文摘

的l是一个中医,作为辅助治疗炎症性肠病(IBD)。然而,活动在炎症性肠病的机制仍然不清楚。因为先前的研究已经记录过氧物酶体扩散国激活受体的抗炎效果γ(PPAR -γ),马齿苋属的植物监管PPAR -γ在炎症检查在当前的研究中。溃疡性结肠炎(UC)是由5%的葡聚糖硫酸酯钠(DSS)在小鼠和正常四组建立了控制、DSS, DSS + mesalamine, DSS +马齿苋属的植物。加州大学的严重性被体重评价,凳子血液形式,colorectum的长度。测定了炎症炎症因子(TNF-a、il - 6和IL-1a)。马齿苋属的植物提取能够减弱DSS模型类似于加州大学的发展mesalazine的治疗。此外,马齿苋属的植物提取抑制促炎细胞因子释放和减少DSS-induced NF -水平κB磷酸化。此外,马齿苋属的植物提取恢复PPAR -γ水平,减少了DSS。此外,马齿苋属的植物在老鼠身上提取保护DSS诱导细胞凋亡。总之,马齿苋属的植物提取可以减轻结肠炎小鼠通过调节炎症反应、细胞凋亡,PPAR -γ水平;因此,马齿苋属的植物提取可以治疗炎症性肠病的一个潜在的候选人。

1。介绍

炎症性肠病(IBD)包括克罗恩病和溃疡性结肠炎和已被视为全球卫生威胁儿童和成人(1]。炎症性肠病的分布在不同地理区域的高发病率在北美和欧洲北部;然而,这些地区的发病率保持稳定。亚洲等发展中地区,发病率和发病率每年都在增加2]。巨大努力,找到一个有效的治疗IBD尽管当前药物如柳氮磺胺吡啶、mesalamine,皮质类固醇采取单独或结合导致减速疾病进展(3]。然而,目前的治疗方法和药物,有些病人患有这些药物的副作用和并发症,如免疫力减弱,传染病,或增加恶性潜能。因此,一个有前途的药物,没有或轻微的副作用需要IBD治疗。

的l . (马齿苋属的植物)是一种传统的中草药称赞多矿物丰富,蛋白质,α香树脂醇,β胡萝卜素、萜类、维生素、脂肪酸(4]。的药用价值和使用马齿苋属的植物已经记录在许多中国古代书(5]。此外,目前的研究表明马齿苋属的植物有几个体外抗菌等生物功能,神经保护,抗炎,antiatherosclerosis,抗肿瘤6- - - - - -10]。此外,汤马齿苋属的植物已被用来作为治疗炎症性肠病缓解血便症状,腹泻,腹痛在诊所。一些临床试验的安全性和有效性上进行马齿苋属的植物显示,没有不良的影响马齿苋属的植物。在动物研究也表明低毒性的报道马齿苋属的植物与LD50值为1853毫克/公斤,治疗指数高(11]。

过氧物酶体proliferator-activated受体-γ(PPAR -γ)是一个重要的核受体超家族的成员。PPAR -的重要作用γ在急性炎症12,脂肪形成13,几位癌已被确认14- - - - - -16]。此外,PPAR -γ激活被发现在各种类型的免疫细胞,包括原发性腹膜巨噬细胞、树突细胞和T细胞(17]。多项研究表明,激活PPAR -γ可能会下调一些至关重要的促炎细胞因子,如il - 1β,2、il - 6和TNF -α(18)以及抑制NF -κB在单核细胞磷酸化和其他类型的细胞。因此,激活PPAR -γ在IBD施加直接的抗炎效应,而PPAR -机制γ激活仍有待进一步探讨(19]。

在目前的研究中,抗炎活性和机制马齿苋属的植物葡聚糖硫酸酯钠(DSS)诱导结肠炎动物模型进行了探讨。

2。材料和方法

2.1。提取的植物材料和准备

的马齿苋属的植物材料从中药学系获得上海第十人民医院的药房。草药被磨碎成粉和提取水溶性物质如前所述[20.]。短暂,准备粉煮在蒸馏水(80°C, 25 g / 120毫升水,w / v) 60分钟,然后通过超声波粉碎脑震荡(3周期15秒)。水和脑震荡的混合物过滤使用2毫米孔过滤器和合成材料在真空冻干。

