文摘
2型糖尿病是一种常见的慢性疾病引起全球作为一个严重的公共卫生问题。饮食干预被认为是一个关键战略在糖尿病患者的血糖控制。最近,低碳水化合物显示生酮饮食在血糖控制和减肥是有效的。然而,肝脂质积累可以观察到小鼠生酮饮食治疗。另一方面,运动是一个众所周知的方法治疗非酒精性脂肪肝病。我们因此假设生酮饮食和运动的结合可以改善胰岛素敏感性,同时最小化不利影响的肝脂肪变性。为了验证这个假设,我们建立糖尿病小鼠模型,链脲霉素(STZ)和把它们分成对照组,生酮饮食组和生酮饮食和有氧运动组。我们发现后6周的干预,老鼠接受生酮饮食和生酮饮食结合运动都有降低身体重量,HbAlc水平,HOMA指数,改善胰岛素敏感性,而糖尿病组。此外,老鼠生酮饮食干预表现出肝脂肪变性血清和肝参数所示,以及肝脏组织化学染色,可以很大程度上缓解运动。此外,基因分析显示,生酮饮食与锻炼相结合PPAR减少γ和脂质合成的基因,以及加强PPARα和脂质β在肝脏氧化基因程序相比在生酮饮食锻炼。总的来说,目前的研究表明,生酮饮食和中等强度有氧运动干预改善糖尿病大鼠的胰岛素敏感性,同时避免肝脂肪变性,这提供了一个小说在糖尿病的作战策略。
1。介绍
2型糖尿病(T2D)已成为一个世界性的流行,影响超过4.22亿人在2014年根据世界卫生组织。失控增加血糖浓度是T2D的标志,可能导致长期并发症包括微macrocardiovascular并发症,神经病变、肾功能衰竭、癌症的风险增加发展(1- - - - - -4]。维持血糖在正常范围是T2D的治疗目标,因为这可以显著降低糖尿病危害并发症的风险(5- - - - - -9]。空腹高血糖,由于利率的增加肝醣类,胰岛素抵抗是T2D的标志,而目前的治疗是无效的3,10,11]。
尽管抗糖尿病的药物,如thiazolidinedione和二甲双胍,已经广泛用于治疗T2D,着手进行非药物治疗越来越多的传播有相当大的关注药品安全(12]。在这些策略,营养治疗已被美国糖尿病协会推荐为所有糖尿病患者(13]。特别是,一个非常低碳水化合物/高脂肪饮食(生酮饮食,KD)是一种最常用的饮食治疗糖尿病或肥胖患者在最近的临床研究[14- - - - - -16]。经典的生酮饮食(KD)是一种高脂肪、低碳水化合物饮食,导致酮体生产的目标通过脂肪代谢代谢组织模仿禁食状态,将主要从碳水化合物,脂肪热量的来源17]。的确,以前的研究报道,生酮饮食有助于减肥,在食源性肥胖病人以及改善2型糖尿病患者的血糖控制和代谢参数(18- - - - - -22]。
然而,潜在的副作用生酮饮食诱导血脂异常的肝脂肪变性和纤维化导致肝葡萄糖水平变化,脂质代谢和炎症状态限制其应用程序(23- - - - - -25]。另一方面,大多数研究认为锻炼可以预防肝脂肪变性,而这个改变的分子机制是未知的26- - - - - -29日]。因此,我们假设生酮饮食和运动的结合可以改善胰岛素敏感性,同时最小化的负面影响肝脂质紊乱。为了验证这个假设,我们建立糖尿病小鼠模型,链脲霉素(STZ)和把它们分成对照组(糖尿病控制,高脂肪饮食),生酮饮食组(糖尿病+生酮饮食),和生酮饮食和有氧运动组(糖尿病+生酮饮食+有氧运动训练),基于不同的饮食和干预措施。六周干预后,我们发现在生酮饮食干预显著提高糖尿病小鼠的胰岛素敏感性而表现出肝脂肪变性,可以很大程度上缓解有氧运动。此外,基因分析显示,PPAR的调节α和PPARγ在肝脏基因程序有可能负责综合干预的影响。总体而言,我们的研究结果表明,生酮饮食和有氧运动的结合可能是一个更好的策略针对糖尿病。
2。材料和方法
2.1。动物
