文摘

客观的。先前的研究特点的王亚南和消炎齐墩果酸(OA)。本研究旨在探讨OA hepatoprotection的分子机制伴刀豆球蛋白A - (ConA)诱导急性肝损伤。材料和方法。ConA(20毫克/公斤)是通过静脉注射诱导急性肝损伤在Balb / C小鼠。OA预处理(20、40和80毫克/公斤)皮下注射治疗前连续3天每天一次ConA;2、8、24小时ConA注射后,血清肝酶水平和组织病理学和炎性细胞因子测定的主要因素。结果。OA降低血清肝酶和炎性因子的释放和阻止ConA介导损伤肝脏。OA的表达水平升高过氧物酶体proliferator-activatedα受体(PPARα)的磷酸化和减少c-Jun NH2-terminal激酶(物)。结论。OA展览期间消炎ConA-induced急性肝损伤PPAR的衰减细胞凋亡和自噬通过激活α物的差别,对这些信号。

1。介绍

肝脏代谢和免疫器官,执行多种功能,包括还原、糖原存储、蛋白质合成和分泌。肝损伤的发病可能发生在回应各种因素,如过度饮酒、感染、化学药物和自身免疫性疾病(1]。伴刀豆球蛋白(ConA)是一种促有丝分裂的植物凝集素提取Canavalia取代巴西橡胶树(2)已经被用于肝损伤模型在活的有机体内。ConA-induced肝损伤是一个行之有效的模型探讨肝损伤的发病机制3- - - - - -5),它的特点是肝酶升高和炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子-α,il - 1β、il - 4和il - 6,导致T细胞的激活,正弦内皮细胞(秒),和枯氏细胞(;)[3,6- - - - - -9]。此外,动物研究表明,细胞凋亡和自噬与ConA-induced肝损伤在c-Jun NH2-terminal激酶-(物)依赖的方式(10- - - - - -13]。Oleanonic酸(3β-hydroxyolean-12-en-28-oic酸,OA)是一个五环的萜类化合物发现的形式自由酸和三萜皂苷苷在植物(14,15]。先前的研究已经表明,OA及其衍生物具有抗癌,治疗糖尿病药,抗艾滋病、抗氧化、抗炎16- - - - - -20.]属性。然而,OA最王亚南特征属性,它缓解急性chemical-induced肝损伤和慢性肝纤维化和肝硬化(21,22]。OA甚至被用作一种非处方药物治疗肝脏疾病在中国(15]。虽然确切的机械的目标调制OA在肝损伤是未知的,几组表明,ERK,物,PI3K / Akt, Nrf2可能涉及(23- - - - - -27]。

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)是一组函数作为核受体的转录因子和调节基因的表达通过绑定heterodimeric伙伴类维生素a在特定PPAR-response元素X受体(28]。PPARs曾经是主要与脂质代谢有关,但后续的研究表明,PPARs参与炎症和免疫的规定(29日,30.]。PPARα,肝细胞中大量表达,心脏、肌肉组织,脂肪组织,和肾脏PPARs三种亚型识别(α,β/δ,γ)。研究已经证实,PPARα是脂质代谢的转录激活和抑制急性期免疫在人类和啮齿动物(31日]。PPARα也涉及改变B和T淋巴细胞的发展30.,32]。

本研究旨在探讨OA在ConA-induced肝损伤和底层信号通路与其王亚南关联属性。基于OA的hepatoprotection机制引起的肝损伤等小分子phalloidin [33),亚兰(34),对乙酰氨基酚(25),我们假设OA减毒ConA-induced PPAR肝损伤α——JNK-dependent方式。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

ConA和OA从Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)微型板块从南京建成生物工程研究所获得测试套件(建成生物技术,中国)。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒获得来自eBioscience(美国圣地亚哥,CA)。RNA聚合酶连锁反应(PCR)装备购买从豆类生物技术(中国大连)。PPAR的抗体α物,p-JNK TRAF2,伯灵顿,bcl - 2, LC3, Beclin 1, caspase-3 Proteintech提供的(美国芝加哥,IL)。的il - 1β、il - 6和TNF -α抗体来自Abcam(美国Cambridge, MA)。的TdT-mediated dUTP尼克结束标记(TUNEL)细胞凋亡测定装备是罗氏公司(瑞士巴塞尔罗氏有限公司)。

2.2。动物

雄性Balb / c小鼠,6 - 8周,体重23±2 g,由上海SLAC实验动物有限公司(上海,中国)。老鼠被安置在塑料笼子里的温度24°C与12 h明暗周期和提供食物和水随意。我们所有的动物实验符合美国国立卫生研究院的指导方针和动物保健和使用委员会批准的上海同济大学。没有动物死亡或成为重症之前到达我们的实验端点。

