文摘
背景和目的。越来越多的证据表明,PPARγ具有独特作用的肝纤维化和肝星状细胞(hsc)激活。本研究旨在调查PPAR的角色γ在低氧诱导肝纤维发生及其可能的机制。方法。大鼠肝纤维化模型用于CCl4-induced受到缺氧每天8个小时。大鼠暴露于低氧治疗PPAR有或没有γ受体激动剂罗格列酮。肝脏部分都沾染着他和小天狼星红染色8周后。肝星状细胞暴露在低氧环境中罗格列酮的存在与否,和PPAR的表情γ和两个纤维化标志物,αsma和肌间线蛋白,用免疫印迹和免疫荧光染色。接下来,PPAR的水平γ,αsma,肌间线蛋白包裹和cGMP活动被发现使用PI3K / AKT和cGMP激活剂或抑制剂。结果。缺氧促进肝纤维化和肝星状细胞激活的感应和进步。与此同时,罗格列酮明显引起了缺氧诱导的影响。信号通过国网公司/ cGMP / PKG促进了PPAR的抑制作用γ在低氧诱导肝星状细胞的激活。此外,PI3K / AKT信号或PPAR PDE5阻止上述反应γ。结论。国网公司/ cGMP / PKG和PI3K / AKT信号作用于PPARγ表现为协同作用减弱低氧诱导肝星状细胞的活化起。
1。介绍
纤维化肝损伤是一种常见的反应,它的特点是生产和沉淀细胞外基质(ECM) (1]。过度纤维化是一系列的肝脏疾病,如慢性肝炎、alcoholism-induced肝损伤和肝自身免疫性疾病(2]。在此病理过程,肝星状细胞(hsc)是纤维发生的主要执行人。HSC激活增加胶原蛋白的表达和分泌和其他ECM组件。它还能刺激肝细胞微环境,如巨噬细胞、内皮细胞和炎症细胞,导致促进纤维发生自分泌或旁分泌的方式(3,4]。因此,了解基于HSC激活的分子机制对肝纤维化的诊断和治疗至关重要。
过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR)γ是一项基本的核受体调节脂质代谢,胰岛素敏感性,脂肪沉积。在肝脏的生理代谢中发挥着极其重要的作用[5]。然而,增加研究PPAR的牵连γ是一个关键的中介在HSC激活和表型改变,从而维持肝星状细胞处于静止阶段(6,7]。最近,氧化应激是参与HSC激活和肝纤维发生(8]。大量的出版物也报道,肝星状细胞暴露于低氧可以通过HIF1被激活α及其下游靶基因或信号通路(9- - - - - -11]。根据这些证据,我们假设PPAR的效果γ肝星状细胞是肝纤维发生机制缺氧的作用。事实上,PPARγ被发现在几个疾病是由缺氧。王等人报道,缺氧通过HIF-1-mediated抑制PPAR UCP2下降γ,导致药物抗性的非小细胞肺癌12]。江等人发现缺氧抑制PKG-PPARγ轴在大鼠远端肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)和远端肺动脉(13]。然而,目前尚不清楚这些细胞与肝纤维化的发病机制相关事件和关键工作机制。因此,我们执行在活的有机体内和在体外实验来验证上述假设。
2。材料和方法
2.1。动物和实验协议
本研究进行35雄性SD大鼠体重200 - 250克从上海SLAC实验动物有限公司(上海,中国),住在普通笼子,坐落在一个动物房间22±2°C和维护在14小时光/ 10小时暗周期。老鼠被随机分为4组:组我 ),作为控制,保持在标准常氧室(FiO)20.21)。第二组( )老鼠注射40%亚兰(亚兰和橄榄油的混合物)在标准常氧室(FiO)20.21)。第三组( )老鼠注射40%的亚兰混合物normobaric缺氧室(FiO)20.07)和缺氧暴露每天8小时。第四组( )在相同的方式建模组III(40%亚兰混合物注入+缺氧暴露),但PPAR对待γ受体激动剂罗格列酮(显示)。显示添加到液体在日常饮食摄入10毫克/公斤的身体wt喂食。
所有的老鼠都牺牲了8周后,从腹主动脉和血液收集。血清分离和储存在−80°C的测量透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、氨基肽III型胶原(PIIINP)和IV型胶原蛋白(文明)。然后,肝脏立即被移除。肝脏的一部分被用于提取的蛋白质免疫印迹。肝脏的另一部分在4%多聚甲醛固定,嵌入在石蜡和切成段(5μ米厚),他和小天狼星红染色。动物保健和程序获得江苏大学医学伦理委员会批准,中国。