所有动物程序批准的实验动物保健和使用委员会华东师范大学(M20170316、上海、中国)和按照指南进行的护理和使用实验动物(NIH出版,第八版,2011)。3个雄性C57BL / 6 j小鼠获得从上海实验动物公司(线性、上海、中国)。老鼠维持在一个特定的无菌动物设施调温方式(22°C±2°C)在12 h光/ 12 h暗周期。老鼠免费纯净水和美联储与食物的饮食,高脂肪饮食,或生酮饮食。体重和水和食物摄入量每周测量一次整个干预到实验(30.]。
2.2。2型糖尿病小鼠模型和干预措施
3个雄性C57BL / 6 j小鼠被用于诱导2型糖尿病。老鼠被喂食高脂肪的饮食(线性)4周,然后给出了链脲霉素(STZ Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),腹腔内注射的剂量100毫克/公斤刚做好的柠檬酸钠缓冲(pH值4.4 - -4.5)31日]。注射柠檬酸钠缓冲仅作为控制。快速血糖水平的老鼠每周测量一次使用血液从尾静脉和葡萄糖监测(瑞士巴塞尔ACCU-CHEK活跃,罗氏公司)。注射STZ后,小鼠空腹血糖水平高于11.1 L更易与连续3周被认为是2型糖尿病小鼠分为3组,糖尿病组(糖尿病控制)接受高脂肪饮食,糖尿病+ KD组和糖尿病+ KD + AE(有氧运动训练)组接收生酮饮食。所有饮食喂养老鼠的成分组成是补充表中列出1。
2.3。运动性能测试和锻炼培训协议
糖尿病+ KD + AE组的老鼠放在一个电机驱动的啮齿动物跑步机(ZH-PT、杭州、中国)。跑步机的适应后,老鼠受到运动性能测试。首先,老鼠热身8米/分钟的速度为5分钟,然后2米/分钟的速度增加了步骤每2分钟直到老鼠无法或不愿继续尽管轻微刺激木手杖。性能测试进行了初和4周后的训练为了调整训练强度。
有氧运动的协议是从以前作品被改编Hafstad et al。32),有以下修改。锻炼适应环境,所有老鼠条件的速度8米/分钟,10分钟/天,5天熟悉跑步机环境。这一时期后,老鼠跑60分钟50 - 60%(0%坡度)的强度与最大速度达到过去运动性能测试。运动组动物暴露在8周的训练包括跑步机跑步每周5天,而久坐不动的动物组呆在在家里笼实验的整个过程。室温保持在 在训练°C。8周的训练后,一夜之间,动物被禁食和牺牲前组织是收获。
2.4。葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验
GTT(腹腔内葡萄糖耐量试验)和ITT(腹腔内胰岛素耐量试验)进行为期6个月的体内的运动训练中。隔夜空腹或4小时后,从尾静脉血液收集基线测量的葡萄糖水平t= 0分钟,然后t= 15、30、60、90、120、和180分钟后腹腔内注射葡萄糖(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)1克/公斤体重或胰岛素(Novolin R;诺和诺德公司)0.75 U /公斤体重,血糖测量使用ACCU-CHEK活跃。
2.5。血液和血清化验
全血收集在EDTA涂层管与糖化血红蛋白测定糖化血红蛋白分析工具包(南京建成生物工程研究所、南京、中国)。血清葡萄糖,TG, TC, ALT(丙氨酸转氨酶)、AST(天冬氨酸转氨酶)测量与商用化验购自南京建成生物工程研究所。测定了血清胰岛素敏感的鼠标INS酶联免疫试剂盒(CUSABIO,武汉,中国)。所有化验都完成根据制造商的指导方针。
2.6。肝脏生化测量
肝脂质提取如前所述[33),当肝脏TG和肝脏NEFA内容确定使用商业套装(Applygen,北京,中国;南京建成生物工程研究所、南京、中国)。
2.7。肝脏组织病理学
老鼠牺牲和灌注生理盐水通过门静脉的血液。然后,从所有小鼠肝组织固定在4%多聚甲醛,在分级乙醇脱水,嵌在石蜡中。Five-micrometer部分得到使用切片机(徕卡,位于德国)和苏木精和伊红染色法染色(ZSBG-BIO,北京)按照指令。油红O染色,肝脏组织在4%多聚甲醛固定在20%和30%蔗糖脱水解决方案和嵌入在最佳切削温度复合(樱花、东京、日本)。冻结部分受到油红O染色按照制造商的指示,和组织病理学分析服务进行了生物实验室(武汉,中国)。