2.3。实验设计

OA准备作为注射悬浮液与橄榄油和管理连续3天每天一次皮下注射剂量的20、40岁或80毫克/公斤之前ConA注入。ConA被溶解在盐水浓度为2.5毫克/毫升,注射的剂量20毫克/公斤(35,36在尾静脉诱导急性肝损伤。

小鼠随机分为7组:(1)正常对照组( ):小鼠给予生理盐水。(2)石油对照组( ):小鼠接受同等体积的橄榄油。(3)OA组( ):老鼠给40毫克/公斤OA悬挂。(4)ConA集团( ):老鼠注射20毫克/公斤ConA通过尾静脉。(5)ConA + 20毫克/公斤OA组( ):老鼠给20毫克/公斤OA 3天前ConA注入。(6)ConA + 40毫克/公斤OA组( ):老鼠给40毫克/公斤OA 3天前ConA注入。(7)ConA + OA组(80毫克/公斤 ):小鼠接受80毫克/公斤OA 3天前ConA注入。

2.4。生物化学分析

retroorbital出血,血液样本收集,收集血液离心机在3000 r / min 10分钟在4°C获得血清。活动的血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)测定使用商业分析工具。il - 1的水平β、il - 6和TNF -α按照制造商的说明使用ELISA试剂盒测定,。

2.5。组织病理学和量化的肝损伤

肝组织从左叶的一部分,被固定在4%多聚甲醛,嵌入在石蜡,5微米厚的部分切片,苏木精和伊红染色())。炎症和组织损伤评估使用光学显微镜。5字段(200 x放大)从4到6个人评估动物每组由一位有经验的病理学家。肝脏部分失明的观察者。坏死区域的百分比被用于统计分析(37]。坏死的严重程度和分布的基础上,整个坏死病变是由一个评分系统评价等级从0到4:0:没有;1:温和;2:温和;3:标记;4:严重分散。

2.6。免疫组织化学

肝组织准备为石蜡包埋部分,在二甲苯脱蜡,在乙醇脱水。抗原检索是通过使用柠檬酸缓冲和孵化95°C水20分钟。阻止内生氧化酵素的活性,部分被孵化的3%过氧化氢为10分钟37°C。非特异性结合被5%的牛血清白蛋白为30分钟。肝脏部分被孵化一夜之间在4°C以下主要抗体和稀释:il - 1β(1:100),il - 6 (1: 100), TNF -α(1:100),PPARα(1:50),phospho-JNK (1: 100), LC3 (1: 50), Beclin 1 (1: 50)、bcl - 2(1: 100),和伯灵顿(1:100)。片被洗了三次与二次孵化抗体。diaminobenzidine工具包是用来测量抗体绑定在光学显微镜下。彩色和总面积的比率计算使用Image-Pro +软件(版本6.0)。

2.7。TUNEL染色

准备的石蜡切片在二甲苯脱蜡5 - 10分钟两次,用乙醇脱水。蛋白酶K没有DNase添加20微克/毫升的浓度为15 - 30分钟。TUNEL反应缓冲区添加到片洗后根据制造商的协议,和部分光学显微镜下观察凋亡细胞的数量。

2.8。量化的信使rna逆转录聚合酶链反应(rt - PCR)

在肝组织总RNA reverse-transcribed成cDNA使用逆转录工具包(豆类生物技术,中国)和由此产生的cDNA用于实时PCR分析使用SYBR预混料交货Taq(豆类生物技术、中国)7900 ht快速实时PCR系统(应用生物系统公司、钙、美国)。寡核苷酸引物序列表中列出1。计算使用的相对表达水平 方法和规范化β肌动蛋白。

表1
寡核苷酸引物序列用于存在。
2.9。免疫印迹分析

总蛋白提取使用无线电免疫沉淀反应分析裂解缓冲与蛋白酶抑制剂(PI) phenylmethane-sulfonyl氟从肝组织和存储在−80°C。蛋白质浓度测定用BCA化验设备根据制造商的指示(Kaiji,中国)。等量的蛋白质(120微克)在7.5% - -12.5% SDS-polyacrylamide凝胶分离,然后转移到聚偏二氟乙烯膜。非特异性结合与磷酸盐(PBS)含0.1%阻塞渐变20 (PBST)和5%脱脂牛奶(PBS)溶解1 h,一夜之间,和膜被孵化在4°C以下主要抗体和稀释:β肌动蛋白(1:1000)LC3 (1: 1000), Beclin 1 (1: 500), bcl - 2(1: 1000),伯灵顿(1:500),caspase-3(1: 500)、物(1:1000),phospho-JNK(1: 500),和TRAF2 (1: 1000)。膜与PBST清洗三次,孵化与辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit或anti-mouse二级抗体(1:2000)在室温下1 h。最后,膜清洗三次与《奥德赛》的双色红外扫描激光成像系统。

