准曲线插值的值。

2.10。毛细管区带电泳BH的决心₄和黑洞₂

黑洞的内容₄和黑洞₂从每个实验组心肌细胞测定所描述的Ibarra-Lara et al。16]。简单地说,50μL示例包含 细胞脱去蛋白质与冷甲醇(1:1/)和离心机 15分钟10°C和过滤硝化纤维素膜(0.22μ美国m,微孔,Billerica的)。测量了用P / ACE™最小检测量毛细管电泳系统(贝克曼库尔特,墨西哥城,墨西哥),与激光诱导荧光检测。黑洞的标准曲线₂和黑洞₄(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)被用来计算浓度。数据表示为pmol /毫克的蛋白质的黑洞₄和黑洞₂。

2.11。电子显微镜

电子显微镜是用来评估心肌细胞的超微结构。我们跟着Ibarra-Lara描述的方法等。16)使用 细胞。评价是杰姆1011 (JEOL有限公司,日本东京)60千伏。使用的放大50000倍。

2.12。数据分析

数据呈现的 6个独立的实验。差异分析的组双向方差分析(双向方差分析)其次是图基的事后测试。统计学意义是当接受 。两组之间的比较,一个未配对的学生 - - - - - -测试使用。

3所示。结果

3.1。HIF-1α评价

来确定使用的方法诱导缺氧(盖玻片)是有效的,我们确定HIF-1的表达α。这种决心通过qPCR和免疫印迹。我们的结果表明,HIF-1信使rna和蛋白质α显著增加在文化接受hypoxia-reperfusion相比控制(数据吗2(一个)和2 (b))。这些结果表明,该方法用于产生缺氧(盖玻片)是有效的。

3.2。评价细胞生存能力

决定细胞生存能力,我们用台盼蓝染色技术。因此,我们的研究结果表明,心肌细胞在DMSO溶液,非诺贝特,或甘露醇表现出细胞生存能力高于95%,表明细胞培养是在最优条件下,治疗没有表露出任何的伤害。另一方面,心肌细胞暴露于H / R, HG, HG + H / R表现出较低的细胞生存能力与对照组相比。非诺贝特政府H / R组能够防止细胞死亡。另外,我们观察到,HG细胞暴露于非诺贝特表现出可行性与那些HG-DMSO-exposed心肌细胞(图3),结果表明缺乏fenofibrate-induced一旦完成了高血糖诱导损伤的影响。值得一提的是,甘露醇不诱导细胞生存能力丧失,排除hyperosmolarity过程负责细胞死亡和确认高葡萄糖的有害影响本身。非诺贝特效应组中可以观察到两种情况下,增加细胞生存能力;这个结果是不同于HG + H / R-DMSO组,表明非诺贝特可能有助于维持细胞生存能力后H / R虽然高葡萄糖存在。

3.3。活性氧的生产

如图4,非诺贝特对活性氧的影响生产决心在H / R, HG, HG + H / R条件。我们的结果表明,H / R, HG,两者的共存条件下显著增加活性氧的生产。非诺贝特治疗减少ROS生产尽管病理条件(数据的存在4(一)- - - - - -4 (c))。

3.4。评价抗氧化的效果

探索PPAR的角色α在抗氧化防御,SOD铜的表达^{2 +}/锌^{2 +}、SOD锰^{2 +}和过氧化氢酶测定在不同的组。结果表明,抗氧化酶的表达减少HG, H / R)和HG + H / R组。有趣的是,非诺贝特治疗显著增加杆和过氧化氢酶(数字的表达5(一个)- - - - - -5 (c))。这些结果表明,PPAR的激活α由非诺贝特减少氧化应激由于增加抗氧化酶的表达。为了进一步调查非诺贝特的抗氧化机制,Keap1 / Nrf2通路的表达。我们的研究结果表明,心肌细胞在病理条件下(HG、H / R和HG + H / R), Nrf2表现出较低的表达,而非诺贝特增加了表达(图5 (d))。非诺贝特治疗减少Keap1表达式(图5 (e))。正如所料,非诺贝特治疗增加的总抗氧化能力HG, H / R)和HG + H / R(图5 (f))。因此,非诺贝特支持抗氧化剂环境培养的心肌细胞。

3.5。评价NADPH亚基的表达

由于NADPH氧化酶的相关性p47phox NOX4-subunits,我们评估他们的表现。控制心肌细胞,我们没有观察到这些蛋白的表达。有趣的是,在H / R、汞和汞+ H / R-exposed心肌细胞NADPH亚基的表达显著增加。值得注意的是,这种效果是阻止非诺贝特(数字6(一)和6 (b))。

