液体潴留引起的罗格列酮增加AQP2和有关α即膜表达

文摘

过氧物酶体扩散者激活受体-γ(PPARγ配体依赖性转录因子)是一个核激素受体超科。PPAR的磷酸化作用下降γ由于罗格列酮(ROS)的主要原因是抗糖尿病药引起的胰岛素敏感性增加。然而,没有明确的证据是否p-PPAR的核易位刺激ROS液体潴留有关。现在还不清楚p-PPAR的易位与的变化aquaporin-2 (AQP2)和上皮钠通道α亚基(α博)细胞膜、细胞质和细胞核。我们的实验表明,活性氧显著会使核p-PPAR并增加膜AQP2和α钠;然而,SR1664 (nonagonist PPARγ配位体)减少p-PPARγ和对AQP2没有影响α钠。因此,我们得出这样的结论:体外液体潴留引起的活性氧与增加膜相关联α钠和AQP2但没有相关性PPAR的磷酸化 。

1。介绍

罗格列酮(ROS),一个典型的临床口服抗糖尿病药,是PPARγ受体激动剂;研究表明,PPAR的磷酸化作用下降由于活性氧的增加胰岛素敏感性的主要原因造成的这种药物(1]。然而,长期的临床观察表明,活性氧的副作用是液体潴留,导致心脏衰竭(2,3]。SR1664,一种新型复合开发的斯克里普斯研究所的美国和其他机构,是PPARγ配体激活PPARγ抑制PPARγ爵士^273年磷酸化,从而增强胰岛素敏感性,从而发挥作用在治疗2型糖尿病(4]。然而,体内实验表明,SR1664可以增加胰岛素敏感性,不会导致液体潴留(5]。

大量研究表明,液体潴留AQP2和密切相关α即蛋白质(6,7),和体外实验表明,AQP2和的表达α钠是PPAR后调节受体激动剂治疗(8,9]。然而,ROS在膜的机理,细胞质和核AQP2和α博还有待澄清。在这项研究中,我们调查了活性氧的影响,SR1664和肿瘤坏死因子α(增加PPAR的磷酸化)p-PPARγAQP2,α钠在HEK293 mIMCD-3细胞,然后用PPAR coincubatedγ拮抗剂GW9662;结果表明,该效果消失。所以我们得出结论,在体外PPAR的减少γ磷酸化和液体潴留的关系不大,液体潴留引起的ROS主要相关的增加膜AQP2和α钠。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

试剂购买从下列来源:罗格列酮和GW9662(σ,圣路易斯,密苏里州);rpmi - 1640中(GIBCO英杰公司)和胎牛血清(的边后卫;沈阳Huibai生物技术有限公司);(3)- 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyl四唑(MTT);Biosharp);和ECL免疫印迹检测试剂(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。选择使用多克隆抗体,抗体PPARγ(圣克鲁斯、钙、美国),p-PPARγ(美国CA Proteintech),α美国ENaC (Santa Cruz), AQP2(圣克鲁斯,美国),和β微管蛋白(美国圣克鲁斯);FITC Alexa 488 -共轭山羊anti-rabbit二级抗体来自圣克鲁斯生物技术(美国);和辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit二级抗体来自Proteintech(美国)。

2.2。细胞培养和管理

小鼠肾内髓集合管(mIMCD)细胞(上海Bogu生物科技有限公司)和人类胚胎肾细胞(HEK293)(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)常规培养rpmi - 1640年中补充10%的边后卫和抗生素(美国赛瓦& AMRESCO),在一个湿室包含5%的股份有限公司₂在37°C。综合管理方案如下:当细胞达到80% - -90%融合,GW9662 (5μ米)是孵化前6小时的ROS (1, 10μ米)或SR1664 (1, 10μ米)。24小时后,提取总收集细胞,细胞质,细胞核,或膜蛋白,分别。

2.3。细胞生存能力实验

MTT测定,细胞被播种 每到96细胞——文化板块和允许种植治疗后24 h与不同浓度的ROS, SR1664, GW9662, TNFα或ROS和SR1664结合GW9662。去除介质后,MTT方法在PBS(5毫克/毫升)添加和孵化4 h和由此产生的甲瓒是随着DMSO (150μl)。吸收测量在490纳米多功能酶标记工具。

