PPAR-γ激动剂吡格列酮降低CD68 +而不是CD163 +巨噬细胞浸润真皮肥胖银屑病患者

摘要

背景。巨噬细胞是在肥胖和牛皮癣的发展具有重要意义。通过PPAR-信令γ在某些巨噬细胞群体与M2-相同的特征和抗炎简档相关联。在这项研究中，我们用M1和M2的巨噬细胞中的肥胖患者牛皮癣影响皮肤的免疫组织化学研究评估吡格列酮的抗炎作用。方法。We used immunohistochemistry to characterize CD68+ and CD163+ macrophages and pathomorphological description of skin biopsy, obtained from 6 obese psoriatic patients before and after treatment with 15, 30, and 45 mg pioglitazone, once a day during 6 months. Two patients with conventional therapy and without pioglitazone served as control.结果。一般来说，在银屑病患病皮肤CD163 +细胞数量在CD68 +和之前所有的治疗后，团为主显著。在谁收到吡格列酮的患者，他们中的一些明显减少CD68 +细胞对治疗有反应，从最低到最高剂量。In the group with 30 mg pioglitazone regiment, we detected a significant reduction of CD68+ cells in dermal infiltrates: CI 95% (16–32) before versus CI 95% (2–7) after treatment. Pioglitazone dose escalation led to certain normalization of skin morphology.结论。免疫组化研究使我们能够显示吡格列酮的银屑病肥胖患者的抗炎作用，它可以通过减少СD68+巨噬细胞的数量来介导的，但不能СD163+巨噬细胞中，受影响的真皮。

1.简介

牛皮癣是一种终身的，不可治愈的，毁容，致残，诬蔑病的约2％全球流行[1]。它可以在许多不同的形式体现，并常伴有肥胖[2]。

其病因与银屑病发病机制包括许多免疫机制[3，4，其中巨噬细胞(Mφ或多个）和它们的不同人群都参与了炎症级联[五]。Сomorbid肥胖在银屑病免疫疾病[进一步复杂2，6]。

临床研究表明PPAR-γ的治疗作用γ在银屑病治疗皮肤和代谢疾病的吡格列酮激动剂（PGZ）[7，8]，但这种影响机制尚不清楚。PGZ是PPAR-的特异性激动剂γ来源于噻唑烷二酮类，其中PPAR-γ刺激导致NF的表达降低κB在单核细胞内[9]。巨噬细胞PPAR-γγ可以为PGZ的可能目标之一[10]。

此外，男φs对肥胖和牛皮癣的发生有重要作用。积累的研究表明，肥胖和牛皮癣的发病机制具有引起全身炎症反应的共同特点。脂肪组织的过度积累，产生脂肪因子和细胞因子，是慢性炎症的来源，因为巨噬细胞参与分泌和激活炎症细胞因子。脂肪组织几乎具有所有已知的toll样受体(TLRs)。TLR配体既是微生物的脂多糖，又是饱和脂肪酸。脂肪组织TLRs的激活导致脂肪因子、细胞因子和趋化因子的合成增加，并刺激随后TLRs的表达[11]。慢性系统性炎症的分子机制与促炎性核转录因子NF相关κB [12]和PPARs的，其直接调节负责的条件和脂肪组织，脂质代谢，炎性细胞的活性的功能，以及它们的细胞因子的产生，粘附因子，细胞分化和细胞凋亡基因的活性的抗炎活性。PPAR活化受体是脂质和炎症之间的中央，因为刺激慢性炎症脂质是PPAR活化配体也[13]。

有M的两个主要临床显著亚群φS：经典（M1）和可选地激活（M2）[10，14]。M1和M2中号φ■找表现出极性相反M2的能力和/愈合和M1 /杀功能[15]。中号φs极化是在显著的代谢变化背景下发生的[10]。在不同疾病中，M1 / M2之比可以改变，如同这些细胞的表达谱，其具有致病作用[16，17]。

PPAR-γγ这些亚群的发痒可能导致的抗炎作用的发展[18-20]。

用CD68和CD163鉴定Mφs在组织切片[21]。CD163是一种血红蛋白-结合球蛋白的复合清除受体，是多种巨噬细胞标记之一，被分类为交替活化M的标记φS [22]。CD68分子是M1巨噬细胞的重要功能。至于氧化低密度脂蛋白受体，它可以激活M1吞噬作用和促进促炎细胞因子的产生。CD68是对人体单核细胞和组织中号高表达φS [21，23]。先前的研究表明，巨噬细胞标记CD68在银屑病相比增加正常皮肤，并用CD163 [共表达24]。

因此，在这项研究中，我们通过的M1和M2 M中的免疫组织化学研究评估吡格列酮的抗炎作用φ■在银屑病患病皮肤。

2。材料和方法

2.1。对象招募

在这项研究之前，获得了美国科学院生物伦理委员会的批准。

这项研究包括8例广泛寻常型银屑病的诊断证明，先进的阶段，伴随肥胖中度 （3名妇女和5名男子，年龄从40到60，52年的平均年龄）。所有患者均签署了自愿知情同意参与这项研究。

Patients were stratified and randomized 1 : 1 : 1 : 1; each group included 2 patients. The 1st group of patients received standardized conventional therapy—sedation, detoxifying agents, antihistamine, hepatoprotectors, vitamins, and 1-2% salicylic ointment 2 times a day topically. Patients of groups 2, 3, and 4 were prescribed pioglitazone at a dose of 15, 30, and 45 mg, respectively, orally once a day for 28 days, additionally to the treatment protocol.