2.2。试剂
8-Br-cGMP、Rp-8-Br-PET-cGMPS LY294002、罗格列酮和敏喘宁从Sigma-Aldrich购买。740 y p是由研发系统。LY294002、罗格列酮和敏喘宁被溶解在二甲亚砜(最终浓度0.2%)。其他药物是准备使用蒸馏水。
2.3。血清参数检查
血清HA、LN、PIIINP,文明用ELISA试剂盒检测(Elabscience、武汉、中国)根据制造商的指示。
2.4。他和小天狼星红染色
组织切片在4%多聚甲醛固定,石蜡嵌入式,分段使用标准技术。部分受到他和小天狼星红染色。每个样本被两个病理学家独立评估,取得了盲目的评估,根据修改后的墙头草纤维化评分系统(14,15]。纤维化阶段得分是分为五个阶段(0 - 4):0:没有,1:带3 perisinusoidal纤维化;2:带3 perisinusoidal纤维化+门静脉纤维化;3:perisinusoidal纤维化和门户纤维化,加上桥接纤维化;4:肝硬化。
2.5。细胞培养
老鼠HSC-T6细胞株是一份礼物从柯博士AiWu(肝癌研究所、中山医院、复旦大学、中国)。细胞被维护在杜尔贝科修改鹰的介质(美国Hyclone)含10%胎牛血清(美国Hyclone)、青霉素(100国际单位/毫升),链霉素(100国际单位/毫升)(美国Amresco)。细胞培养在37°C调湿大气中5%的二氧化碳。
2.6。总细胞cGMP的测量
HSC-T6上层清液的细胞被收集并存储在−80°C。总cGMP水平测量使用竞争性ELISA测定(开曼化学、美国)根据制造商的建议。
2.7。PKG测量活动
包裹的活动包括PKG-I和PKG-II在每个样品测量根据协议的酶联免疫试剂盒(CycLex、日本)的磷酸化抗体可以识别的苏氨酸磷酸化(刺68/119)残留基质包裹。
2.8。免疫荧光染色
免疫荧光染色检测进行了正如我们前面描述的(15]。一夜之间,细胞被孵化的主要抗体αsma (ab5694)和肌间线蛋白(ab15200)(1: 50稀释;美国Abcam)在4°C。PBS的细胞被洗了三次(5分钟),然后在黑暗中孵化1 h与Alexa萤石在室温下488年和550年共轭山羊anti-rat二级抗体(1:200稀释;美国Abcam ab150157和ab150083)。细胞核的细胞被染色和4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(美国Sigma-Aldrich)。获得的图像使用蔡司LSM 510元共焦显微镜使用20 x / 0.5 w和40 x / 1.2 w的目标。
2.9。免疫印迹分析
免疫印迹分析从我们以前的报告中描述的那样16]。主要抗体用于这项研究如下:PPARγ(ab209350) (1: 1500),αsma (ab5694),肌间线蛋白(ab15200),一种蛋白激酶(ab8805) Phospho-AKT (ab81283), PI3K p110β(ab151549) PDE5 (ab14672) (1: 1000;美国ABcam)和PI3K p110α(# 4249)(1:1200;细胞信号技术,美国)。的主要抗体GAPDH是稀释1:1000 - 1500(圣克鲁斯,美国)。二级HRP-conjugated抗体稀释在1:2500。这些墨迹被发现使用ECL系统(Beyotime生物技术,中国)。LI-COR奥德赛扫描仪(LICOR)是用于分析的强度乐队在屁股上。
2.10。统计分析
所有使用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据表示为均值±SE和使用学生的平均值进行比较t以及和方差分析。数据意味着±SE。免疫印迹,ELISA,包裹活动,cGMP用单向方差分析进行分析。的和确切概率法被用来分析每组纤维化等级的差异。的值 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。PPAR的低表达γ与低氧诱导肝纤维化