2.2。动物和急性结肠炎感应

四十成年雌性老鼠权重在18到22岁的g购自上海实验动物有限公司,有限公司(上海,中国),并保持在25°C的环境控制12 h光/暗周期。老鼠被允许免费使用水和标准鼠标周润发。动物协议是同济大学的伦理委员会批准,符合指南中的建议的实验动物保健和使用国家卫生研究院。葡聚糖硫酸酯钠试剂(分子量:36000 - 50000年从议员生化药剂梭伦,哦,美国)稀释与饮用水最终浓度为3%。

小鼠随机分为4组:(1)正常的控制:在正常7天的食物和水(2)DSS组:3% DSS +生理盐水填喂法为7天(3)Mesalamine阳性对照组:3% DSS +每天7.4毫克/公斤Mesalamine填喂法为7天(4)马齿苋属的植物组:3% DSS + 100毫克/公斤每天填喂法为7天

建模期间,小鼠体重,粪便形式,和粪便隐血每天记录来评估疾病活动指数(DAI)急性结肠炎;评价标准是澄清表1。

表1
戴评估疾病活动指数。
2.3。血清细胞因子分析

的血清TNF -α,il - 1β,il - 6浓度测定用ELISA试剂盒(Elabscience,武汉,中国),分别根据制造商的指示。吸光度的OD值在450 nm检查ThermoMax微型板块读者。

2.4。MPO测定血清样本(髓过氧物酶)活动

髓过氧物酶存在于激活中性粒细胞和巨噬细胞在炎症反应中扮演防守角色通过催化过氧化氢为次氯酸。的血清样本的反应混合解决方案包括3、3′-dimethoxybiphenyl-4, 4′二胺和过氧化氢,pH值6.0,根据MPO分析工具包(南京建成生物工程研究所、A044、中国)。的吸光度控制和测试在460纳米是由微型板块读者。MPO的活性是按照下列公式计算:

2.5。粪便隐血试验

大便的形式被记录和分析了粪便隐血的严重性尿液粪便隐血试验设备(南京建成生物工程研究所、C027、中国)。少量的粪便样本选择,把它涂在幻灯片。表面添加orthotolidine和过氧化氢试剂粪便样本。结果分析了根据适应症:-(−):样品没有显示颜色在3分钟内;弱阳性(+):30 - 60秒内样本显示蓝色;阳性(+ +):样品出现蓝绿;强阳性(+ + +):样本显示立即深蓝色。

2.6。基因表达分析实时逆转录酶聚合酶链反应

从新鲜colorectum组织总RNA提取试剂盒试剂从热费希尔科学(美国沃尔瑟姆,MA)和75%乙醇洗涤。一微克总RNA转录成cDNA使用逆转录工具包(豆类生物技术,大连,中国)。第一个转录cDNA稀释10倍,并应用于实时聚合酶链反应(SYBR预混料Taq交货、豆类生物技术)在94°C以下循环的变性为30秒,根据引物在不同温度退火30秒和72°C伸长45秒使用7900 ht快速实时PCR系统(热费希尔科学)。实验中使用的所有引物列在表中2。

表2
在实验中使用的引物序列。
2.7。苏木精和伊红染色

新鲜colorectum组织在福尔马林固定石蜡和嵌入。组织污点是切成4μ米厚的部分组织学检查用苏木精和伊红())。组织学损伤指数的计算根据三个方面:小肠上皮细胞的破坏程度,在肠粘膜免疫细胞浸润的存在,并在黏膜下层免疫细胞的渗透程度。组织学得分表中描述3。两名有经验的病理学家的独立评估。