2.2。钻孔活组织检查

我们进行了皮肤活检巨噬细胞亚群的深入描述性研究。样品通过从下肢的皮肤区域银屑病斑块的钻取活组织检查恰好处理前和第28天获得。Punch biopsy was performed using a special tubular scalpel (Dermo-punch) with a diameter of 3 mm, under local infiltration anesthesia with lidocaine hydrochloride 2%. The biopsies were fixed in a 10% solution of neutral buffered formalin and embedded in paraffin.

2.3。免疫组化研究

我们使用链亲和素过氧化物酶方法免疫组化研究。石蜡切片，3 μ米厚，脱石蜡，脱水，抗原回收在柠檬酸​​盐缓冲液在烤箱微波，和内源性过氧化物酶被阻止。Further, the sections were incubated at 4°C overnight with murine monoclonal antibodies anti-CD68 (1 : 30, clone PG-М1, REF PD M065-S, Diagnostic BioSystems, USA) and anti-CD163 (1 : 100, clone 10D6, REF Mob460-01, Diagnostic BioSystems, USA). Afterwards, the sections were treated in two steps with the Mouse/Rabbit PolyVue™ HRP/DAB Detection System (Diagnostic BioSystems, USA), with visualization by chromogen; the nuclei were counterstained with Mayer’s haemalaun and enclosed under the cover glass. We used Antibody Diluent buffer as a negative control instead of primary antibodies, and lymph node tissues were used as a positive control.

定量指标是由以上的整个视场与真皮区域的大倍率透镜×40（高功率字段，HPF）计数免疫阳性CD68 +和CD163 +细胞获得。我们考虑到了从全部视野都得到定量的个别数据不计算平均值。使用ZEISS Axio上Lab.A1显微镜获得的显微照片，卡尔蔡司显微成像公司（毫克;×200，×400）。

2.4。统计分析

我们进行组间比较的统计分析，使用GraphPad Prism 5软件参数进行 -试验（如果正态分布）和非参数方法：对于依赖变量和Spearman相关Wilcoxon秩数据分析。

3.结果

所有患者的牛皮癣影响标本的病理形态学模式有本病的特征性体征。We detected the typical changes of the epidermis, such as accumulation of neutrophils in the stratum corneum of the epidermis: Munro’s microabscesses, decreased thickness of the epidermis as compared to the length of dermal papillae, regular acanthosis, often with dentate ridges of the epidermis, and dilated capillaries in the papillae. Lymphohistiocytic infiltrates of various densities were localized subepidermally in the dermal papillae (Figure1）。

在银屑病皮肤损伤，CD68 +和CD163 +的一般特性如下：在细胞的棕色颗粒状染色，这表明它们的不同尺寸和形状特征的形式中观察到的免疫反应性;CD68 +和CD163 +细胞在银屑病皮肤中真皮乳头和真皮更深分别定位，沿着和围绕扩张的浅表血管，以及在淋巴组织细胞浸润的组成。我们发现免疫阳性细胞在真皮乳头和网状层数量最多（图2-4）。

在视觉上，所有样品中占主导地位CD163 +细胞的数量。的CD68 + / CD163 +的比例进行评估，通过将获得的 -测试为因变量，证实CD163 +细胞的显著较高分数（ ),与CD68 + CD163和数量+之间没有显著相关性。CD68 +的平均数量为10个细胞（每乳头状的HPF和真皮的网状层），置信区间（CI）95％（6-14），而CD163 +的数目为22层的细胞，CI 95％（17-26）。

治疗后，比没有变化，和CD163 + Mφ小号压倒了CD68 +（ ，魏氏法）各组。

在至少两种形式中观察到大量的CD163 +细胞在银屑病：小型细胞与小核，如在淋巴细胞和相对大的支化的细胞;这些品种治疗后依然存在。这两种类型的细胞在本质上是相同的地区进行本地化，不得不根据位置不同的形状。因此，稍微较大的分别对乳头的顶端，而较小的细胞在淋巴组织细胞浸润的组合物，和/或扁平的纺锤形-在网状层。典型的定位是沿着真皮乳头，测定其CD163 +细胞，在那里它们形成了一种第一行具体地观察到的容器（图2），相比于CD68 +（图3）。CD68 + MφS还发生在不同的形状和大小，稍稀的浸润，并在真皮乳头，而且有时并不适用于所有，周围毛细血管（图4）。

CD163 +细胞在治疗之前和之后的形态和定量比较显示出每个组中，并在总（图没有显著差异2）。

在常规治疗组，治疗前后CD68+细胞的比较无统计学意义的变化或形态学差异( ，数据未示出）。

个性化的方法证明密切关注每一位患者。Therefore, the study revealed the patient who clearly responded to the treatment with the 15 mg of PGZ, in whom CD68+ cells almost completely disappeared after treatment.