与之前的研究一致,我们发现缺氧可以促进肝纤维化的进展(表1和2和图1)。与此同时,PPARγ受体激动剂罗格列酮(显示)引起显著低氧诱导的肝纤维化的发展。缺氧导致的趋势增加血清标志物(HA、LN、PIIINP和C(四),而且纤维化组织年级的升高。然而,PPAR的激活γ改善这种效应(表1和2和图1)。检查可能的PPAR的相关性γ肝纤维化,PPAR的表达水平之间的相关性γ和其他两个标记的纤维化αsma和肌间线蛋白测量。如数据所示1 (b)- - - - - -1 (c),PPARγ是负相关αsma和肌间线蛋白表达(r=−0.78613,P< 0.001,r=−0.83517,P= 0.017,职责)。这些结果表明,PPARγ与低氧诱导肝纤维化有关。
(一)
(b)
(c)
3.2。PPARγ对抗肝星状细胞激活缺氧造成的压力
众所周知,肝星状细胞是重要的效应器诱导肝纤维化。以前,我们表明,缺氧促进肝纤维发生通过PPAR的规定γ体外。澄清如果HSC是这个过程的调制器,HSC是暴露于低氧应激与氧气浓度在不同时间从21%下降到7%。与对照组相比,PPARγ蛋白质含量显著减少时间的方式,伴随着一个明显的增加表达两种标记的纤维化,αsma和肌间线蛋白(图2(一个))。同时,根据我们的观察,这一趋势6小时后到达高原缺氧暴露。这些结果表明,缺氧的早期阶段压力可能会导致肝星状细胞活化。
(一)
(b)
(c)
然后,的表达α分析了sma和肌间线蛋白在肝星状细胞暴露于低氧PPAR的存在与否γ受体激动剂罗格列酮(显示,50海里),免疫印迹和免疫荧光。正如所料,缺氧暴露在肝星状细胞仅导致严重的PPARγdownregulation和αsma和肌间线蛋白增加,而cotreatment缺氧和显示逆转这些影响(图2 (b)),这表明PPARγ对抗肝星状细胞激活缺氧造成的压力。
3.3。参与低氧诱导PPAR PI3K / AKT信号γ低表达
PI3K / AKT信号通路,是一个重要的调节机制,细胞氧化应激效应和诱导肝星状细胞的激活和增殖依赖HIF-1α在对缺氧的反应。在这里,我们分析了PI3K / AKT信号是否与PPAR有关γ抑制低氧诱导肝星状细胞激活。结果表明,低氧诱导肝星状细胞激活一种蛋白激酶磷酸化显著提高(图时3 (c))。抑制PI3K LY294002 (20μ米)明显反对上述激活。同时,PPARγ表达式也恢复(数字3 (c)和3 (d))。同样,激活的PI3K 740 y p (25μg / ml)的肝星状细胞暴露于低氧的存在显示显著降低PPAR(50海里)γ表情,随着级别的增加αsma和肌间线蛋白(数字3(一个)和3 (b))。这些结果暗示PI3K / AKT信号阻塞PPAR的抑制作用γ在低氧诱导肝星状细胞的激活。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。国网公司/ cGMP /包裹的相声和PI3K / AKT信号调整PPARγ衰减低氧诱导肝星状细胞的活化起
根据先前的研究,国网公司/ cGMP / PKG导致肝硬化的治疗。此外,这个信号也调节各种细胞低氧应激引起的事件。调查国网公司的潜在作用/ cGMP / PKG HSC缺氧反应调制信号的PPAR PI3K / AKT信号,肝星状细胞在缺氧培养90分钟有或没有8-Br-cGMP(1毫米),被广泛用作国网公司/ cGMP / PKG受体激动剂的存在与否,Rp-8-Br-cGMP (20μ米),国网公司/ cGMP / PKG拮抗剂。我们发现cotreated 8-Br-cGMP与缺氧明显下降PI3K p110的蛋白质含量α,PI3K p110β和磷酸化AKT相比,缺氧组。在这个下降的结果,PPARγ表达增加。此外,正如我们推测,αsma和肌间线蛋白水平也降低了。影响引起8-Br-cGMP被包含Rp-8-Br-cGMP(图4(一))。这些结果表明,国网公司/ cGMP / PKG直接抑制PI3K / AKT信号,另一方面增加了PPARγ,最终影响低氧诱导肝星状细胞活化。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