2.10。统计分析

所有的数据都表示为±标准错误。组之间的差异进行了分析使用单向方差分析。一个 值< 0.05被认为是具有统计学意义。统计分析使用Graphpad棱镜软件(版本6.0,圣地亚哥、钙、美国)。

3所示。结果

3.1。齐墩果酸(OA)是安全的和可容忍的老鼠

确定OA的安全性和耐受性,18小鼠给予相同体积的生理盐水,橄榄油,或者OA(40毫克/公斤)暂停了3天,然后牺牲检查肝功能异常的迹象。没有明显差异肝酶和炎性细胞因子的表达水平之间的三组数据1(一)和1 (b))。肝活检显示没有病理形态学变化,以应对OA(图1 (c))。因此,办公自动化在这些老鼠似乎是安全的和可容忍的。

(一)
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(c)
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图1
OA是安全的和可容忍的老鼠。笔记。(a, b)的血清ALT和AST水平(a)和il - 1β、il - 6和TNF -α(b)表示为意味着±标准错误( , )。(c)代表苏木精和伊红())染色部分肝脏的生理盐水,橄榄油,OA治疗小鼠(放大200倍)。
3.2。OA减轻ConA引起的肝损伤

ConA注入后,我们发现秒;,CD4细胞+Th细胞被激活,导致高水平的细胞因子在肝细胞水肿和坏死(6,7]。ALT和AST水平也增加以应对ConA(图2(一个))。最重要的增加发生在8 h, OA明显缓解这些氨基转移酶的活动。减少ConA-dependent变化最突出的在中间给老鼠(40毫克/公斤)。如图2 (b)此外,肝组织石油集团显示保存完好的肝与完整的肝小叶结构。ConA政府8小时后,ConA组显示弥漫性坏死,拥堵,部分严重的炎症,肝小叶的完整性被破坏。在OA预处理组,缩小坏死区域,轻微的堵塞,和温和的淋巴细胞积累被认为治疗相比ConA孤独。这五组的肝组织模式2 h和24小时的类似于2 h。同样,在中间给老鼠(40毫克/公斤)显示最少的坏死。表2显示肝损伤的病理评分8 h后ConA管理。这些结果表明,预处理与OA可以减弱ConA-induced在小鼠肝损伤。

表2
肝损伤的病理评分8 h。
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(b)
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图2
病理性肝损伤引起ConA由OA减毒。笔记。(一)测定血清转氨酶活动2,8,静脉注射后24 h ConA 20毫克/公斤。橄榄油注入动物被用作控制。(b)代表苏木精和伊红染色的肝脏())。酒吧规模:200微米。坏死区提出了虚线,受伤的黑色箭头表示代表区域,蓝色箭头表示白细胞粘附血管内皮。坏死和水肿区域的百分比的基础上)肝脏部分进行了分析与Image-Pro + 6.0(原来的放大,×200)。数据提出了意味着±标准错误( ; 对石油和ConA; ConA + OA(20毫克/公斤)和ConA; ConA + OA(40毫克/公斤)和ConA; ConA + OA(80毫克/公斤)和ConA)。
3.3。OA预处理降低TNF -的生产α,il - 1β,il - 6在ConA-Induced肝损伤

最少、炎性细胞因子的表达水平均升高后ConA注入。肿瘤坏死因子-的mRNA和蛋白表达水平α和白介素2 h达到顶峰,然后拒绝在8 - 24小时,而il - 1的水平β达到8 h。预处理与OA显著降低细胞因子表达水平与ConA治疗小鼠相比,和中等剂量(40毫克/公斤)对衰减的影响最有效的炎症(数字3(一个)和3 (b))。此外,西方墨点法和TNF -α,il - 1β,il - 6免疫组织化学分析也证实,OA显著降低TNF -的生产α,il - 1β(数字,il - 6蛋白水平3 (c)和3 (d))。