3.6。非诺贝特对丙二醛的影响,8-Hydroxy-2-Desoxyguanosine黑洞₄,黑洞₂

活性氧可能与几个目标细胞。同样,脂质、DNA和代谢物是氧化作用,修改他们的生理作用。脂质损伤指标,MDA,发现增加H / R,汞、和HG + H / R组,而控制。此外,在每个心肌细胞MDA显著降低文化(H / R、汞和汞柱+ H / R)孵化与非诺贝特(图7(一))。对DNA的影响也是通过评估的存在8-hydroxy-2-desoxyguanosine (8-OH-2dG)对DNA氧化损伤的一个重要标志。我们的结果表明,该参数增加H / R, HG, HG + H / R组。有趣的是,PPAR的刺激α由非诺贝特显著降低这个DNA损伤标记(图的值7 (b))。为了产生一氧化氮(NO)、内皮一氧化氮合酶(以挪士)需要辅助因子如黑洞₄。然而,这个分子是非常容易被氧化黑洞₂,促进非耦合状态以挪士无法合成没有,而是生产O₂^{•- - - - - -}。因此,黑洞的浓度₄和黑洞₂是由毛细管区带电泳。结果表明,H / R, HG或共存的实验条件诱导显著衰减的黑洞₄的水平。此外,非诺贝特治疗预防黑洞的氧化₄(图7 (c))。另一方面,黑洞₂水平增加汞和汞+ H / R组。再一次,非诺贝特维护这个参数水平与对照组(图相似7 (d))。这些结果表明,非诺贝特喜欢一个eNOS-coupled状态由于低氧化的黑洞₄在这一过程中氧化应激。

3.7。以挪士和P-eNOS评估表达式^Ser1177

图8显示了非诺贝特对以挪士和p-eNOS的影响^Ser1177表达式的HG、H / R和HG + H / R组。我们的结果表明,以挪士表达式是受到汞、H / R,病理因素的组合在nonphosphorylated(以挪士)和磷酸化(p-eNOS^Ser1177)表现出减少他们的表现形式。正如所料,非诺贝特治疗显著增加以挪士的表达和p-eNOS^Ser1177这表明PPARα激活潜在增加NO-bioavailability(数字8(一个)和8 (b))。

3.8。评价PPAR的表达α和p-PPARα^Ser12

为了调查非诺贝特能够刺激PPARα,我们评估它的表达式以及p-PPARα^Ser12,fibrate行动的一个标志。在图所示9(一个),H / R、汞和汞+ H / R组PPAR的下行趋势α表达式。在图9 (b),我们可以观察p-PPAR的低调αSer12表达式在H / R, HG, HG + H / R组。然而,非诺贝特显著增加PPAR的表达α和p-PPARα^Ser12,这表明非诺贝特能够达到目标和激活它。

3.9。评价心肌细胞的超微结构

在控制和control-fenofibrate组观察到,有一个线粒体均匀分布,以及连续膜(图10 ())。心肌细胞受到H / R表现出管状线粒体脊和密度小于控制。此外,有一个清空的内容和膜表现出不连续边界。另一方面,非诺贝特改善线粒体的条件培养细胞暴露于H / R,被观察到密集的拉长,虽然略有缩小。在这种情况下,内外膜表现出连续的边界。这些特征表明,线粒体功能(图10 (b))。暴露于汞引起小和线粒体肿胀,空泡形成的迹象(图10 (c))。HG-fenofibrate-exposed心肌细胞中,观察到线粒体是正常的在大小和密度,表明线粒体功能。心肌细胞受到HG + H / R表现出小线粒体和细胞溶解,进一步表明共存的实验条件损害心肌细胞的超微结构。心肌细胞暴露于汞+ H / R和对待非诺贝特小,但表现出密集的线粒体膜的不中断。这些结果表明,非诺贝特保护心肌细胞,尤其是线粒体HG和H / R-induced损害(图10 (d))。

4所示。讨论

在目前的工作,我们建立了一个在体外模型采用新生大鼠心肌细胞暴露于汞、H / R,两者的结合条件模拟病理特性出现在糖尿病和心肌梗死。在这些条件下,我们证明了非诺贝特治疗对心肌细胞的保护作用,促进抗氧化剂环境和保护线粒体超微结构,通过upregulation主抗氧化基因PPARα和Nrf2事件,导致细胞死亡的衰减引起的HG + H / R损伤。

