文摘

Pgc-1α及其各种亚型可能扮演一个角色在决定骨骼肌线粒体适应响应的饮食。膳食补充剂的8周内与类黄酮素槲皮素(Q)或红色洋葱提取物(ROE)高脂肪饮食(HFD)改善HFD-induced肥胖和胰岛素抵抗在C57BL / J小鼠移植Pgc-1α和增加骨骼肌线粒体数量和功能。老鼠,低脂肪(低频),高脂肪(高频),高脂肪加槲皮素(HF + Q)或高脂肪+红洋葱提取物(HF + RO)饮食9周内和骨骼肌Pgc-1α同种型表达和DNA甲基化是确定。量化各种Pgc-1α亚型,其中包括亚型Pgc-1α-a,Pgc-1α-b,Pgc-1α-c,Pgc-1α4,总NT-Pgc-1α,FL-Pgc-1α显示,只有总NT-Pgc-1α表达增加低频,高频+ Q,和HF + RO相比高频。此外,问补充减少Pgc-1α-a表达相比,低频和高频,罗伊下降Pgc-1α-a比低频表现。FL-Pgc-1α减少在HF + Q和HF + RO相比,低频和高频。高频展出260−核苷酸甲基化(nt)Pgc-1α启动子。Q和罗伊阻止HFD-induced甲基化。−260元甲基化水平联系在一起NT-Pgc-1α只表达。Pgc-1α同种型表达式可能epigenetically受Q和罗伊通过DNA甲基化。

1。介绍

过氧物酶体扩散者1α受体激活γ共激活剂(Pgc-1α)是一个坐标基因表达的转录共激活剂从核和线粒体基因组为了确定线粒体生物起源和功能(1- - - - - -4]。环境的诱导upregulationPgc-1α扮演着重要的角色在决定骨骼肌线粒体中重要的适应性衰减肥胖和胰岛素抵抗[1,4- - - - - -11]。能量和营养状况,如肥胖和糖尿病状态,和环境因素,如寒冷暴露,运动训练,和各种膳食成分,确定Pgc-1α表达式[1,2,4- - - - - -6,12]。例如,高脂肪饮食喂养(HFD)和棕榈酸酯治疗减少Pgc-1α表达式[6,12,13),而antiobesogenic和糖尿病膳食补充剂增加Pgc-1α表达式[7,13]。传统上,调节的分子机制Pgc-1α主要集中在蛋白质的转译后的监管影响蛋白质稳定性和绑定目标基因诱导转录激活的能力(1,14];然而,最近的调查显示了重要作用的表观遗传修饰Pgc-1α启动子发挥作用的转录调控和mRNA的表达,以应对环境和能源/营养输入[5,6,13,15,16]。运动训练、膳食脂肪含量、长链脂肪酸,糖尿病和超重或肥胖的存在都epigenetically调节Pgc-1α信使rna表达和下游在骨骼肌线粒体适应性(5,6,13,15,16]。

不仅是Pgc-1α转译后的转录监管,还有几个Pgc-1α亚型与小说和具体活动已确定(17- - - - - -19]。不同的表达模式Pgc-1α亚型也受环境刺激,包括寒冷暴露和运动训练,和肥胖的状态(15,17- - - - - -22]。到目前为止,超过十个亚型Pgc-1α已知存在,因不同的启动子的结合开始网站和可变剪接(23]。最广泛研究骨骼肌的亚型Pgc-1α-b、Pgc-1α-c Pgc-1α4,的n截拼接变体NT-Pgc-1α,完整的变体FL-Pgc-1α(17- - - - - -19,21,23,24]。虽然许多亚型具有重叠功能,一些已被证明有明显的功能在骨骼肌23]。例如,运动训练优先的上调表达亚型的选择,远端启动子区域,包括亚型Pgc-1α-b、Pgc-1α-c Pgc-1α4,总NT-Pgc-1α,和FL-Pgc-1α(23]。此外,Pgc-1α-a,Pgc-1α-b Pgc-1α-c,总NT-Pgc-1α,和FL-Pgc-1α是所有已知的扮演一个角色在运动性骨骼肌线粒体改编的19]。不同于其他运动型亚型,Pgc-1α4扮演一个角色在促进肌肉肥大(21]。最近,各种的亚型NT-Pgc-1α(NT-Pgc-1α-a NT-Pgc-1α-b,和NT-Pgc-1α-c)来自近端或远端启动子,为特征。所有NT-Pgc-1α亚型已被证明被诱导在高强度(NT-Pgc-1α-a)或低强度(NT-Pgc-1α-b和NT-Pgc-1α-c)锻炼,导致upregulation总NT-Pgc-1α发生在所有的运动强度(19]。此外,所有NT-Pgc-1α亚型和总NT-Pgc-1α是调节骨骼肌在爱卡治疗,已知的药理激活AMPK增加骨骼肌线粒体生物起源和脂肪酸氧化(19]。集体,已知亚型特别是骨骼肌线粒体中扮演的角色适应包括日期Pgc-1α-a、Pgc-1α-b Pgc-1α-c Pgc-1α4,总NT-Pgc-1α,FL-Pgc-1α。这些不同的表达模式拼接变异可能预防疾病的能力,过度的总数NT-Pgc-1α也是减弱HFD-induced肥胖(25]。有趣的是,最近的研究表明,表观遗传学可能扮演一个角色在决定信使rna剪接(26]除了它的角色在决定转录起始和−1核小体定位可能在决定中发挥作用FL-Pgc-1α和总NT-Pgc-1α表达骨骼肌在超重和肥胖与心血管疾病(15]。因此,Pgc-1α同种型表达式可能epigenetically监管在应对疾病和环境刺激,包括饮食输入。