表3
组织学得分。
2.8。免疫印迹分析

总蛋白提取新鲜colorectum组织通过细胞裂解缓冲蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(新细胞和分子生物技术有限公司,中国)。量化的蛋白质是由BCA (Beyotime、上海、中国)的方法。等量的蛋白质(25 ug)从每个样本加载12% sds - page。通过电泳分离后,蛋白质被转移到PVDF膜(美国密理博公司,Billerica的)。5%脱脂牛奶的膜被孵化tris-buffered盐水(TBS)块与抗体非特异性结合。膜被孵化主要抗体在一夜之间4°C。实验中使用的主要抗体如下:β肌动蛋白,PPAR -γNF -κB, pNF——虽然κB(所有从细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),bcl - 2、Bax(所有从Proteintech集团公司,芝加哥,美国),和半胱天冬酶3(细胞信号技术,丹弗斯、马、美国)的稀释1:1000年,1:1000年,1:1000年,1:1:500年,500年和1:1000年,分别。孵化后主要抗体,膜与TBST洗了三次,然后用适当的孵化辣根peroxidase-conjugated二级抗体。信号被检测到,奥德赛乐队的强度进行了分析。

2.9。免疫组织化学染色

组织标本收集的老鼠在一夜之间在4%多聚甲醛固定石蜡和嵌入。部分(4μ米)通过串行分级二甲苯脱蜡、水化乙醇。洗后用三次磷酸盐(PBS)解决方案,抗原检索进行了使用微波加热到95°C和冷却到室温(四次)。主要抗体PPAR -γ(细胞信号技术,丹弗斯、马、美国)浓度被稀释成工作然后在4°C片孵育过夜。孵化后的二次抗体,民建联基质作为发色体。积极的表达领域显微镜下观察。

2.10。统计分析

使用SPSS 20.0统计分析软件包(美国、IBM公司,纽约Armonk)。所有的值与平均值±标准偏差表示使用Student-Newman-Keuls测试或单向方差分析。一个 值< 0.05被认为是具有统计学意义。积极包含IHC染色的评估和分析使用Image-Pro + 6.0软件(美国马里兰州银泉的媒体控制论)。

3所示。结果

3.1。马齿苋属的植物提取减少疾病活动指数,Colorectum的长度,和髓过氧化物酶活动的葡聚糖硫酸酯钠诱导结肠炎

由于严重的结肠炎是评估戴,MPO、colorectum的长度,所带来的影响马齿苋属的植物对这些参数进行提取。如图1 (b)戴,老鼠在DSS组有显著高于那些在所有其他群体从第三天开始( )。老鼠马齿苋属的植物提取和mesalamine组显示高戴从第三天开始,达到高峰在第五天相比正常控制。后第五天戴逐渐减少,尽管他们仍高于正常控制。自戴由三个方面包括减肥、腹泻,血腥的凳子上的分数。减肥和血腥的凳子分数进一步评估和如图1 (c)和1 (d)。DSS诱导溃疡性结肠炎,显著降低小鼠的体重DSS集团( )。然而,治疗马齿苋属的植物提取和mesalamine显著恢复身体重量所示马齿苋属的植物和mesalamine组。此外,有一个血腥的凳子DSS组得分高于其他组。治疗马齿苋属的植物(图和mesalamine减少了分数1 (d))。

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图1
的影响马齿苋属的植物治疗疾病的严重性DSS-induced UC模型。面板(一个)显示的外观代表老鼠从四个实验小组从左到右:对照组,DSS-induced集团mesalamine集团马齿苋属的植物组。面板(b)显示的图像疾病活动指数(DAI)四组不同的实验。面板(c)代表了老鼠的体重每天在不同的组。面板(d)显示粪便隐血试验在8天的形象深点的颜色和更严重的血腥的凳子上,显示了血腥的分数在不同天的每组粪便。面板(e)代表colorectum的长度在8天之后从四组DSS管理。面板(f)表明血清MPO活性。(数据提出了均值±SD从六个老鼠。 表示对比DSS和数控;#表示对比mesalamine和DSS;+表示比较马齿苋属的植物和DSS。符号表示的数量差异显著性;例如,四个符号表示 ;三个符号表示 ;两个符号表示 ;和一个符号表示 。)

colorectum的长度是结肠炎的评价内容,这意味着总长度从肛门盲肠的老鼠。与对照组相比,有显著减少的长度在DSS colorectum集团( )。但在mesalamine colorectum的长度马齿苋属的植物组的时间比在DSS组(图1 (e))。此外,髓过氧化酶(MPO)作为一个独立的预测因素对氧化应激和炎症反应。对照组的小鼠的平均MPO活性为0.56±0.05×10−3U /毫升,DSS暴露MPO活性增加到2.19±0.82×10−3U /毫升。mesalamine和的治疗马齿苋属的植物组织MPO活性降低到0.84±0.11×10−3U /毫升和0.71±0.04×10−3U /毫升(图1 (f))。

