文摘
Lectin-like氧化低密度脂蛋白receptor-1 (LOX-1)的一个主要受体表达在动脉壁的内皮细胞与内皮功能障碍的关键作用和动脉粥样硬化的发展。最近的证据表明,LOX-1调节胰岛素抵抗的情况下,可以抑制抗糖尿病的药物。我们以前也证实Thiazolidinedione (TZD)已经在ox-LDL-induced LOX-1内皮细胞的抑制作用。然而,这种现象的潜在机制仍不清楚。在这里,我们表明,罗格列酮治疗显著减毒LOX-1的表情,ICAM-1, VCAM-1, ,和动脉粥样硬化病变的载脂蛋白e- / -小鼠高脂饮食。在体外,我们显示,罗格列酮抑制LOX-1通过调节mir - 590 - 5 - p。Ox-LDL-mediated ICAM-1 VCAM-1,被罗格列酮显著降低,但所有逆转预处理细胞后antagomir - 590 - 5 - p。与罗格列酮诱导激活PPAR -γ并促进其核易位培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。核PPAR -γ调节mir - 590 - 5 - p水平通过绑定到其转录启动子区域。保留PPAR -γ在细胞质中使转染质粒在HUVECs未能激活mir - 590 - 5 - p。启动子区域的突变PPAR -γ也减少了mir - 590 - 5 - p启动子荧光素酶的活动。总的来说,这些数据表明PPAR -γ可能在动脉粥样硬化的治疗潜力通过转录调节mir - 590 - 5 - p在内皮细胞。
1。介绍
内皮细胞氧化损伤被认为是冠状动脉粥样硬化的主要原因,和氧化低密度脂蛋白胆固醇(ox-LDL)是极度参与内皮细胞氧化损伤和功能障碍(1]。Lectin-like氧化低密度脂蛋白receptor-1 (LOX-1)是主要为Ox-LDL清道夫受体,促进内皮细胞的吸收Ox-LDL (ECs)在动脉壁,加速炎症和氧化应激反应的过程1,2]。ECs的基底LOX-1线是非常低的,但是它可以迅速引起prooxidative压力,如ox-LDL、血管紧张素ⅱ(AngII),先进的糖化结束作品(年龄),和促炎细胞因子(2- - - - - -4]。激活LOX-1促进EC吸收大量ox-LDL,导致血管内皮和平滑肌细胞的凋亡,增加基质金属蛋白酶的生产和细胞间粘附分子,促进炎症细胞的迁移和渗透,加速动脉粥样硬化的进展和斑块易损性2,5]。
过氧物酶体扩散者激活受体(PPARs)属于配体依赖性转录因子的总科,包括PPAR -αPPAR -β/δ和PPAR -γ三个亚型(6,7]。不同于其他人,PPAR -γ主要表达于脂肪细胞和血管内皮细胞(8]。PPAR的广泛影响γ激活可能有利于脂质代谢,促进游离脂肪酸β氧化,降低血浆甘油三酯的积聚,预防动脉粥样硬化的发展(7,9]。不正常的脂肪分布和局部脂肪代谢障碍是观察突变PPAR -γ基因的患者(10]。在我们之前的工作中,我们发现ox-LDL-mediated内皮LOX-1 upregulation被Ciglitazone压制,一个特殊的PPAR -γ受体激动剂。然而,这种现象的潜在机制仍不清楚。
先前的研究表明,ox-LDL-induced LOX-1激活可以抑制mir - 590 - 5 - p (11,12],mir - 590 - 5 - p agomir有效ApoE预防动脉粥样硬化的发展−−/老鼠通过衰减脂质积累和促炎细胞因子分泌(13,14]。感应mir - 590 - 5 - p有效地降低细胞活性氧(ROS),封锁了p38MAPK信号通路,抑制Nf -核易位κB通过瞄准LOX-1 [9,12]。新兴的证据表明PPAR -γ作为一种重要的核转录因子,促进了多个小分子核糖核酸的转录包括mir - 125 a, mir - 424,和mir - 503,这是极度参与调节endothelial-dependent炎症和血管生成(15,16]。因此,在这项研究中我们假设PPAR -γ激活可能抑制ox-LDL-induced LOX-1通过瞄准mir - 590 - 5 - p,而改善甚至逆转动脉粥样硬化的病理过程。
2。方法
2.1。动物模型和样本收集