几个实验模型重现,在不同层次,病理条件出现在糖尿病(DM)和心肌梗死(MI)。当执行细胞培养时,生理,生化,遗传细胞保持最大的属性。此外,维护组织的架构特点,保持细胞间的相互作用。细胞培养的优势在于比其他模型的精确和精细控制实验条件在细胞环境(pH值、温度、渗透压、氧气水平有限公司₂等)(32]。据皮特和Toombs缺氧/再灌注在细胞培养可以由将盖玻片上的媒体;它制造了一个障碍,氧气的扩散,立即产生缺氧和代谢副产品,因此类似于缺血的条件在活的有机体内。与此同时,再灌注是通过恢复氧气浓度(23]。

高血糖症是一种急性心肌梗死的重要危险因素。它能增强氧化应激,刺激一氧化氮合酶解偶联,增加线粒体错乱,和损害prosurvival糖尿病心肌细胞信号,使它更容易受到缺血再灌注损伤(33]。烹调的菜肴等人发现,HG治疗敏感的成人心肌细胞缺血/再灌注(I / R)损伤(34]。

心肌缺氧导致代谢变化和不可逆转的损伤导致心肌细胞死亡(35]。缺氧不仅损害心脏,其他器官;非诺贝特已经尝试和用作药物的选择,以减少H / R的影响在不同的器官,如证明了Bhalodia et al .,谁提供的证据表明,非诺贝特对renoprotective影响缺氧/再灌注损伤(H / R)。因此,这种药物不仅保护心脏免受H / R也保护肾脏受到相同条件下(36]。非诺贝特报道促进一种抗氧化剂,抗炎,anti-ischemic效果在肠道红外损伤大鼠模型37),改善肠道恢复和肠上皮细胞营业额。此外,有研究指出多向性的血管内皮保护和抗高血压的行为非诺贝特(38]。

在我们的研究中,成功的技术用于生产评估HIF-1缺氧了α表达式。HIF-1α是一种转录因子,调节细胞对缺氧的反应和行为作为管理者的氧气体内平衡。我们的结果表明,该方法用于生产低氧(盖玻片)显著增加这个因素的表达在细胞培养受到缺氧(数字2(一个)和2 (b))。这个结果是同意,由贾et al。39]。他们研究了肠道缺血/再灌注大鼠模型(我:1小时/ R: 2小时),和他们的研究结果表明,HIF-1的表达α增加大鼠与I / R比控制。

它被广泛报道,H / R引起细胞死亡。接受良好的技术来评估这一事件的细胞排斥台盼蓝染料使用Zhang et al。6),H9c2细胞H / R和HG(55更易/ L)。我们的结果重现HG和H / R的不利影响,由Zhang et al。报道,展示事件的扩展,当两个病理因素共存。我们注意到,在这些心肌细胞暴露48小时HG,最近非诺贝特(4小时),没有保护(图3)。施加影响的可能,缺乏非诺贝特将相关的高血糖诱导代谢记忆。这种代谢记忆增加纤连蛋白,炎症介质,血管内皮生长因子,和细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1);这些影响是持续血糖水平正常化后数天到数周不等的窗口(40,41]。根据金等。42)、慢性高葡萄糖减少PPAR绑定到目标基因。

我们的研究结果表明,H / R, HG,两者的结合增加了活性氧的生产条件(图4)。这个结果类似于通过王et al。43)观察到更高水平的ROS H9C2细胞受到H / R相比控制细胞培养。作者还报道了SOD Mn的表达减弱^{2 +},导致心肌细胞氧化损伤。类似的结果是通过周et al。44]从Sprague-Dawley老鼠心肌细胞暴露于汞(30更易/ L)。我们的研究扩展这些观察到两者的结合病理条件和非诺贝特治疗对氧化应激的影响,显示增加抗氧化酶的表达以及提高抗氧化能力(数据5(一个),5 (b),5 (c),5 (f))。Keap1的表达/ Nrf2也被评估。转录因子Nrf2调节许多解毒和抗氧化基因的诱导表达。它绑定到一个特定的DNA序列称为是(抗氧化反应元素),可以激活几个electrophils和氧化剂不同化学性质的化合物。Nrf2激活持续压抑的绑定与胞质蛋白被称为Keap1和细胞骨架。这种交互促进永久Nrf2由蛋白酶体降解,这意味着Nrf2的主要控制函数位于其亚细胞分布,而在它的从头合成。此外,有人建议Keap1 / Nrf2系统有助于疾病如糖尿病和缺血的保护。事实上,Nrf2-mediated抗氧化反应的一个主要细胞防御机制,促进了细胞毒性攻击下生存45]。我们的结果表明,这个因素减少汞、H / R,和共存的条件;然而,非诺贝特治疗显著增加其表达(图5 (d))。他等。45从Nrf2]培养心肌细胞^{- / -}击倒(KO)和野生型小鼠(WT),然后把它们暴露于汞水平(40毫米)。心肌细胞缺乏的表达Nrf2相比呈现了显著的高水平的ROS WT心肌细胞的文化。Nrf2中也扮演了重要的角色在心脏保护H / R。徐et al。46)表明,Nrf2 KO小鼠开发了一个大的梗塞大小后缺血/再灌注。此外,最近的一项研究[47]表明,非诺贝特变弱氧化应激在糖尿病性视网膜病变Keap1 / Nrf2,表明心肌细胞刺激,非诺贝特免受氧化应激通路,包括Nrf2。我们的研究结果还表明,Keap1增加心肌细胞在病理条件下,而非诺贝特治疗减少了它的表达式。这个结果是类似于吴发现et al。48),PPARα调节通路Keap1 / NRF2。