槲皮素(Q)是一种防止bioflavanoid线粒体功能障碍和变弱HFD-induced肥胖和胰岛素抵抗在HFD补充时在低浓度(7,27- - - - - -32]。我们最近表明,低剂量(50 ug /天)饮食补充问或膳食补充剂的红洋葱提取物(ROE),含有等量的问苷(50 ug /天),增加骨骼肌线粒体数量和功能,从而更完整的脂肪酸氧化(7,32),类似于运动训练对骨骼肌的影响。然而,问的影响或罗伊通过微分调节的分子机制似乎发生在线粒体基因转录水平(32),这一过程可能是由转录coactivation控制的能力Pgc-1α。

探讨膳食脂肪的作用,净化饮食问,罗伊决定Pgc-1αDNA甲基化在骨骼肌与HFD-induced肥胖和胰岛素抵抗和详细说明如何这些表观遗传效应与拼接变量表达式,我们使用食源性肥胖C57BL / 6 j小鼠作为模型系统。我们假设先前观察到的线粒体基因表达模式和出版32)将与微分食源性PGC-1启动子的甲基化模式和监管的具体Pgc-1α亚型在骨骼肌线粒体发挥作用响应环境刺激的适应(17,18,21,25]。

2。材料和方法

2.1。动物和饮食

动物和饮食之前发表的协议(32]。简单地说,罗伊是如前所述[准备32)和制定纯化高脂肪饮食(千卡脂肪研究饮食D12451 45%)产生17毫克/公斤的槲皮素等价物(32]。5-week-old C57BL / 6 j小鼠(美国杰克逊实验室、巴尔港、MN)断奶到低脂肪饮食(低频;研究饮食12450 b, 10%千卡脂肪)饮食治疗1周,然后随机分为4组(/组):低频(千卡脂肪研究饮食12450 b, 10%);高脂肪(高频;研究饮食D12451, 45%千卡脂肪);HF + Q(千卡脂肪研究饮食D08072305, 45%)和17毫克/公斤槲皮素糖苷配基(恩佐生命技术alx - 385 - 001 - g005;美国纽约法明岱尔);或高频+ RO(研究饮食D08072306)。老鼠各自的饮食为9星期,在此期间48 h食品消费和体重和成分通过核磁共振(力量Minispec, Billerica,妈,美国)每周进行评估。小鼠安乐死后9周内喂养和股四头肌肌肉提取和快速冻结在液态氮进行进一步的分析。综述了所有实验和彭宁顿生物医学研究中心批准的机构动物保健和使用委员会。

2.2。亚硫酸氢DNA隔离和治疗

提供更多的同质样本,冰冻的股四头肌肌肉是地面下液氮使用杵和臼。地面肌肉被用于提取的基因组DNA DNeasy血液和组织工具包(试剂盒69581)通过制造商的协议。的数量和质量gDNA萃取分光光度法测定使用NanoDrop(热科学、威明顿、德、美国)。大约200 ng的gDNA受到亚硫酸氢转换使用亚硫酸氢EpiTect工具包(试剂盒59104)通过制造商的协议。

2.3。酸性亚硫酸盐测序

酸性亚硫酸盐测序进行试剂盒PyroMark抓起平台(试剂盒9001514)。亚硫酸氢转换gDNA PCR扩增使用EpiTect MSP工具包(试剂盒)和生物素化的引物瞄准Pgc-1α基因。人类的引物序列,放大的区域Pgc-1α子周围260−核苷酸网站之前发表(6]。这里,引物序列(IDT)放大和生物素化的相应区域内mm10参考基因组甲基化位点周围正在使用PyroMark PCR试剂盒(试剂盒978703)/制造商的指示。生物素化的DNA然后被焦磷酸测序PyroMark抓起(试剂盒9001514)用PyroMark金试剂(试剂盒),遵循制造商的指示。PyroMark分析软件被用来确定DNA甲基化的百分比在260−核苷酸(nt)。