2.8。RNA提取和实时PCR
总RNA提取肝粉使用试剂盒试剂(表达载体),其次是1 ug的互补脱氧核糖核酸制备高容量的总RNA cDNA逆转录工具包(豆类、日本)。互补产品量化实时PCR使用电力SYBR绿色PCR反应混合液(美国应用生物系统公司,热)StepOne软件v2.1系统(应用生物系统公司)。我们计算mRNA使用相对于平均的β肌动蛋白的表达。引物的细节补充表中列出2。
2.9。西方墨点法
蛋白表达测定小鼠肝脏通过免疫印迹从细胞信号技术(AMPK获得的抗体α,P-AMPK)或从圣克鲁斯生物技术(PPARα,PPARγ,β肌动蛋白)和Arigo (Anti-Rabbit免疫球蛋白,Anti-Mouse免疫球蛋白)。短暂、蛋白质总浓度匀浆测定布拉德福德的方法,和等量的蛋白质(20 - 40μg)加载到每个车道的sds - page凝胶(6 - 12%)。蛋白质电泳后,被转移到0.4μM PVDF膜和彩色朱红色污点(wt /朱红色红色卷0.1% 5%乙酸)可视化蛋白质加载。膜与Tris-buffered盐水洗包含渐变20 (0.5%)和阻止非特异性结合室温(RT), 0.75 - 2 h, 5% (wt /卷)脱脂牛奶或BSA TBST。探讨了膜在一夜之间主要抗体在4°C。三次洗涤后,PVDF膜与辣根孵化peroxidase-conjugated二级抗体。蛋白质带量化使用FluorChem FC2系统(α,德国)。
2.10。量化和统计分析
使用学生的结果进行了分析t以及在适当的地方或方差分析,使用GraphPad棱镜软件。一个重复测量方差分析是用于所有体重情节,GTT和ITT公司数据。Bonferroni事后测试用于测试的显著差异由方差分析。 被认为是显著的。数据意味着±SEM。
3所示。结果
3.1。生酮饮食和生酮饮食与锻炼结合减少身体重量减少食物和水的摄入量
体重的变化在六周期间的有氧运动,最后身体重量显示在数字1(一)和1 (b)。没有发现显著差异在基线三组的体重,而糖尿病+ KD组的体重(从第五周直到最后)和糖尿病+ KD + AE集团(从第二周直到最后)明显低于糖尿病组。有趣的是,老鼠生酮饮食治疗有或没有锻炼都有食物和水的摄入量较低,较糖尿病组(数字1 (c)和1 (d)),这表明身体重量的减少生酮饮食干预是由于减少能量摄入。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。生酮饮食和生酮饮食结合运动改善胰岛素敏感性
确定生酮饮食的影响和生酮饮食与锻炼结合在糖尿病小鼠的血糖控制,我们追踪的动态代谢参数每个鼠标。与糖尿病组相比,糖尿病的空腹血糖水平+ KD和糖尿病+ KD + AE组明显降低(图2(一个))。此外,腹腔内葡萄糖和胰岛素耐量试验进行的最后六周实验时间。正如预期的那样,胰岛素敏感性显著提高了糖尿病+ KD和糖尿病+ KD + AE组与糖尿病组相比,GTT和ITT(图所示2 (b)和2 (c))。此外,血液糖化血红蛋白(HbA1c)水平和血清葡萄糖和胰岛素水平也显著降低小鼠接受生酮饮食和生酮饮食(数字2 (d)- - - - - -2 (f))。HOMA-IR是胰岛素抵抗的一项指标。因此,我们计算HOMA-IR,发现糖尿病HOMA-IR指标明显大于糖尿病+ KD和糖尿病+ KD + AE组(图2 (g))。综上所述,生酮饮食和生酮饮食与锻炼结合可以改善胰岛素敏感性和血清葡萄糖参数。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.3。生酮饮食和生酮饮食结合运动减弱糖尿病小鼠的肝醣类
