PPAR -γ配体抑制鼻咽癌细胞增殖和转移通过调节E2F2

文摘

目的。过氧物酶体proliferator-activated受体-γ(PPAR -γ)是一个核激素受体在脂类代谢的关键角色。先前的研究已经确定了各种角色的PPAR -γ在细胞周期进展,细胞增殖和肿瘤进展。但是,没有PPAR -报告描述了一个角色γ在人类鼻咽癌(NPC)。值得注意的是,一些研究报道PPAR -之间的关系γ和E2F转录因子2 (E2F2)已被确定为细胞周期的调节,细胞凋亡、DNA损伤反应。值得注意的是,E2F2也被报道与各种恶性血液病患者预后不良。方法。我们用免疫组织化学(包含IHC)和免疫印迹的方法来评估PPAR -γ和E2F2表达和功能在nonkeratinizing人大和鼻咽炎(NPG)组织样本,以及西方墨点法和CCK8分析人大细胞系,CNE1和CNE2。结果。我们观察到低水平的PPAR -γ表达与核计划组相比,nonkeratinizing人大组织组织和确定一个低水平的PPAR -之间的联系γ表达与肿瘤更高级的阶段。此外,强大的E2F2表达式中检测出nonkeratinizing人大组织。我们进一步证明了罗格列酮,PPAR -γ受体激动剂,减少E2F2表达和人大细胞系的增殖。结论。我们的研究结果显示PPAR -小说的作用γ-E2F2通路控制NPC细胞增殖和转移。

1。介绍

鼻咽癌(NPC)起源于鼻咽粘膜的上皮细胞和柱状细胞。组织病理学,世界卫生组织(世卫组织)分类npc分为三个亚型:I型,角质化鳞状细胞癌;II型,nonkeratinizing癌;类型III,嗜碱性鳞状细胞癌。虽然人大是一种罕见的疾病在世界范围内,它有一个高发病率在东南亚,和II型是最常见的形式在两个尺度(1,2]。虽然人大对辐射敏感的肿瘤,它与相对高复发和远处转移放疗后2年。这些因素凸显了需要确定因素与人大的扩散和转移,以及潜在的治疗靶点。

E2F转录因子2 (E2F2)已被确定为调节细胞增殖、分化和凋亡3]。尽管许多最近的研究相关E2F2活动与不适当的细胞增殖和/或细胞凋亡在各肿瘤类型(4- - - - - -6),E2F2在人大的作用仍然是未知的。几个研究小组发现了E2F2作为调停者的能力过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)α,β,γ调节细胞增殖(7- - - - - -9]。PPAR -γ表达强烈在脂肪组织和已被证明发挥关键作用在肥胖的发生10),2型糖尿病(11),代谢综合征(12),和心血管疾病(13),激活形式起着抑制作用在细胞生长和增殖14]。越来越多的证据表明,PPAR -γ防止通过抑制肿瘤细胞增殖。然而,这种现象的潜在机制仍是未知的。根据上述报告,PPAR -γ针对E2F2影响肿瘤的扩散和转移,在这项研究中,我们调查了这些蛋白质的表达模式和活动在人大组织样本和细胞系来确定对肿瘤细胞增殖和分化的影响。

2。材料和方法

2.1。病人组织样本

52诊断nonkeratinizing人大组织和34诊断NPG组织病理学分析部门石河子大学医学院第一附属医院收集的耳鼻喉科相同的机构在2015年4月和2019年1月之间。对于每个组织样本,一部分是储存在−之前80°C蛋白免疫印迹和免疫组织化学之前另一个部分是存储在福尔马林(包含IHC)分析。