2.4。制备的蛋白质样品

2.4.1。总蛋白的制备

里帕裂解缓冲被加入到细胞降雨雪和resuspended。30分钟后溶解在4°C,溶解产物是离心机在12000 g 20分钟,和获得的上层清液总蛋白。

2.4.2。细胞质和核的制备蛋白质

试剂溶解在室温下,将立即在冰上。然后,200年μl细胞质蛋白质提取试剂(1毫米PMSF被添加几分钟之前)被添加到20 -μl细胞降雨雪。五秒的涡进行以确保足够的再悬浮,其次是孵化冰上10 - 15分钟。然后,10μM细胞质蛋白质提取试剂B是补充道。涡流又执行5 s,其次是孵化冰1分钟。离心当时在12000 g和4°C 5分钟,和获得的上层清液被用来作为细胞质蛋白质。然后,50μl (PMSF-added核蛋白质提取试剂添加到核颗粒,其次是涡流为15 - 30年代,以确保完整的悬挂和传播。在冰上孵化之后,涡流30年代进行了30分钟的每1 - 2分钟。其次是涡流在4°C 12000克10分钟,得到的上层清液是用来表示核蛋白质。核和胞质提取物使用BCA测定蛋白质含量进行分析。

2.4.3。膜蛋白的制备

细胞膜分数是按照制造商的指示准备的。1毫升膜蛋白提取试剂与PMSF添加到2 - 5欧元细胞,温和的和完整的悬挂,其次是孵化冰10 - 15分钟。接下来,离心法被应用于700克10分钟在4°C。这个过程得到的上层清液然后离心机在14000 g 30分钟在4°C沉淀膜碎片,得到上层清液是用来表示细胞质蛋白质。沉淀也在14000 g离心10 s在4°C和疲惫的上层清液完全。然后,在200年的μl的膜蛋白提取试剂B,涡流进行5 s再悬浮,其次是孵化冰上5 - 10分钟。前面的步骤被重复1 - 2次提取完全膜蛋白。随后,完成了14000 g离心5分钟在4°C,获得的上层清液被用作膜蛋白。膜提取使用BCA测定蛋白质含量进行分析。

2.5。免疫印迹分析

细胞被第一次洗冷PBS和细胞溶解在里帕缓冲区的三倍。BCA蛋白质分析是用来确定样品的蛋白浓度。等量(25 ug)细胞蛋白被加载到每个好,10% sds - page分离与5 x变性后加载缓冲区,然后转移到PVDF膜,在5%的脱脂奶粉2 h孵化瓶在室温和然后用PPAR孵化γ(1:500),p-PPARγ(1:500),AQP2 (1: 800)α钠(1:800)抗体,分别;β-tublin(1: 1000)是作为内部控制。最后,屁股也孵化与二次抗体(1:5000)和使用ECL发光增强流体可视化。

2.6。免疫细胞化学

收集细胞对数生长期,调整后的细胞悬液密度 细胞/毫升消化后,细胞接种在盖玻片的药物浓度稀释培养基,培养在37°C 24 h,和阻塞30分钟没有光在室温下(4%多聚甲醛(PFA), 0.2% Triton x - 100和5% BSA)。隔夜孵化与初级抗体(稀释1% BSA)是在4°C其次是30分钟的孵化与二次抗体(稀释1% BSA)。清洗与PBS然后执行三次10分钟每一步后,随着接触100 ng / ml赫斯特33258染料10分钟,然后再清洗与PBS 5分钟三次。最后,共焦显微镜使用60 x油目标执行在尼康C2-si激光扫描共焦显微镜,并使用Photoshop软件图像被操纵。

2.7。数据分析

所有独立实验至少重复三次,和数据表示为均值±s.e.m。统计分析使用SPSS 17.0进行了单向方差分析(方差分析)。LSD的测试是用来比较组间差异意味着;如果方差不同,Dunnett以及使用。的值 被认为代表一个显著差异,而 被认为存在非常显著差异。