我们的研究结果表明,生酮饮食干预和结合有氧运动可以改善血糖控制,而调节血糖稳态的机制因素尚不清楚。肝脏糖质新生维持稳定的血糖是至关重要的。因此,我们测试了生酮饮食是否有或没有运动可以调节gluconeogenic基因项目的糖尿病小鼠的肝脏。G6PC、PCK1 FBPase病原反应酶的糖质新生至关重要。我们发现生酮饮食和生酮饮食结合有氧运动明显减少G6PC, PCK1和FBPase水平在肝脏(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。此外,肝G6PC(图的活动3 (d))和PCK1(图3 (e))略增加生酮饮食,而肝PCK1明显抑制活性的干预(图的组合3 (e))。因此,我们的数据表明,生酮饮食和锻炼可以减弱肝脏糖质新生改善血糖控制。
(一)
(b)
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(d)
(e)
3.4。有氧运动训练改善生酮食源性代谢并发症
虽然生酮饮食干预是有效地降低身体重量和控制葡萄糖稳态,它表明脂质代谢紊乱后六周干预。我们发现生酮饮食治疗组明显高于血清ALT、TC、TG(数字4(一),4 (c),4 (d))与糖尿病老鼠。然而,生酮饮食和运动在很大程度上改善了受损的血清参数由单一的生酮饮食治疗,血清ALT和TG等数据4(一)和4 (d))。
(一)
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生酮饮食据报道由于血脂失调引起肝脂肪变性。我们因此决定使用生化分析和形态学染色肝脂肪变性。糖尿病+ KD组有更多的肝脏TG, NEFA和高密度脂蛋白胆固醇(数字4 (e)- - - - - -4 (g)(图)以及肝脏重量4 (h)比糖尿病组),而小鼠附睾的脂肪组织重量的结果不同(图4(我))。然而,6周的有氧运动训练主要减毒肝脂肪变性与糖尿病+ KD相比通过肝脏生化参数(图所示5(一个))、减脂滴和脂肪分数(数字5(一个)和5 (b))。这些结果表明,生酮饮食和运动的结合大大逆转的不利影响脂质紊乱和肝脂肪变性由单一的生酮饮食治疗引起的。
(一)
(b)
3.5。有氧运动调节PPARα和PPARγ基因和蛋白质程序在肝脏
接下来,我们试图确定在表型的分子机制,由于PPARs肝脏中脂质代谢的关键。具体来说,PPARγ控制脂肪存储和PPARα调节β氧化。因此,在分子水平上,我们检查了PPARs表达式及其下游代谢基因在小鼠肝脏通过逆转录-聚合酶链反应,发现PPARγACC2,及其目标基因,包括ACC1 FAS, SCD1,和SREBP1-C明显高于糖尿病+ KD老鼠在减毒KD和运动的结合(数据6(一)- - - - - -6 (f))。此外,PPARα和它的β氧化的目标基因,如竹荚鱼和Acox1显著降低糖尿病+ KD老鼠和被有氧运动对小鼠肝脏的影响(数据6 (h)- - - - - -6 (k))。除此之外,我们还观察到肝脏Glut2 mRNA表达减少KD和KD + AE组,建议改善血糖控制的糖尿病小鼠(图6(左))。FGF21促进脂质分解代谢、酮生成和糖质新生,改善胰岛素敏感性和PPAR的基因是一个重要的目标α在肝脏34,35]。我们发现FGF21水平高度表达KD组和进一步提升KD + AE组,这表明FGF21水平升高可能是负责的有利影响AE结合KD(图6 (k))。此外,蛋白质含量的脂质和糖代谢的关键调节因素与mRNA水平(数据一致7(一)- - - - - -7 (f))。
(一)
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(j)
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(左)