2.2。免疫组织化学染色

Nonkeratinizing人大和核计划组组织固定在4%福尔马林12 h,在分级脱水乙醇系列(75%,85%,95%,100%),浸泡在二甲苯,嵌入在石蜡。随后,样本切成4μ米部分,放在玻璃幻灯片,在二甲苯deparaffinized,水分梯度乙醇系列(100%,95%,85%,75%)。所有幻灯片都孵化在柠檬酸溶液燥热引起抗原检索和暴露于3%过氧化氢为10分钟块内生氧化酵素。与磷酸盐(PBS)三个洗后,被孵化的部分屏蔽解决方案包含牛血清白蛋白(BSA)为20分钟,其次是暴露于主要抗体E2F2 (YT1443 Immunoway,兔多克隆,1:200稀释)和PPAR -γ(兔多克隆Novusbio 1:10 0稀释)一夜之间在4°C。抗原的网站都使用diaminobenzidine可视化工具包(涂)。细胞核被苏木精复染色。最后,幻灯片在分级脱水乙醇系列和二甲苯和在显微镜下观察到。E2F2和PPAR -的表达水平γ在组织分类如下:IOD和/区域和< 0.02、低表达或IOD和/区域和≥0.02,高表达。

2.3。实时rt - pcr

全国人大和核计划组组织总RNA隔绝,这是准备使用一个E.Z.N.A.总RNA装备我(ωBio-Tek)。收获组织均质在TRK裂解缓冲,紧随其后的是RNA分离和净化。豆类LA Taq®逆转录工具包用于反向转录从人大和核计划组组织成cDNA mRNA。在那之后,定量real-time-PCR进行。引物序列为人类GAPDH E2F2, PPAR -γ本研究中使用GAPDH向前:5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′;GAPDH逆转:5′-TCAAGGTGGAGGAGTGGGT;E2F2转发:5′-CTGAAGGAGCTGATGAACACG-3′;E2F2逆转:5′-CCCTTGGGTGCTCTTGAGATA-3′;15-PGDH转发:5′-GCATAGTTGGATTCACACGCT-3′;15-PGDH逆转:5′-TTGGCAATCAATGGTGGGTC-3′。每个基因的相对表达水平计算方法与GAPDH正常化。

2.4。细胞系,细胞培养

人类人大细胞系CNE1(分化良好)和CNE2(低分化),它可以代表人大细胞系的特点与不同程度的分化,在杜尔贝科修改鹰的培养介质(DMEM)介质(美国Hyclone)补充10%胎牛血清(美国Gibco)和1%青霉素和链霉素(美国Hyclone)。所有细胞培养的氛围中5%二氧化碳在37°C。全国人大细胞系CNE1和CNE2,得到癌症中心的联合医院(武汉,中国)。

2.5。西方墨点法

Nonkeratinizing人大和核计划组样本CNE1和CNE2细胞孵化有或没有PPAR -γ收集配体和细胞溶解radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区(Beyotime,中国),它包含一个磷酸酶抑制剂和phenylmethanesulfonyl氟化物。溶菌产物的蛋白量量化使用BCA蛋白质分析工具包(Beyotime、海门、江苏、中国)和20 ~ 50岁不等μ总蛋白质的g /样本被加载到10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶和转移到聚乙二烯二氟化物膜。随后,细胞膜被封锁在脱脂奶粉5%解决方案在室温下1 h和随后孵化一夜之间在4°C以下主要抗体的稀释:E2F2 (YT1443,兔多克隆,1:1000稀释),PPAR -γ(兔多克隆NR1C3 1:50 0稀释),和GAPDH (KM9002、鼠标单克隆,1:4000稀释)。接下来,膜清洗和孵化了菌种,辣根peroxidase-conjugated二级抗体在室温下1 h。使用增强化学发光的蛋白质终于可视化+试剂(Beyotime,中国)。目标蛋白质含量在每个样本量化densitometrically和规范化GAPDH水平相同的样本。

2.6。细胞计数Kit-8扩散试验

CNE1和CNE2细胞被播种在96 - 10孔板的密度³细胞/好,一夜之间孵化。接下来,5、10和20μPPAR -摩尔罗格列酮(罗格)γ受体激动剂和/或100 nmol GW9662 PPAR -γ对手,被添加到井。24、48、72和96 h,表明井用PBS,媒介在100年取代μL的新鲜培养基+ 10μL CCK-8工具包的试剂。细胞进一步培养4 h,每个的光学密度(OD)为450 nm使用SynergyMx多模标仪(美国Biotek)在0、0.5、1、2 h。不同密度的OD值罗格组与对照组进行分析