老八周(ApoE雄性C57BL / 6 ApoE基因敲除−−/河)老鼠从北京购买重要的实验动物科技有限公司有限公司所有的老鼠都安置在SPF条件和随机分为三组,对照组(n = 10),载脂蛋白e−−/老鼠(n = 10)只接受高脂肪饮食,和另一组(n = 10)接受高脂肪饮食与罗格列酮(2毫克/公斤/天,BRL49653 MCE)每日口服填喂法,分别为10周如前所述[17]。身体重量的所有老鼠每周监控和记录。10周后,所有的老鼠都牺牲与3%异氟烷吸入麻醉。每个收集的老鼠的血液样本中提取眼球血液和血浆TC和hdl - c水平测定酶的方法使用商业工具(如前所述)[18]。主动脉和相关组织迅速被孤立于小鼠和免疫组织化学的固定片或在液态氮冷冻蛋白质分析。
2.2。量化的动脉粥样硬化病变区域
老鼠牺牲后,胸部被打开和近端主动脉心脏被隔离和4%多聚甲醛中固定24 h。横截面(~ 7μ米)主动脉根的收集和沾油红O和亮绿。动脉粥样硬化病变的体积计算从五个不同的部分。脂质染色面积的定量分析是由一个失明的观察者使用徕卡QWin V3软件。
2.3。体外HUVECs文化和细胞免疫染色
主要HUVECs买来AllCells(中国上海)和培养在低糖DMEM的边后卫(Gibco)为10%。在体外培养,通过8 ~ 10倍,这些细胞被用于实验。治疗后细胞有或没有GW9662 (5μmol / L), 1小时之后,罗格列酮(50的感应μmol / L) 24小时,HUVECs被4%多聚甲醛固定,permeabilized Triton x - 100年在0.1%,和阻止3% BSA为30分钟,然后他们被anti-PPAR——染色γ(1∶ab45036 Abcam) 1小时在4°C。洗3次之后,细胞被Alexa染色萤石®488 -共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(1:1000)。
2.4。重建和质粒的转染
突变PPAR -γ没有NLS肽( )是由质粒重建。NLS肽与核心残留”LSVMDDHSH”位于DNA结合域之间的连接(DBD)和铰链域PPAR -γ在不同物种的基因是守恒的19,20.]。这个地区是在野生型(WT) PPAR -删除γ质粒(Obio科技、上海)使用限制性内切核酸酶和PCR扩增片段的方法。线性质粒与T4 DNA连接酶重组。两个WT PPAR -γ和转染到HUVECs用Lipofectamine肝加试剂(生命技术)根据制造商的指示。
2.5。免疫印迹分析
HUVECs种植在six-well板在里帕缓冲区包含蛋白酶抑制剂细胞溶解,1毫米PMSF (ST506, Beyotime生物技术)在冰上20分钟。总蛋白提取从溶解产物离心(11000 rpm, 4°C, 10分钟)。蛋白质(20μg)被加载到sds - page凝胶电泳(12%)和分离,随后转移到PVDF膜(Bio-Rad)。与5% BSA免疫印迹在膜被封锁,然后孵化主要抗体(anti-LOX-1,兔多克隆抗体1:1000稀释,ab203246, Abcam;anti-ICAM-1、鼠标单克隆抗体在1:1000稀释,ab20, Abcam;anti-VCAM-1,兔单克隆抗体在1:1000稀释,ab 174279年Abcam;和反 ,兔多克隆抗体在1:1000稀释,# 4312,细胞信号技术)。洗后用1×PBST 3次,屁股被孵化的辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体免疫球蛋白(1:5000、康晨生物科技、上海)。GAPDH是用作内部控制。免疫印迹复合物被高分辨率检测化学发光免疫印迹检测试剂(热科学,34080)和图像被ChemiDocTM触摸成像系统(BIO-RAD、钙、美国)。
2.6。染色质免疫沉淀反应(芯片)
使转染后WT-PPAR -γ或质粒HUVECs,罗格列酮(50的细胞被刺激μmol / L) 24 h。细胞然后用1%甲醛固定10分钟,停止了通过添加甘氨酸的最终浓度200更易/ L。洗后用冰冷的1×PBS为3次,细胞均质在冰上的超声发生器内细胞裂解缓冲包含0.2% NP-40和蛋白酶抑制剂。然后,染色质DNA提取和剪切成~ 500 bp碎片。离心5分钟后,上层清液稀释10倍稀释缓冲和保留作为消极的控制。剩下的溶解产物是事先批准Dynabeads™蛋白质(50μ左)和激动在4°C anti-PPAR - 30分钟γ抗体(1∶ab45036 Abcam)或控制免疫球蛋白(1:200)被添加到precleaned上层清液,然后上层清液在4°C孵化一夜之间在恒定的旋转。芯片珠子都洗了6次在室温和孵化与蛋白酶K 30分钟和反向交联通过加热4小时的65°C。免疫沉淀反应的DNA是由苯酚/氯仿抽提和纯化PCR反应中恢复过来,和温度循环在95°C变性30年代,退火在56°C 30年代,30年代在72°C和扩展,对34个循环重复。PCR引物如下:上游引物5′-CCTCTCCTTCCCCTTCTCCT-3′;下游引物:5′-TTAAAGGCTGAACACGGTGG-3′。