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(d)
(e)
(f)
AMPK是另一个关键代谢调节肝细胞。我们发现P-AMPK PPAR / AMPK水平表现出相似的变化模式α(补充图了1),这表明锻炼预防生酮饮食诱导脂质紊乱通过减少脂质通过PPAR存储γ,同时增加脂质β通过PPAR氧化αAMPK。
4所示。讨论
先前的研究表明,生酮饮食对糖尿病有好处和可能使用的方法在糖尿病胰岛素抵抗。在这项研究中,我们表明,生酮饮食和有氧运动可以改善血糖控制,同时减轻肝脂肪变性的不利影响36]。此外,我们发现后6周的干预,老鼠接受生酮饮食和生酮饮食结合有氧运动都有较低的身体重量,HbAlc水平,HOMA指数和高胰岛素敏感性(18,21,37,38),与糖尿病对照组相比。然而,我们的研究结果还表明,随机分配到生酮饮食的老鼠有各种副作用包括高总胆固醇,甘油三酯和血清ALT和AST,糖尿病对照组相比,它可以在很大程度上扭转通过有氧运动训练(27,29日,39]。因此,我们的数据表明有氧运动结合生酮饮食可能是一个新颖的治疗方法治疗非酒精性脂肪肝和糖尿病。
近一个世纪以来已经过去了生酮饮食最初是用于治疗的疾病,现在先进的基于生酮饮食疗法可用于糖尿病(40]。先前的研究已经得出结论,限制碳水化合物的膳食对代谢和心血管参数导致积极作用[38,41,42]。经典的生酮饮食是一种高脂肪、低碳水化合物饮食,导致酮体生产通过禁食脂肪代谢与模仿的目标状态在身体的组织中,将主要从碳水化合物脂肪热量来源。这个减肥法被用于各种各样的健康影响。先前的研究已经报道,生酮饮食有助于减肥,在食源性肥胖病人以及改善血糖控制和糖尿病代谢参数。例如,一个低碳水化合物生酮饮食不仅降低血糖水平接近正常,也稳定胰岛大小和数量β细胞在糖尿病大鼠(19,21]。然而,潜在的副作用的生酮饮食也引起人们的关注,如高脂血症和肝脂肪变性(24,25,43]。在我们的研究中,我们发现肝脂肪变性后缓解结合生酮饮食和有氧运动训练,这可能是治疗糖尿病的新策略。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是最常见的肝脏代谢综合症的表现影响了三分之一的成年人在富裕国家,和大多数肥胖者44]。在中国,大约有20%的成年人在一般人群非酒精性脂肪肝。乏味的脂肪变性被认为有一个相对良性预后liver-related结果而言;肝病患者可以进展到肝硬化及其并发症,包括肝癌(27]。过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)主lipid-activated转录因子发挥关键作用在肝脏脂质代谢的调节,它属于一个类的核受体,因为他们的关键作用的转录调节介质的葡萄糖和脂类代谢45]。PPARs激活绑定到一个相对保守的DNA序列DNA转录的基因附近的目标。PPARs集团由三个不同的亚型表达谱在不同组织和配体特异性:PPARα,PPARβ/δ,PPARγ。
在肝脏、过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARα)函数主调节器的脂质代谢,尤其是在禁食期间,通过激活过程,如脂肪酸氧化和酮生成脂肪酸吸收和甘油三酯代谢和存储(33]。PPAR的有利影响α非酒精性脂肪肝/纳什已被证明在几个治疗小鼠模型的高脂肪饮食和高热量饮食征收寓禁税。PPARα零老鼠将开发一个严重的肝脂肪变性(46]。通过鼓励通量通过机会和酮生成,PPARα信号限制了肝脂质积累。这可以防止肝脏氧化应激,活性氧的产生和脂质过氧化反应产品针对肝脂质积累过剩[47]。在食物不足的时期,PPARα促进肝葡萄糖和酮生产和防止lipotoxicity。