2.7。流仪结果

凋亡细胞的量化进行了rh的膜联蛋白V-FITC检测工具(Antgene)根据制造商的指示。CNE1和CNE2细胞株被胰蛋白酶化收获,在寒冷的PBS洗两次。与rh膜联蛋白染色进行V-FITC propidium碘。细胞凋亡是由计算凋亡细胞的比例相对于细胞的总数。结果证实在至少三个独立的实验。

2.8。统计分析

所有统计分析使用SPSS(17.0版本;美国IBM公司)。采用卡方检验比较E2F2和PPAR -表达的水平γ在nonkeratinizing人大和核计划组样本和各自的相关性与NPC患者的临床病理学特征。未配对的学生的学习任务是用来比较E2F2和PPAR -γCNE1和CNE2细胞组之间的表达式。对所有分析,P值< 0.05被认为是表明一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。E2F2和PPAR -的表情γ在未分化的人大和核计划组组织与NPC患者的临床病理学特征和相关性

包含IHC被用来评估E2F2和PPAR -的表达γ蛋白质在52 nonkeratinizing人大和34 NPG组织样本。强E2F2表达式(IOD /面积≥0.2)观察nonkeratinizing人大组织的63.46%(33/52),17.65%(6/34)的核计划组组织(P < 0.01)。强大的PPAR -γ表达式(IOD /面积≥0.2)也观察到在nonkeratinizing人大组织的28.85%(15/52),76.47%(26/34)的核计划组组织(P < 0.01)(表1)。两个差异显著。

我们进一步分析了关联E2F2和PPAR -γ表达与临床参数nonkeratinizing NPC患者。虽然没有观察到的相关性与性别、年龄、或T(肿瘤)的分类,我们观察到E2F2和nonkeratinizing人大分期之间的正相关关系,即N(淋巴结转移)(N0-N1, 22/40(55.00%)和N2-N3, 11/12 (91.67%);P < 0.05)和M(远处转移)分类(M0, 23/52(54.76%)和M1, 10/10 (100%);P < 0.05)。PPAR -γ表达式只有积极发现关联的分类(M0, 15/42(35.71%)和M1, 0/10 (0);P < 0.05)。这些结果强烈表明E2F2有助于nonkeratinizing人大的扩散和转移,与疾病关联的阶段。

3.2。免疫组织化学染色E2F2和PPAR -γ在Nonkeratinizing人大和核计划组组织

包含IHC被用来评估E2F2和PPAR -的表达和定位γ在组织样本。值得注意的是,我们观察到强E2F2表达nonkeratinizing人大组织(图1(一)),相比之下,NPG组织(图1 (c))。尽管E2F2局部细胞核和细胞质的组织,这是细胞核中最强烈的表达。我们进一步观察PPAR -下降的趋势γ表达式在nonkeratinizing人大组织(图1 (b)),相比之下,NPG组织(图1 (d))。半定量的评估显示显著强E2F2 nonkeratinizing人大组织中表达,与核计划组组织(图1 (e))(P < 0.01),以及在PPAR -一个重要的区别γ这些组织类型(图之间的表达式1 (f))(P < 0.01)。

3.3。E2F2和PPAR -的表情γ在Nonkeratinizing人大和核计划组组织

E2F2在人大的mRNA表达明显高于核计划组,而mRNA的表达PPAR -γ在人大低于核计划组(图2(一个))。免疫印迹显示强E2F2表达nonkeratinizing人大组织和较弱的PPAR -γ表达nonkeratinizing人大组织与核计划组相比组织(图2 (b)IHC),一致的结果。E2F2和PPAR -的定量分析γ蛋白质表达水平揭示组织类型之间的显著差异(分别为P < 0.01和< 0.05)(数据2 (c)和2 (d))。

3.4。PPAR -γ配体可抑制CNE1和CNE2细胞株的增殖

PPAR -分析功能的作用γ在人大细胞系,我们执行CCK-8化验检测人大细胞系的增殖。结果表明,PPAR -γ配体,罗格,抑制两个细胞系的增殖剂量依赖性的方式(数字3 (c)和2 (d))。来确定扩散受阻,我们用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果表明,凋亡细胞的数量没有增加与罗格(治疗后的数字3(一个)和3 (b))。