2.7。荧光素酶报告实验
启动子荧光素酶报告实验是由一个pMIR-REPORT™系统如前所述[21]。mir - 590 - 5 - p包含启动子区域PPAR -γ核心结合主题“TAGGTCA”或突变类型(傻瓜)主题“TAAATAA”,分别放大和克隆到pMIR-REPORT荧光素酶质粒,它位于上游的荧光素酶报告基因,是由巨细胞病毒增强剂。每种类型的记者质粒和pCMV-Renilla控制,分别转染到hek - 293 t细胞48 h与罗格列酮刺激之前。细胞溶解产物收集和荧光素酶活动被Dual-Luciferase记者化验分析系统(Promega,麦迪逊,WI)根据制造商的指示。
2.8。统计分析
所有数据都意味着±SEM。分析与统计软件SPSS 16.0。组间的差异分析单向方差分析方差LSD分析紧随其后。值被认为是统计学意义,P < 0.05。
3所示。结果
3.1。罗格列酮抑制内皮LOX-1在动脉粥样硬化的载脂蛋白e−−/老鼠
调查PPAR -的作用γ激活在调节内皮功能在动脉粥样硬化模型,载脂蛋白e−−/老鼠接受高脂肪饮食为10周有或没有罗格列酮。结果表明,罗格列酮治疗减少了体重增加的载脂蛋白e−−/老鼠15.2%(图1(一))。相比之下,high-fat-induced ApoE−−/老鼠,等离子体的TC水平(721.8±130.4和2254.3±276.0 mg / dL, P < 0.05),高密度脂蛋白胆固醇(101.3±11.5和246.5±26.1 mg / dL, P < 0.05)均显著降低Rosiglitazone-pretreated老鼠(数字1 (c)和1 (d))。符合血浆TC和hdl - c的高程异常,严重的动脉粥样硬化斑块中观察到主动脉根ApoE的冠状动脉−−/老鼠,但罗格列酮的动脉粥样硬化病变不明显增强预处理的载脂蛋白e−−/老鼠(图1 (b))。值得注意的是,增加蛋白质的冠状动脉内皮LOX-1 ApoE的水平−−/小鼠高脂饮食后大大减少了罗格列酮。伴随着LOX-1 upregulation,高脂肪饮食也增加了ICAM-1的表情,VCAM-1,在载脂蛋白e−−/老鼠,都扭转了罗格列酮治疗(数字1 (e)- - - - - -1 (h)),这表明PPAR -γ激活可能有效地抑制LOX-1表达式和防止内皮炎症和氧化损伤在动脉粥样硬化的发展。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.2。mir - 590 - 5 - p中表达下调ox-LDL-Induced HUVECs
先前的研究表明,LOX-1可能负面受mir - 590 - 5 - p;因此我们决定mir - 590 - 5 - p的表达在ox-LDL-induced人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)。如图2,基线水平的mir - 590 - 5 - p是高的在体外培养HUVECs,但它逐渐减少HUVECs刺激后ox-LDL存在剂量依赖的相关性(图2(一个))。确认mir - 590 - 5 - p的作用在调节LOX-1,我们转染mir - 590 - 5 - p的表达质粒(pMIR-CMV-miR590 Vigene生物科学)HUVECs然后检查刺激细胞后的细胞LOX-1 ox-LDL (20μg / ml) 24 h。与控制质粒的影响相比,mir - 590 - 5 - p过度预防的LOX-1 upregulation ox-LDL-induced HUVECs(数字2 (b)和2 (c))。此外,ICAM-1 VCAM-1,都镇压在ox-LDL-induced HUVECs使转染mir - 590 - 5 - p的表达质粒(数据吗2 (b),2 (d),2 (e),2 (f))。重要的是,mir - 590水平- 5 - p在HUVECs ox-LDL紧反弹与罗格列酮预处理细胞后(图2 (g))。确定PPAR -γ通过调节激活抑制LOX-1 mir - 590 - 5 - p,我们压抑的表达mir - 590 - 5 - p HUVECs通过引入antagomir - 590 - 5 - p。