另一方面,PPARγ是脂肪形成和肝脂肪变性nutrition-induced因素(48]。PPAR的表达γ在应对营养过剩引起的肝脏。此外,hepatocyte-specific PPARγ表达式是积极与脂肪肝在小鼠模型49]。例如,PPAR的过度γ导致肝脂肪变性和hepatocyte-specific PPAR的淘汰赛γ降低肝脂肪含量在HFD-fed老鼠50]。在这项研究中,我们发现有氧运动结合生酮饮食治疗能减少肝PPAR的表达式γACC1,其目标基因包括SREBP-1C SCD-1, FAS,以及增加的PPAR水平α及其下游靶基因如ACOX1,竹荚鱼,CPT1 -α,FGF21表明PPARs可能至少部分负责代谢影响的干预。
脂肪从头合成脂肪堆积在肝脏是一个关键机制(51),这通常是与抑制活化蛋白激酶(AMPK) [52,53]。AMPK是一个关键代谢总开关在肝细胞,激活运动(54]。一旦激活,它将阻止合成代谢途径,促进分解代谢的途径和保护细胞免受各种应力刺激,如导致增加脂肪酸氧化和抑制脂肪酸合成的肝细胞(54]。AMPK活化进一步磷酸化和灭活ACC,调节脂肪生成的近端和病原反应步骤55]。在这项研究中,我们观察到有氧运动结合生酮饮食显著增加AMPK磷酸化,AMPKα1,AMPKα2蛋白质丰度相比,生酮饮食的老鼠。此外,有氧运动结合生酮饮食显著增加肝PPARα蛋白质丰度和PPAR下降γ相比,与生酮饮食组(56]。先前的研究认为antihepatic AMPK脂肪变性的影响可能与脂肪形成的关键分子扩散的规定,如PPARs。综上所述,从获得的数据我们的动物研究表明,有氧运动训练,加上生酮饮食改善糖尿病、肝和可能涉及激活AMPK和PPARs通路在肝57- - - - - -59]。
肝脂肪变性反映肝过剩的油脂,经常通过多种机制诱导,包括饮食和解放的通量增加内脏FA,增加肝合成,和减少肝FA氧化(60]。到目前为止,还没有批准的药物治疗非酒精性脂肪肝的治疗。流行病学研究表明,运动是患者的一线治疗肝脂肪变性(29日]。受损的有氧运动能力和骨骼肌功能障碍似乎与代谢相关疾病,如肥胖、脂肪肝和糖尿病。同时,众多信号通路参与肝脂肪变性的发生和发展及相关代谢障碍,和这些通路也相互作用。在这个研究中,我们关注的角色AMPK / PPARs,虽然我们不能排除这种可能性,其他代谢因素可能参与这个过程。因此,进一步的调查使用AMPK和PPARs敲除小鼠细胞或模型是有用的解决这些问题。
传统的锻炼指导都集中在低到中等强度的运动,因为运动如散步很容易实现且相对安全。然而,这样的日常生活活动可能无法提供一个适当的刺激增加心肺健康。高强度间歇训练(这种训练),包括简短的突发性剧烈运动隔开一段休息或恢复,近年来受到关注糖尿病(61年,62年和非酒精性脂肪肝29日,63年,64年]。目前的数据表明,处理这种训练可以迅速提高血糖控制糖尿病和改善肝脂肪变性。它需要进一步观察是否这种训练比有氧运动更可行的非酒精性脂肪肝患者心肺功能不佳或为那些不能容忍或参与有氧运动。
集体,这里给出的数据表明有氧运动训练,加上生酮饮食可能发挥病理上重要的作用在调节肥胖、糖尿病和肝脏脂肪变性,这在很大程度上是依赖的调控AMPK / PPARs信号。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金(31671241)、上海浦江计划(pj1402700 17日),中国博士后科学基金会(2017 m611499)。
补充材料
补充图 :AMPKα1,AMPKα2水平在糖尿病组小鼠肝脏,糖尿病+ KD组和糖尿病+ KD + AE组。补充表 :饮食中使用研究的成分组成。补充表 :正向和反向引物用于实时PCR用于这项研究。(补充材料)