3.2。的影响马齿苋属的植物提取对促炎细胞因子表达和Colorectum受伤

从DSS诱导溃疡性结肠炎,三促炎细胞因子(TNF -的表达式α、il - 6和il - 1β)检测血清和colorectum组织。如数据所示2(一个)和2 (b)有显著增加在所有三个促炎细胞因子mRNA和蛋白水平( )。此外,治疗马齿苋属的植物和DSS-induced mesalamine显著降低细胞因子mRNA和蛋白表达水平( )。两个独立的有经验的病理学家检查colorectum的组织损伤。肠上皮细胞的损伤评分的评价课程和炎性细胞浸润黏膜和黏膜下层区域。图2 (c)显示,他从小鼠染色colorectum组织的四个不同的基团与放大200倍的上一行和不同放大倍数的colorectum DSS老鼠。在组织损伤评分有显著增加在DSS老鼠相比,所有其他老鼠( )。治疗马齿苋属的植物提取和mesalamine导致较小的肠上皮细胞损伤和炎性细胞浸润黏膜和黏膜下层(数字2 (c)和2 (d))。

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图2
的影响马齿苋属的植物提取血清细胞因子和组织损伤评分DSS-induced急性结肠炎。面板(一)表明TNF的mRNA表达α、il - 6和il - 1β每组进行评估与qRT - PCR。面板(b)表明,肿瘤坏死因子的水平α、il - 6和il - 1β通过ELISA检测血清中检测到。面板(c)显示结肠)彩色图像(数控指负面的控制;DSS仅指DSS组;M是指mesalamine组;P是指马齿苋属的植物组)。点药水表示淋巴滤泡增生;红色箭头指出炎症细胞的浸润。面板(d)表示)的组织学得分彩色colorectum图像。(数据提出了均值±SD从六个老鼠。 表示对比DSS和数控;#表示对比mesalamine和DSS;+表示比较马齿苋属的植物和DSS。符号表示的数量差异显著性;例如,四个符号表示 ;三个符号表示 ;两个符号表示 ;和一个符号表示 。)
3.3。监管NF -κB和PPAR -γ通过马齿苋属的植物提取物在Colorectum

两种NF -κB和PPAR -γ发挥重要作用在炎症,激活NF -κB是关键一步增加不同的炎性细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子-α。此外,先前的研究证明,PPAR -γ对抗炎症反应可能通过抑制炎症反应基因的转录激活,如转录因子NF -κNF - b .因此,表达式κB和PPAR -γ在这项研究调查。图3(一个)显示PPAR -的染色γcolorectum组织从四种不同组织的老鼠。显著减少的PPAR -γ染色观察老鼠的colorectum DSS组,同时治疗马齿苋属的植物提取或PPAR的染色——mesalamine恢复回来γcolorectum。图3 (b)显示NF-kBp65和PPAR -γ蛋白质免疫印迹和图3 (c)显示的mRNA水平NF-kB和PPAR -γ。有明显降低PPAR -γDSS mRNA和蛋白表达水平组相比,在正常对照组( )。这两个马齿苋属的植物提取和mesalamine恢复PPAR -γ回,在正常对照组水平。DSS治疗显著诱导NF-kB mRNA和蛋白表达水平( ),而治疗的马齿苋属的植物提取或mesalamine NF-kB回,在正常对照组水平。

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图3
的影响马齿苋属的植物提取NF -κB和PPAR -γ在结肠组织中表达。面板(一)代表PPAR的免疫组织化学染色γ。(数控指消极的控制;DSS仅指DSS组;M是指mesalamine组;P是指马齿苋属的植物集团原始放大:×200)。面板(b)显示了PPAR -的表达γNF -κB, pNF——虽然κB在colorectum组织免疫印迹。面板(c)显示了PPAR -灰色强度的直方图γ和NF -κB相对于β肌动蛋白。面板(d)显示了相对mRNA的表达PPAR -γ和NF -κB从定量实时PCR。(数据提出了均值±SD从六个实验。 表示对比DSS和数控;#表示对比mesalamine和DSS;+表示比较马齿苋属的植物和DSS。符号表示的数量差异显著性;例如,四个符号表示 ;三个符号表示 ;两个符号表示 ;和一个符号表示 。)
3.4。调节细胞凋亡蛋白Colorectum马齿苋属的植物提取