3.5。E2F2和PPAR -的表情γ在CNE1和CNE2细胞株PPAR -治疗后γ配位体

最后,我们孵化PPAR -细胞系γPPAR -配体分析功能的作用γ在人大细胞系。E2F2虽然PPAR -减少的表达γ增加治疗后与罗格和摄入量有关(数据的影响4(一)和4 (b))。我们进一步验证了用免疫印迹蛋白质表达水平和治疗后发现,PPAR -γ受体激动剂罗格,E2F2的表达下降而PPAR -γ增加了。确认PPAR -的抑制作用γ在E2F2,我们还与PPAR -细胞治疗γ拮抗剂GW9662并观察E2F2(数字的表达增加4 (c)和4 (d))。这些结果表明,PPAR -γ有助于NPC细胞增殖和转移的抑制作用。

4所示。讨论

人大是一种多基因遗传性恶性肿瘤,最常发生的鼻咽侧壁,特别是Rosenmuller和咽鼓的窝垫(和神秘的位置)。作为主要的肿瘤位置的头骨,当地人大的入侵可能产生严重的后果,和大多数患者表现为淋巴结或远处组织转移的诊断(15]。目前,扩散和转移的肿瘤组织细胞的分化和增殖率密切相关,了解调节细胞周期的因素帮助我们理解的机制,导致细胞增殖和分化,以及寻找治疗和预后相关的因素。

以前,我们发现E2F2可以诱导细胞周期进程目标基因的转录和驱动和扩散16]。细胞周期放松管制是人类癌症的一个共同特征。proproliferation的功能在于使细胞周期进入S期的能力通过E2F2 [17),和强大的E2F2表达式中检测出各种类型的肿瘤(18- - - - - -21]。没有报告关于E2F2人大。在这项研究中,我们使用包含IHC方法分析52 nonkeratinizing人大组织和34 NPG组织显示强E2F2表达式在前,这是与临床相关肿瘤的阶段。具体来说,我们观察到的水平明显高于E2F2表达N2-N3和M1阶段nonkeratinizing人大组织。这一发现提出了一个协会E2F2表达与恶性肿瘤的程度,证实了利用免疫印迹和rt - pcr。这一发现表明,E2F2是一个有意义的肿瘤恶性程度的标志。此外,我们发现E2F2本地化主要在细胞核nonkeratinizing人大组织,这表明这种转录因子把核促进DNA合成和随后的细胞增殖和分裂。这一重要E2F2在细胞增殖中的作用表明E2F2抑制剂治疗可以抑制增殖。

PPAR -γ成员,ligand-activated总科的核转录因子,是一个重要的监管机构的炎症,葡萄糖代谢,细胞增殖22)和以前可以抑制肿瘤细胞增殖23- - - - - -25]。在这项研究中,我们使用包含IHC、免疫印迹和rt - pcr来演示PPAR -减少γ表达nonkeratinizing人大组织NPG组织相比,尤其是在前,远处转移的病例。它表明,PPAR -的表情γ与全国人大和与肿瘤的恶性程度有关。PPAR -抗肿瘤的感情γ被认为是与抑制血管生成有关,具备干细胞的过程,和细胞周期阻滞26,27]。在我们的研究中,我们观察到减少E2F2表达和降低利率在NPC细胞增殖和分化PPAR -治疗γ受体激动剂罗格摄入量有关。值得注意的是,这种影响与PPAR -孵化所抵消γ受体激动剂GW9662。支持我们的结果,小松E2F2导致差别等人报道,对这些PPAR -γagonist-mediated细胞周期,导致细胞周期阻滞在G1 / S过渡。许多研究已经表明,配体激活PPAR -γ激活抑制Rb蛋白的磷酸化,据报道导致废除E2F2 [28)或直接降低dna结合转录因子E2F / DP的活动(29日]。吴等人发现,结合完全失活E2F2足以阻止细胞增殖(30.]。

可能,PPAR -γ部分会使E2F2的表达,从而减缓肿瘤细胞的扩散。因此,PPAR -γ可能是一个新的NPC治疗目标。

缩写

PPAR -γ:	过氧物酶体proliferator-activated受体-γ
E2F2:	E2F转录因子2
全国人大:	鼻咽癌
核计划组:	鼻咽炎
罗格:	罗格列酮。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者没有利益冲突的提交。

确认

本文支持由石河子大学医学院第一附属医院(没有。ZZZC201828A)。

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