与antagomiR-NC的影响相比,antagomir - 590 - 5 - p预处理维护ox-LDL-induced LOX-1表达Rosiglitazone-pretreated HUVECs(数字2 (h)和2(我)),罗格列酮也未能抑制ox-LDL-induced ICAM-1, VCAM-1,在HUVECs阻塞mir - 590 - 5 - p(数字2 (h),2 (j),2 (k),2(左)),这表明mir - 590 - 5 - p Rosiglitazone-mediated需要抑制LOX-1 LOX-1介导内皮损伤。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
(左)
3.3。罗格列酮调节mir - 590 - 5 - p HUVECs通过激活PPAR -γ和促进其核易位
接下来,我们调查是否PPAR -γ激活至关重要Rosiglitazone-mediated upregulation mir - 590 - 5 - p的内皮细胞。体外培养HUVECs被使用或没有PPAR -γ拮抗剂GW9662 (5μmol / L) 1 h和紧随其后的是罗格列酮治疗24 h,然后mir - 590 - 5 - p的表达中检测出细胞。结果表明,mir - 590 - 5 - p在HUVECs罗格列酮水平显著提高,但是这并没有增加使用GW9662后(图3(一个))。此外,我们发现细胞质和核PPAR -γ显著增强在HUVECs与罗格列酮刺激后,但核易位PPAR -γ减毒GW9662 HUVECs预处理(数据3 (b)和3 (c))。GW9662阻塞PPAR——的影响γ核易位也证实了疣状(图3 (d))。为了进一步确认PPAR -的功能γ核易位在调节mir - 590 - 5 - p,我们转染WT或PPAR -的突变类型γ质粒( ),缺乏核的定位信号(NLS),分别为HUVECs(图3 (e))。在HUVECs转染WT-PPAR -γ,mir - 590 - 5 - P表达增加了2倍(n = 3, P < 0.01),与之相比,转染与罗格列酮刺激后(图3 (e)),这表明核本地化PPAR -γ是非常参与Rosiglitazone-mediated激活mir - 590 - 5 - p。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.4。核PPAR -γ激活的转录mir - 590 - 5 - p通过绑定到它的启动子
的参与PPAR -γ在调节mir - 590 - 5 - p表达促使我们思考是否mir - 590 - 5 - p是PPAR -的转录目标之一γ。因此,我们筛选mir - 590 - 5 - p的位置在miRBase数据库(http:mirbase.org/)。在启动子区域(-2000 bp ~ -100个基点)mir - 590 - 5 - p,我们发现一个可预测的sequence-specific PPAR -结合位点γ(TAGGTCA)定位在-410 ~ -390个基点的上游mir - 590 - 5 - p JASPAR计算程序数据库(图4(一))。为了验证这个假设,我们执行染色质免疫沉淀反应(芯片)pcr试验检查protein-DNA交互在HUVECs microrna的推动者与WT-PPAR或转移质粒。启动子区域(-410 ~ -390个基点)mir - 590 - 5 - p是由PCR anti-PPAR -γDNA免疫沉淀反应。PPAR -的招聘γ观察到这个地区只有PPAR -γ转染而不是转染细胞(图4 (b))。接下来,PPAR -γ结合主题是突变和克隆到pMIR-REPORT荧光素酶质粒,WT -和mut-type PPAR -γ启动子转染到hek - 293 t细胞,分别(图4 (c)罗格列酮),细胞被刺激的转染后48 h。荧光素酶的表达活动的结果表明,基因转录可能由核招聘PPAR -γ这个地区的mir - 590 - 5 - p子(图4 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
这项研究表明罗格列酮治疗有效地保护脂肪食源性的载脂蛋白e−−/老鼠通过减少动脉粥样硬化的发生和发展。动脉粥样硬化过程中,LOX-1 upregulation ox-LDL的吸收中扮演着关键角色在动脉壁的内皮。在这里,我们表明,Rosiglitazone-mediated PPAR -γ激活抑制的表达在ox-LDL LOX-1刺激HUVECs通过激活的转录mir - 590 - 5 - p。