炎症反应通常会导致细胞死亡;然而无论是通过细胞凋亡或坏死还有待探索。在最近的研究中,三个凋亡蛋白检查包括proapoptotic蛋白质(伯灵顿和裂解半胱天冬酶3)和抗凋亡蛋白(bcl - 2)。如图4,大量的bcl - 2、Bax和半胱天冬酶3被免疫印迹分析记录。bcl - 2级(有显著下降 ),但显著增加伯灵顿水平colorectum DSS组的老鼠相比,所有其他组( )。虽然整个半胱天冬酶3显示没有改变老鼠的colorectum DSS,裂解的半胱天冬酶3显著增加( )。所有这些变化都是纠正后的治疗马齿苋属的植物提取或mesalazine。此外,bcl - 2、Bax mRNA水平显示相同的改变他们在四个不同的蛋白质组的老鼠。

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图4
的影响马齿苋属的植物提取小鼠凋亡炎症性肠病。面板(一个)显示了bcl - 2蛋白水平,伯灵顿,半胱天冬酶3,裂解半胱天冬酶3每组中。面板(b)代表的密度直方图bcl - 2,伯灵顿,裂解半胱天冬酶3。面板(c)代表的bcl - 2、Bax mRNA水平相对定量实时PCR,分别。(数据提出了均值±SD从六个实验。 表示对比DSS和数控;#表示对比mesalamine和DSS;+表示比较马齿苋属的植物和DSS。符号表示的数量差异显著性;例如,四个符号表示 ;三个符号表示 ;两个符号表示 ;和一个符号表示 。)

4所示。讨论

炎症性肠病通常与肠和extraintestine表现[礼物21]。炎症性肠病的典型症状是临床血液和粘液与粪便混合。其他症状可能包括发烧、体重减轻、关节炎、黏膜与皮肤的病变,extraintestine演示,有助于诊断,评估病人的病情和药物选择22]。在最近的研究中,减肥和粪便的变化伴随着血液和粘液与粪便混合记录每天估计傣族(疾病活动指数)结肠炎。显著高指数的戴DSS-induced UC小鼠在当前的研究中表明成功建立小鼠UC模型。此外,由于这个模型中,治疗活动马齿苋属的植物提取也证明显示,小鼠的治疗马齿苋属的植物提取戴指数有显著低于没有马齿苋属的植物治疗。此外,这种成功模式的加州大学的影响马齿苋属的植物提取colorectum也记录的长度。小鼠DSS-induced UC显示短colorectum比正常的老鼠,这是符合加州大学的报告23]。治疗马齿苋属的植物提取的长度也可以增加colorectum与DSS-induced结肠炎大鼠。研究结果表明,马齿苋属的植物提取物能改善炎症性肠病的一般症状。

目前,髓过氧化物酶活动被认为是一个独立的炎症和氧化应激指标。这种酶在白细胞通常有能力促进过氧化氢(24]。临床上,髓过氧化物酶活动被用来预测炎症和氧化应激在肾功能衰竭(25),心肌梗死(26),炎症性血管疾病(27),等等。与这些报告一致,更高层次的MPO观察老鼠的DSS治疗,导致炎症和溃疡性结肠炎肠(28]。血清MPO的海拔也符合肠损伤评分观察colorectum组织尤其是炎症细胞的浸润黏膜和黏膜下层。这些发现表明,MPO可以看出DSS-induced结肠炎或炎症性肠病的临床表现。