为了进一步证实上述发现,我们使用敏喘宁,特定的5型磷酸二酯酶抑制剂(PDE5),抑制环鸟苷酸水解和观察对PPAR后续影响γ和低氧诱导肝星状细胞的活化起PI3K / AKT信号。结果表明,缺氧环境显著提高cGMP和PKG活动在肝星状细胞(数字4 (c)- - - - - -4 (d))。PDE5抑制恢复cGMP和PKG活动(数据4 (c)- - - - - -4 (d)),其次是PPAR增加γ表达和抑制肝星状细胞激活(减少的表达αsma和肌间线蛋白)(图4 (b))。这些数据表明,国网公司/ cGMP / PKG和PI3K / AKT信号作用于PPAR增效剂γ,后者抑制低氧诱导HSC激活。
4所示。讨论
PPARγ作为一个转录因子,控制基因转录和细胞分化在体外和在活的有机体内和抑制HSC激活和维护中起着关键作用的形态学和生化逆转活化HSC静止细胞(17- - - - - -19]。目前的证据表明,缺氧是一种常见的刺激肝纤维化和肝星状细胞激活的发展20.,21]。事实上,缺氧是连接各种信号的能力。它不仅会影响肝星状细胞的激活,也作用于各种各样的其他细胞,如正弦细胞,肝细胞,脂肪细胞,liver-resident巨噬细胞(Kuppfer细胞)1,22- - - - - -24]。其次,低氧诱导结构改变在肝纤维化加重低氧环境中,因此,反过来,加速肝纤维化的病理过程。
然而,关于PPAR的影响所知甚少γ在HSC激活和肝纤维化组织缺氧的压力。阐明肝星状细胞激活和PPAR之间的相互关系和分子机制γ在低氧环境中,我们设计实验在体外和在活的有机体内。为此,通过揭露亚兰模型大鼠缺氧环境,我们验证了假设低氧应激促进肝纤维化。值得注意的是,PPAR的表情γ由缺氧抑制。此外,表达两种标记的纤维化,αsma和肌间线蛋白显著增加。进一步探索PPAR的影响γ在缺氧,PPAR显示γ受体激动剂,添加到缺氧暴露组。正如所料,缺氧引起的肝纤维化而改善了PPAR增加γ的水平。这些结果也证实了HSC实验在活的有机体内。我们的研究结果证实,PPARγ对抗肝纤维化引起的缺氧应激通过抑制肝星状细胞激活。
然而,PPAR的底层机制γ调节低氧诱导肝星状细胞的活化起必须进一步探讨。最近的研究显示,一种蛋白激酶信号和PPARγ有一个相互抑制作用[25- - - - - -27),但这个理论仍然是有争议的。平衡等人建议PPARγ促进一种蛋白激酶磷酸化在心肌细胞缺氧/复氧(28]。然而,另一个独立的研究发现,PPARγ抑制内皮细胞迁移通过抑制PI3K / AKT信号(29日]。我们目前的研究表明,PI3K / AKT信号阻塞PPAR的抑制作用γ在低氧诱导肝星状细胞激活。接下来,cGMP类似物和对手使用,结果表明,国网公司/ cGMP / PKG直接抑制PI3K / AKT信号和PPAR增加γ表达式,最终影响低氧诱导肝星状细胞活化。相比之下,PDE5抑制和抵抗cGMP水解恢复cGMP和PKG活动,增加PPAR紧随其后γ表达和抑制肝星状细胞激活。
考虑到缺氧的协同效应和胰岛素抵抗在肝纤维化,先前的研究表明,缺氧导致PPAR下降γ表情,紧随其后的是红外抑制转录,导致封锁igf - 1和后续的信号。当TZD恢复PPARγ、红外激活发生直接或间接的,启动igf - 1 / PI3K信号[30.]。然而,我们发现缺氧环境诱导PI3K信号,导致PPAR的减少γ表达式,表明在这个过程是一个复杂的负反馈机制。
根据这些数据,我们推测,国网公司/ PKG激活激活PPAR上cGMP函数γ变弱,低氧诱导肝星状细胞激活和肝纤维发生。另一方面,缺氧直接或间接抑制PPAR的表达,诱导PI3K / AKT信号或激活PDE5 cGMP水解,最终有利于低氧诱导肝星状细胞激活。我们的研究结果可能会提供新的见解导致肝脏纤维化的机制。这将是有趣的建立同样的信号是否有效组织缺氧和PPARγ存在,就像在肥胖的脂肪组织(31日,32]。新研究是必要的,以解决潜在的新的治疗工具能够抵消导致纤维化的病理生理过程。
信息披露
Qinghui张和Shihao湘co-first作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突的存在。
作者的贡献
Qinghui张的构思和设计实验;Qinghui张和Shihao香进行实验;Qingqian刘和道顾分析数据;永亮姚明贡献试剂和材料;Qinghui张写的手稿;鲁小姐支持补充测试修改后的稿件,为修订后的手稿提供语言服务。Qinghui张和Shihao香是相等的贡献者。
确认
这项工作是由上海科委基金(批准号16411972700)。