3所示。结果

3.1。细胞生存能力分析

首先,考虑ROS的细胞毒性效应,SR1664, GW9662和肿瘤坏死因子α(3)- 4 5-dimethylthiazol-2-y1 2, 5-diphenyltetrazolium溴化实验(MTT)被用来确定这些药物的剂量和联合疗法。管理ROS、SR1664 GW9662为0.1,1,10μ(数据1(一)和1 (b))和肿瘤坏死因子α1、5、10 ng / ml(图1 (c))HEK293细胞和mIMCD-3细胞显示对细胞生存能力无显著影响。这些代理(图相结合的管理1 (d)也没有这样的效果。

3.2。免疫荧光分析

核受体的激活促进转录因子的易位细胞质细胞核改善转录因子的转录活动响应元素绑定(分子)的蛋白质。因此,细胞免疫荧光实验是用来检测核受体PPAR的分布的变化γ受体激动剂管理后,根据绑定的绿色荧光细胞质和细胞核;赫斯特染色细胞核和表示PPAR的本地化γ在细胞。结果如图所示2,表明,ROS政府后,绿色荧光的细胞核增加的价格相比空白组。数据分析表明,没有显著差异在这个活动在细胞质中,但它在细胞核明显增加。

3.3。ROS对PPAR的影响γ,p-PPARγAQP2,α即在HEK293细胞中

对活性氧对PPAR的影响进行调查 ,p-PPAR ,AQP2,α即在不同的位置,总、核电、膜和胞质蛋白提取。数据显示,ROS在10μ核PPAR M可显著提高(N-PPAR)(图3(一个)),但总p-PPAR表达下调(T-p-PPAR)和核p-PPAR(N-p-PPAR对细胞质p-PPAR)和没有影响(C-p-PPAR)(图3 (b))。至于AQP2,膜(M-AQP2)和胞质(C-AQP2)蛋白水平增加(图3 (c)),而为α博,研究结果显示,只是膜(M -α博)易位增加(图3 (d))。与GW9662 coincubation之后,PPAR ROS的影响 ,p-PPAR ,AQP2,α即消失(图3 (e)- - - - - -3 (h))。

3.4。ROS对PPAR的影响γ,p-PPARγAQP2,α即在mIMCD-3细胞

验证上述研究结果在HEK293细胞中,相同的实验mIMCD-3细胞。数据表明,活性氧(10μ米)也极度增加核PPAR(图4(一)),总与核p-PPAR表达下调在mIMCD-3细胞(图4 (b)),增加的表达AQP2细胞质膜(图4 (c)),以及膜的表达钠(图4 (d))。在与GW9662 coincubation,这些影响(图消失了4 (e)- - - - - -4 (h))。与在HEK293细胞中结果是一致的。

3.5。SR1664和肿瘤坏死因子的影响α在PPARγ,p-PPARγAQP2,α即在mIMCD-3细胞

SR1664是一种新型的PPARγ配体块的细胞周期蛋白依赖性激酶5 - (Cdk5)介导的磷酸化PPARγ。研究表明,它能改善胰岛素敏感性降低葡萄糖和没有副作用,是ROS。确认这些影响,我们发现PPARγ,p-PPARγAQP2,α即在mIMCD-3细胞蛋白质。数据显示,SR1664 (10μ米)可以大大限制p-PPARγ(图5(一个));在coincubation GW9662,对p-PPAR的影响γ消失(图5 (b))。然而,AQP2的表达在细胞质膜和膜的表达α即表现出无显著差异(数字5 (c)和5 (d))。

Obesity-linked胰岛素抵抗与脂肪细胞的炎症有关。在不同类型的促炎细胞因子,肿瘤坏死因子α是第一个发现连接肥胖、炎症和胰岛素抵抗。值得注意的是,肿瘤坏死因子α在5和10 ng / ml可以上调p-PPARγ(图5 (e)),而没有影响α即在膜和细胞质中的AQP2膜(数字5 (f)和5 (g))。