一些免疫细胞和免疫调节蛋白参与肠道免疫系统的扰动,占激活和增强炎症性肠病的炎症级联。肠道上皮细胞通常作为第一个障碍对于任何肠道疾病(29日]。一旦上皮细胞是由外部压力,受伤的肠道病原体进入肠道,可能触发抗原递呈细胞和幼稚T细胞转换成效应T细胞如Th1、Th17, Th2和自然杀伤T细胞。这些细胞是负责生成多种类型的促炎细胞因子(30.]。此外,这些细胞可以秘密的干扰素γ白介素1β激活巨噬细胞和其他细胞因子,进而可以分泌大量的细胞因子包括肿瘤坏死因子α、白介素- 1、白介素6。此外,一些细胞在这一过程中如树突状细胞,肥大细胞,白细胞也可以促进先天和适应性免疫反应的功能障碍的炎性疾病31日]。在当前的研究中,我们发现中的应用马齿苋属的植物可以显著减少这些细胞因子的表达水平包括TNF -α、il - 6和il - 1β。这些发现表明马齿苋属的植物可能影响T细胞激活和参与炎症在某种程度上。

在目前的研究中,三个促炎细胞因子(TNF -α、il - 6和il - 1β)检查。这些细胞因子主要由巨噬细胞和T细胞分化[发布32]。此外,肿瘤坏死因子-α也可以发挥其炎症反应通过upregulation il - 1β和il - 6和诱导组织损伤坏死和凋亡33)和激活NF -κB (34]。此外,所有三个细胞因子能够发挥其他功能通过不同的途径与其他分子的相互作用。肿瘤坏死因子-的结果α,il - 1β,il - 6在当前的研究中符合加州大学或CD患者报告(35,36]。

除了细胞因子,转录因子在炎症调节也很重要。转录因子NF -κB调节肿瘤坏死因子的水平——而闻名α、il - 6和il - 1β在炎症性肠病的进展(37]。此外,NF -κB可以促进细胞凋亡的upregulation c-FLIP水平而降低bcl - 2这样的抗凋亡蛋白的表达,Bcl-xl, c-IAP1/2, x-IAP [38]。在目前的研究中,中TNF -α、il - 6、il - 1β,pNF——虽然κDSS治疗小鼠B观察,表明一个增强的炎症过程,加重组织损伤。相反,增加马齿苋属的植物提取减少炎症反应和组织损伤指示的作用马齿苋属的植物提取炎症性肠病的预防和治疗。

PPAR -γ是另一个转录因子,在脂肪形成起着重要的作用,葡萄糖代谢(39,抗炎反应。一些报道认为PPAR -γ受体激动剂可能炎性疾病的有利影响,包括乳房炎,炎症性肠病和关节炎40- - - - - -42]。江等人发现PPAR激动剂(15 d-pgj2)可以废除生产促炎细胞因子TNF -α和白细胞介素- 6 (43]。此外,NF -κB激活后抑制PPAR -γ受体激动剂由于NF-kB亚基的构象的变化。从目前的研究结果还发现,PPAR -γ水平提高DSS-induced组马齿苋属的植物提取和抑制细胞因子和NF -一起干预κB。

细胞凋亡的机制在炎症性肠病仍然是有争议的。一些研究发现细胞凋亡增加,固有层(LP)和上皮细胞,导致严重的加州大学(44]。此外,激活PPAR -γ可能减弱凋亡级联的45]。在当前的研究中,antiapoptosis蛋白质(bcl - 2)是减少和proapoptosis蛋白质(伯灵顿和裂解半胱天冬酶3)增加在UC小鼠。然而,治疗马齿苋属的植物提取colorectum逆转细胞凋亡。这一发现表明细胞凋亡和进一步调查马齿苋属的植物在炎症性肠病。

5。结论

与炎症性肠病的成功模式,马齿苋属的植物提取证明,以减少疾病的严重程度。的机制马齿苋属的植物提取的减轻炎症性肠病可能与炎性细胞因子(TNF -的监管α、il - 6和il - 1β),转录因子(NF-kB和PPAR -γ)和细胞凋亡。因此,马齿苋属的植物提取可能是一个潜在的代理治疗炎症性肠病的患者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

瑞香港使得这项工作的主要贡献。

确认

作者真诚地感谢杰卢博士Yuejuan郑教授,齐戴博士和员工上海第十人民医院中心实验室的技术援助。这项研究得到了国家自然科学基金(81300340);81471537)。