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图3
OA变弱ConA-induced肝损伤的炎性细胞因子的产生。笔记。(a, b)的相对mRNA等离子体(a)和(b) TNF -α,il - 1β,il - 6水平2、8、24 h后ConA注入和较低的预处理(20毫克/公斤),中间(40毫克/公斤),和高剂量(80毫克/公斤)的办公自动化。(c)蛋白水平的TNF -α,il - 1β,il - 6被西方墨点法和灰色评估值计算。(d)免疫组织化学染色(TNF - 200 x放大)α,il - 1β后,il - 6在肝组织中8 h与ConA治疗。布朗区总面积的比例进行了分析与Image-Pro + 6.0 ( ; 对石油和ConA; ConA + OA(20毫克/公斤)和ConA; ConA + OA(40毫克/公斤)和ConA; ConA + OA(80毫克/公斤)和ConA)。
3.4。电脑耗材减少自噬和凋亡的ConA-Induced肝损伤

我们评估了激活的细胞凋亡和自噬通过测量caspase-3的表达水平,caspase-9, bcl - 2,伯灵顿,Beclin 1, LC3。先前的研究已经发现,caspase-3 caspase-9, bcl - 2,和伯灵顿扮演重要角色在调节细胞凋亡和Beclin 1和LC3已知介质的自噬。bcl - 2的表达水平,一个凋亡标记,在应对ConA表达下调,OA预处理废除这一效应。伯灵顿,caspase-3 caspase-9 Beclin 1和LC3都高度表达小鼠ConA,和这些水平相对较低回应OA预处理(数据4(一)和4 (b))。免疫组织化学分析和TUNEL染色证实这些结果(数据4 (c)和4 (d))。这些发现表明,OA调节自噬和凋亡和保护肝细胞免受ConA引起的病理损害。

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图4
OA调节自噬和凋亡在ConA-induced肝损伤。笔记。(a) mRNA水平caspase-3 caspase-9, bcl - 2、Bax, LC3, Beclin 1使用实时PCR测定。(b)蛋白表达caspase-3, bcl - 2、Bax, Beclin 1, LC3被免疫印迹评估。免疫组织化学(c)代表图像(200 x放大)的表达水平伯灵顿,bcl - 2, Beclin 1, LC3在接触ConA 8 h。(d) TUNEL染色(200 x放大)的肝组织8 h代表凋亡细胞( ; 对石油和ConA; ConA + OA(20毫克/公斤)和ConA; ConA + OA(40毫克/公斤)和ConA; ConA + OA(80毫克/公斤)和ConA)。
3.5。通过激活PPAR OA抑制ConA-Induced肝损伤α和物信号的抑制

先前的研究已经表明,衰减物信号能有效地缓解ConA-induced肝损伤,PPARα参与炎症和免疫调节。因此,我们假设PPARα和物信号参与OA的王亚南效应。

我们发现PPARα蛋白质和mRNA水平显著降低ConA治疗小鼠,预处理和OA废除这种效果。TRAF2的蛋白质和mRNA水平的磷酸化物ConA组明显增加,OA TRAF2的表达水平降低和激活物(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。我们的研究结果支持这样一个前提:OA有能力减弱ConA-induced PPAR的肝损伤,激活α和抑制物的信号可能是一个潜在的机制(图6)。

(一)
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图5
OA调节PPARα和物信号ConA-induced肝损伤。笔记。(一)PPAR的信使rna表达水平α和TRAF2使用实时PCR检测。(b)蛋白表达水平的PPARα、TRAF2总物,phospho-JNK测定用免疫印迹。免疫组织化学(c)代表图像(200 x放大)被用来评估PPAR的表达水平α8 h后,TRAF2 phospho-JNK接触ConA ( ; 对石油和ConA; ConA + OA(20毫克/公斤)和ConA; ConA + OA(40毫克/公斤)和ConA; ConA + OA(80毫克/公斤)和ConA)。

图6
的示意图表示通路ConA OA调制的反应。在我们ConA-induced肝损伤模型,OA激活PPARα导致减少细胞因子的表达,包括TNF -α,il - 1β,il - 6。肿瘤坏死因子- OA也变弱物信号激活α。此外,OA抑制物的磷酸化。bcl - 2激活物抑制活动,从而促进caspase-9激活引起的伯灵顿Beclin 1的表达和激活。OA展品王亚南通过衰减影响细胞凋亡和自噬通过调节物信号和激活PPARα。

4所示。讨论

办公自动化是一个五环三萜见于多种中药材(14]。由于其王亚南属性,OA在中国发达的口服药物治疗急性和慢性肝脏疾病(15]。刘等人。38)表明,王亚南OA的影响并不明显,直到24 h后曝光,但保留了至少72 h。然而,OA hepatoprotection在肝损伤的潜在机制仍不明。