4所示。讨论

在这项研究中,我们确定关系的原因导致液体潴留ROS和AQP2的表达α即在HEK293 mIMCD-3细胞。免疫荧光实验表明,细胞核后ROS增加应用程序中的绿色荧光的价格相比控制,说明活性氧可以激活转录因子的转录活动,促进他们从细胞质中转移到细胞核。接下来,我们研究了在p-PPAR ROS的影响γ在HEK293细胞和mIMCD-3细胞的蛋白质水平。如数据所示3 (b)和4 (b)、在HEK293和mIMCD-3细胞ROS (10μ米)会严重抑制PPARγ磷酸化,总体水平和细胞核内;在与GW9662 coincubation, PPAR的拮抗剂γ,所有的这些影响消失了。这些发现在一起,PPAR活性氧激活γ,导致减少p-PPARγ。

在此背景下,以确定是否p-PPAR的减少γ可能导致液体潴留,我们检查AQP2和的表情吗α即蛋白质,与体液内稳态(10,11]。AQP2的交易机制主要是由精氨酸加压素(AVP);当avon增加,胞质囊泡和腔膜融合,AQP2被转移到腔的膜,增加渗透率水(12]。基于这些发现,异常机制AQP2贩卖的数量会影响AQP2分子腔的膜(13]。在糖尿病模型小鼠体内,PPAR喂养γ受体激动剂、PCR检测结果表明,抗利尿激素没有显著变化,但AQP2显著增加(14]。我们的研究结果显示,ROS (10μ米)可以增加AQP2的表达在细胞质中,促进AQP2囊泡融合细胞膜;此外,与GW9662 coincubation之后,这些影响都抵消了。这些发现可能解释为ROS增加AQP2的表达式在收集管膜和水的重吸收增加,导致液体潴留。

肾钠(Na的监管⁺)处理是一个关键因素的长期控制细胞外体液内稳态。Na⁺重吸收是通过amiloride-sensitive介导上皮钠通道(钠),这对钠[展品高选择性15),是一个中央要求Na⁺在肾上皮细胞重吸收。即表达和易位的质膜是由不同的激素(严格监管16,17)和物理因素(18]。我们的实验表明,活性氧(10μ米)显著提高了膜的水平α博,因此越来越多的Na⁺流入腔,加速水重吸收,造成更严重的液体潴留。与GW9662孵化后,这种效应消失。

PPAR SR1664是小说γ配体(nonagonist PPARγ配体),阻止细胞周期蛋白依赖性激酶5 (CDK5)介导的磷酸化PPARγ。体内实验表明,它可以增加胰岛素敏感性,不会导致液体潴留(5]。本研究关注SR1664和AQP2 /之间的关系α即蛋白质体外,表明SR1664 p-PPAR使之抑制γ,但并没有造成任何重大AQP2和变化α即在膜,证明SR1664增加胰岛素敏感性而不影响水和钠离子通道蛋白表达。

激活PPARγ抑制TNF的表达α(19,20.)、肿瘤坏死因子α增加胰岛素拮抗激素水平的磷酸化的丝氨酸残基板的胰岛素受体,抑制酪氨酸磷酸化的受体,进而限制了信号传输(21]。此外,ROS和SR1664消除p-PPAR报道γ肿瘤坏死因子调节的α(22]。由于这些发现,我们也研究磷酸化PPAR的相关性γ引起肿瘤坏死因子αAQP2和α即表达。如图5,肿瘤坏死因子α在5和10 ng / ml可以上调p-PPARγ,但AQP2和的表达α即在细胞质膜并没有改变。

总之,体外诱导的液体潴留ROS密切相关的两个主要方面:第一类包括细胞质AQP2的增加和促进AQP2囊泡进行膜融合,从而增加水重吸收;第二个涉及ROS增强膜α即表达,从而加速Na⁺再吸收,进而增加水的吸收。相比之下,SR1664和肿瘤坏死因子α实验表明,PPAR是否激活γ上涨或下调并不影响AQP2和α即表达。从证据前,我们推断体外之间几乎没有联系的液体潴留引起的活性氧和PPAR的磷酸化γ。

的利益冲突

作者声明没有竞争和金融利益。

作者的贡献

京华徐和明月锅进行分子生物学实验和分析数据,和明月锅写的手稿。小丽王设计的方法。离石徐和李Lanfang准备数据和图像。程徐指导整个实验。京华徐和明月锅了同样的工作。

确认

作者感谢梨纹北京Edanz集团中国http://www.liwenbianji.cn/ac),编辑英语文本草案的手稿。

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