In the group with 30 mg PGZ, the statistical comparison of CD68+ cells (Wilcoxon method) showed a significant decrease. Treatment with 30 mg PGZ use decreased the number of CD68+ cells from CI 95% (16–32) to CI 95% (2–7) significantly (Figure3）。

乙esides, in one patient after the treatment with 45 mg of PGZ, dermal papillae presented on the preparation were smoothed, epidermal ridges were rounded, and orthokeratosis (morphological signs of some normalization of the skin condition) and only single CD68+ cells were observed, which can be interpreted as a decrease in the infiltration density (Figure4）。

4。讨论

M的参与φ银屑病的发病机制是一个长期而又现实的研究课题。在牛皮癣,米φs的涉及危险信号的感知。它们的活化由促炎细胞因子IL-6和TNF-αα和趋化因子CXCL8，CCL5，CXCL1，CXCL2和涉及其他炎性细胞[25]。据了解，M的数φ在受银屑病影响的组织中，s显著增加[26]。M1/ m2型巨噬细胞分别驱动T细胞向Th1-或th2样表型分化。这些巨噬细胞固有的活动是免疫反应的中心指导因素，这是在理解免疫系统如何运作方面的一个重大变化。最重要的是，这一发现为免疫治疗开辟了全新的途径[27]。

M上的数据φPPAR-的影响下S偏振光γ激动剂和拮抗剂稳步增长，主要是在动物模型中[18-20]。通过PPAR-信令γ在个人Mφš群体相关联M2状特征，包括抗炎合的[28]。

因此，我们研究了PPAR-γ的影响γM1和M2上的激动剂PGZφ牛皮癣银屑病，受影响的皮肤，经免疫组化研究。我们的数据显示，在CD68 + M下降φ不同剂量PGZ的人口。CD68标志物在最近的研究中用作标识符炎性M1 [之一29]。CD68 + M的还原φs已与银屑病患者的临床成功密切相关。磷酸化我的号码κ乙α激活CD68 + MφS IN银屑病斑块与基于纳米颗粒显著新生物材料处理后均减少[29]。因此，CD68+ M1的减少可以解释PGZ治疗的成功。

在肥胖的银屑病患者，CD163 +细胞在受影响皮肤的主要群体，相对于CD68 +。常规治疗不影响这个比例。CD163的患病率+细胞作为替代活化中号φ情愿的在银屑病皮肤与血管生成从头平行。之前和PGZ处理后CD163 +细胞的形态学描述比较显示没有剧烈的变化。

我们的数据支持这一想法，CD163 +细胞驱动的免疫介导的增殖在这些患者[三十]。在另一方面，在牛皮癣约CD163 +细胞活化经典有争议的数据公布[24]。

PPAR-γγ巨噬细胞的活化依赖显然是能够恢复的巨噬细胞的重要清洁或清除功能在一些感染的，防止过度的炎症感染性条件[28]。因此，PGZ的施用也可能影响CD163 + M2中号φS，虽然他们的数量和形态的变化不能被记录在本研究中。

PGZ的额外治疗减少了CD68+细胞的数量，从15mg开始;在30毫克剂量下有统计学意义。此外，在剂量为45 mg时，也有CD68+密度降低的迹象，并有银屑病斑块消退的形态学表现:表皮增厚、角化畸形、真皮乳头高度降低、表皮嵴缺乏分支。因此，PGZ剂量增加导致皮肤形态一定程度的正常化。

CD68是I型整合膜蛋白具有高度糖基化胞外结构域和结合于组织 - 和器官特异性凝集素或选择素。所述蛋白质是清道夫受体家族的成员，具有典型的功能，这是细胞碎片的去除，促进吞噬作用，和Mφ招聘。因此,СD68导致炎症的支持(31]。

在与PGZ，银屑病治疗的动力学临床指标一起如PASI指数和减少的复发率高达每年减少到1-2次[7，8，32]， CD68+细胞减少提示局部炎症抑制。

这项研究的限制是的少数患者因伦理原因，并使用M的φš标记，其可以部分地重叠在病理学[16，17，24，29]。

进一步研究PGZ对肥胖银屑病患者M1/M2细胞因子水平的影响。

5。结论

免疫组化研究使我们能够显示吡格列酮的银屑病肥胖患者的抗炎作用，它可以通过减少СD68+巨噬细胞的数量来介导的，但不能СD163+巨噬细胞中，受影响的真皮。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据是可用的，请相应的作者。

利益冲突

作者声明，这篇论文的发表没有任何利益冲突。

致谢

这项研究是研究第0120U101166卫生公共乌克兰卫生部资助的“昼夜分子钟的代谢疾病和全身性炎症和针对这些过程的治疗方法的发展而发展的致病作用的研究”的一部分服务。

参考

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