罗格列酮属于Thiazolidinedione家族(TZD),这是广泛用于治疗2型糖尿病、炎症和动脉粥样硬化。新兴的证据表明LOX-1可能被PPAR -负调控γ服用tzd激活在动脉粥样硬化的治疗(9,22]。LOX-1介导抑制巨噬细胞ABCA1的可以通过服用tzd被逆转,这提高了反向胆固醇运输和防止泡沫细胞形成和ox-LDL积聚在动脉壁在动脉粥样硬化的发展23,24]。然而,PPAR -精确的作用γ在ox-LDL-induced内皮细胞仍不清楚。我们以前也透露,Ciglitazone治疗抑制LOX-1 ox-LDL-induced内皮细胞,改善血管生成通过激活PPAR -γ(25]。在这项研究中,我们进一步证实,PPAR -γ激活能抑制LOX-1 upregulation LOX-1介导的氧化应激和炎症细胞的粘连目标mir - 590 - 5 - p。
在目前的研究中,我们发现mir - 590 - 5 - p明显下调ox-LDL-stimulated HUVECs剂量依赖性的方式。超表达mir - 590 - 5 - p明显逆转LOX-1表达和压抑LOX-1 ICAM-1介导蛋白质含量,VCAM-1,在ox-LDL-induced HUVECs。的抑制作用mir - 590 - 5 - p在LOX-1信号观察ox-LDL-induced和AngII-induced HUVECs [11,26]。mir - 590 - 5 - p模拟减毒细胞凋亡,减少ROS生产,改善血管生成通过针对LOX-1基因的3’utr [11]。符合这些结果,我们进一步揭示了上游mir - 590 - 5 - p的监管机构。广泛的活性小分子核糖核酸可能由核转录因子。PPAR -γ也叫NR1C3(核受体亚科1,C组,成员3),被认为是一种PPARG编码转录因子的基因。近端启动子地区的mir - 590 - 5 - p,我们观察到一个基因PPAR -守恒的结合位点γ(27,28]。这种守恒的核心序列ChIP-PCR试验未能被探测到的转染HUVECs与罗格列酮刺激后,表明PPAR -γ需要核易位与DNA的结合促进mir - 590 - 5 - p。在前面的研究中,罗格列酮治疗增加了核表达PPAR -γ在骨髓干细胞(BMSC)和ECs,促进细胞分化和脂肪生成(29日,30.]。我们也报道了此事的PPAR -γ核易位Ciglitazone-pretreated树突状细胞(31日]。核转移PPAR -γ可以是基因转录的激活或抑制因子。例如,PPAR -γ需要调解的抗氧化作用,促进内皮细胞的抗氧化性能的生产形成一个转录复杂与视黄醇结合蛋白7 (RBP7) [32]。PPAR -γ激活的罗格列酮也阻止NFATc1绑定自己的启动子(33]。在这项研究中,我们没有测试的可能性是否核易位PPAR -γ促进了转录mir - 590 - 5 - p的协调与其他转录因子。但罗格列酮诱导mir - 590 - 5 - p子活动显著减毒突变后在HUVECs PPAR - DNA结合位点γ核PPAR -,表示一个函数的作用γ在调节mir - 590 - 5 - p转录。
先前的研究显示,一个关键的角色的PPAR -γ在预防胰岛素抵抗及脂质代谢的调节异常通过调节微rna转录34- - - - - -36]。多个小分子核糖核酸,如mir - 125 a, mir - 424, mir - 503,被PPAR -转录激活γ还发现在inflammation-mediated血管生成在内皮细胞(15,16]。在这里,我们发现mir - 590 - 5 - p可能受PPAR -γ在HUVECs Rosiglitazone-dependent方式,有效地抑制LOX-1和LOX-1介导炎症和氧化应激。我们的研究结果提出了这样的可能性,那就是一种TZD药物常用于糖尿病的治疗也有巨大的潜在治疗在治疗动脉粥样硬化内皮细胞损伤相关。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
朱Lei徐、帮派赵和香港同样贡献了这个工作。
确认
本研究是国家自然科学基金资助的中国(81700377,81700377,81300097)和上海市科委自然科学基金(zr1406800 13和16 zr1406200)。