大量动物研究表明OA预防肝损伤引起的小分子像phalloidin,亚兰,和对乙酰氨基酚,通过降低血清转氨酶水平,防止坏死(33,34,38]。进一步研究OA调节的通路,我们建立了一个模型,ConA-induced肝损伤和验证了王亚南OA的影响。在我们的研究中,ConA血清转氨酶水平升高,这表明ConA会损害肝细胞,诱导小鼠肝脏病理损伤。最少、OA减毒的影响ConA和缓解ConA介导的肝损伤和炎症。

王等人。8)曾研究老鼠ConA-triggered免疫反应的机制。ConA甘露糖结合显示腺在秒的表面,促进其绑定;。CD4+Th细胞可以识别ConA-modified;提出的主要组织相容性复合体,成为激活,调节细胞因子的释放和TNF -α。秒;还会分泌il - 1和il - 6,这表明;和秒调解随着CD4肝损伤+Th细胞。我们的研究表明,预处理与OA减轻炎性反应由ConA一样,因为它减少了促炎细胞因子的水平。

它已经表明,OA发挥其保护作用通过绑定和激活PPAR核受体,PPARα(39),参与炎症和免疫调节。PPAR的基因消融α能促进NF -ΚB和c-jun激活T淋巴细胞,从而导致增加生产干扰素-γ和TNF, 2 Th2细胞因子的表达水平较低(32]。因此,我们推测,OA可促进PPAR的表达α。事实上,我们发现ConA可以减少PPARαmRNA和蛋白表达水平,废除了预处理与OA的影响。

肿瘤坏死因子-α和il - 1β已知活化剂物信号(40- - - - - -42]。TNFR2结合TRAF2直接诱导TRAF2退化和激活物,调节基因转录(43]。OA已表现出抑制物的磷酸化,衰减B细胞功能障碍和线粒体凋亡33,44]。辨别物信号的贡献OA的能力,以缓解ConA-induced肝损伤,我们评估了物的磷酸化和bcl - 2的表达水平,伯灵顿,Beclin 1, LC3B caspase-3, caspase-9肝组织。当磷酸化,物把从细胞质到细胞核,调解的磷酸化和激活转录因子c-Jun和上调表达的proapoptotic Bcl2-associated伯灵顿和表达下调基因bcl - 2的表达,从而通过caspase-9促进细胞凋亡和caspase-3 [45]。我们发现物的磷酸化和伯灵顿的表达,caspase-3,和caspase-9高架ConA, bcl - 2的表达降低的时候,OA逆转的影响。因此我们推断OA变弱通过物的抑制肝细胞凋亡。此外,物已经被证明可以促进Beclin - 1的转录(46]。Beclin 1中,首次发现哺乳动物自噬蛋白(47),据报道与抗凋亡蛋白Bcl - 2以及其他Bcl家庭成员通过BH3 (Bcl - 2同源性3)领域,导致抑制Beclin 1活动和自噬[48- - - - - -50]。作为一个自噬效应蛋白LC3 (microtubule-associated蛋白质1轻链3)可以调节自噬水平通量,可以用作标记的自噬激活(51- - - - - -53]。OA预处理废除Beclin - 1表达水平的增加和LC3由ConA,表明OA也减轻肝损伤,抑制自噬。

总之,OA展品通过激活PPAR王亚南效果α通过抑制物和抑制细胞凋亡和自噬信号。

的利益冲突

作者报告没有利益冲突有关的出版。

确认

作者表达他们的感谢中心实验室的所有成员上海第十人民医院同济大学。特别感谢将Xiangyue余教授的援助从临床病理诊断中心,上海第十人民医院。这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81670472和81670472)。

补充材料

支持我们的观点,齐墩果酸是纯粹充当PPARα配体在这种情况下,实时聚合酶链反应和免疫印迹被用来评估CPT1A的表达水平和ACOX1 PPAR的目标基因α。补充图所示,信使rna和蛋白质的表达CPT1A ConA组和ACOX1都减少了,而这些水平显著调节响应OA预处理。我们的研究结果进一步表明,OA肝脏保护通过扮演PPAR展出α配体。OA与CPT1A和ACOX1 ConA-induced肝损伤。注:(A) mRNA表达水平CPT1A和ACOX1与实时PCR测定;(B)蛋白表达水平的CPT1A和ACOX1测定使用免疫印迹( ; 对石油和ConA; ConA + OA(20毫克/公斤)和ConA; ConA + OA(40毫克/公斤)和ConA; ConA + OA(80毫克/公斤)和ConA)。(补充材料)