最活跃的酶之一ROS生产NADPH氧化酶(49,50]。我们的结果表明,心肌细胞暴露在H / R,汞、和HG + H / R中NADPH氧化酶亚基,即47 phox NOX4,事件,减少了非诺贝特刺激(图6)。目前从我们的实验结果同意先前的报告显示,安妥明治疗Wistar鼠受到心肌梗死降低NADPH氧化酶亚基的表达(15]。

在我们的研究中,我们评估了损害重要的脂质等大分子在细胞和DNA。我们的研究结果表明,H / R, HG, HG + H / R-induced脂质和DNA损伤增加(数据7(一)和7 (b)),以及代数余子式的氧化黑洞₄,这是观察黑洞的增加内容₂(数据7 (c)和7 (d))。非诺贝特的刺激减少了这些分子的氧化损伤。先前的研究[51,52)表明,黑洞的生物利用度较低₄不仅可以防止形成以挪士没有,但也会增加活性氧的形成,进一步产生心肌细胞损伤。此外,先前的报道(53)表明,缺氧激活细胞蛋白酶降解以挪士。戈雅et al。54PPAR]表明WY14643α受体激动剂,增加以挪士牛主动脉内皮细胞的表达。同意戈雅的观察et al .,我们的数据表明,心肌细胞暴露于非诺贝特提出以挪士和p-eNOS^Ser1177尽管接触病理条件(HG, H / R, HG + H / R)(数据8(一个)和8 (b))。

重要的是,据报道,PPAR的磷酸化αSer12增加其活动和与transactivation PPAR的增加α在心肌细胞(55]。我们的研究结果表明,非诺贝特增加PPAR的表达α和p-PPARα^Ser12,而H / R、HG、减少两者的结合条件表达式(数字9(一个)和9 (b))。p-PPAR上升α^Ser12,因此PPAR的激活α,与抗氧化酶的表达增加(SOD和过氧化氢酶)和转录因子如Nrf2,已报告包含PPAR响应元素序列。因此,PPAR的激活α是心脏基本功能通过促进活性氧和抗氧化剂之间的稳态平衡(56,57]。

非诺贝特的线粒体损伤引起的汞、H / R,共存的病理因素(图10)。我们假设损伤心肌细胞中观察到低是由于(1)减少氧化应激,降低NADPH氧化酶酶亚基的表达的结果和更高的抗氧化防御,Nrf2扮演重要的角色;(2)低损伤膜脂质等大分子和DNA;和(3)p-eNOS的高表达^Ser1177。这些事件可能导致线粒体的保护,进一步支持的报告Holmstrom et al。58李,et al。59],Ilangovan et al。60]。

目前,有人类研究证明非诺贝特的有效性;例如,控制糖尿病心血管风险行动研究(协议)演示了一个减少40%增生性糖尿病性视网膜病变的进展在2型糖尿病患者使用非诺贝特治疗(61年]。非诺贝特干预减少心肌梗塞的发生率,降低后续临床心血管事件的风险在2型糖尿病患者62年]。

然而,使用非诺贝特减少糖尿病患者心血管事件的发病率一直存在争议的非均质性治疗在临床试验的反应63年,64年]。

总之,在病态下研究非诺贝特的影响见图11。

5。结论

根据我们的结果,我们可以得出结论,H / R, HG,病态的共处在心肌细胞产生氧化应激导致细胞生存能力降低。此外,非诺贝特治疗提高细胞生存能力和环境支持抗氧化剂有助于保护心脏超微结构。

数据可用性

在研究过程中生成的数据集是可从相应的作者合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

法比Cortes-Lopez和艾丽西亚Sanchez-Mendoza同样这项工作。

确认

本研究支持Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia-Mexico (CONACyT-Mexico)研究经费222720和280458 m。