2.4。RNA隔离

股四头肌肌肉组织的总RNA提取使用Tri-Reagent(分子研究中心,辛辛那提,哦,美国)其后进一步净化RNeasy迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA),如前所述[32]。的数量和质量RNA分析分光光度法(NanoDrop, nd - 1000,热科学、威尔明顿,美国)。反转录成RNA cDNA图书馆使用M-MLV逆转录酶(WI Promega,麦迪逊,美国)。

2.5。中存在

执行中存在利用以前发表的引物对,目标不同Pgc-1α亚型(17,18,21]。引物序列见表1。所有的样品都在重复ABI QuantStudio 6 Flex平台上运行(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)使用SyBR绿色MasterMix(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。基因表达分析使用标准曲线和规范化还有B内生控制。数据表示为任意单元(AU)。

2.6。统计分析

数据与GraphPad Prism 5.0统计分析软件进行分析。结果表示为±标准错误。食品消费和体重构成参数分析重复测量方差分析。所有其他的测量分析单向方差分析。图基测试使用事后。一个P值< 0.05是用来确定意义。

3所示。结果

3.1。老鼠的饮食模式

我们以前发表的表型数据显示,50 ug / g的饮食槲皮素或罗伊补充变弱HFD-induced肥胖和胰岛素抵抗在C57BL / 6 j小鼠32]。有趣的是,antiobesogenic和槲皮素的抗糖尿病的影响,罗伊发生在与~ 50%增加骨骼肌线粒体数量和更完整的氧化在骨骼肌32]。在我们之前的研究中,C57BL / 6 j小鼠8周内收到问补充,这导致骨骼肌的增加Pgc-1α在骨骼肌表达32]。因此,在目前的研究中,我们还旨在确定ROE行为类似于问上调Pgc-1α与先前观察到的有益的线粒体改编。与我们之前的发现,在目前的研究中我们发现,9周内补充后,问和罗伊改变总Pgc-1α表达,尽管此前发表改善骨骼肌线粒体(图在这些动物数量1)。

3.2。Pgc-1α同种型表达式

几个拼接的变种Pgc-1α最近被描述,一些剪接变异显示重叠下游转录辅激活活动和生理代谢的变化和线粒体适应环境输入(17- - - - - -19,21]。由于缺乏变化的观察Pgc-1α(图1)尽管线粒体数量显著增加,我们旨在确定Q或鱼子可能上调的具体拼接变异Pgc-1α使用我们的模型与已知的骨骼肌线粒体适应性(7,32]。一个不同的示意图Pgc-1α变体以目前的研究显示在图2。Pgc-1α-a,Pgc-1α-b, Pgc-1α-c,Pgc-1α4N-termini由于不同转录开始在远端,替代(外显子1 b),或近端(外显子1 a)启动子,也由于可变剪接外显子1 b产生外显子1 b′,而NT-Pgc-1α和FL-Pgc-1α都含有完整的其实地区从1 b, 1 b / 1和2(图2(一个))。除了5′剪接的地区,Pgc-1α3′末端可能进一步进行拼接,从而导致微分c终端。如图2(一个),Pgc-1α-a,Pgc-1α-b Pgc-1α-c,和FL-Pgc-1α包含在各自的外显子6和7,成熟的成绩单,而Pgc-1α4和NT-Pgc-1α接受可变剪接的外显子6和7之间的插入和随后终止翻译前外显子7。有趣的是,两个高频+ Q和HF + RO表现出减少FL-Pgc-1α而低频和高频组(图3(一个))。HF + Q和HF + RO也呈现出一定的下降Pgc-1α-a低频和高频相比,尽管减少高频+ RO相比高频没有达到统计学意义(图3 (b))。HF + RO但不是HF + Q显示下降Pgc-1α-b比低频(图表达3 (c))。没有观察到任何组织变化Pgc-1α-c或Pgc-1α4(数据3 (d)和3 (e))。有趣的是,唯一的区别之间观察到的低频和高频发生减少NT-Pgc-1α表达式(图3 (f))。HFD-induced减少总NT-Pgc-1α被阻止在高频+ Q和HF + RO,谁有显著提高总NT-Pgc-1α表达相比,高频(图3 (f))。

3.3。Pgc-1αDNA甲基化在260−核苷酸

Pgc-1α最近被证明是hypermethylated骨骼肌的2型糖尿病人,棕榈酸和油酸治疗细胞体外和HFD 10周之久的喂养在C57BL / 6 j小鼠6,13]。特定的DNA甲基化在260−nt足以减少Pgc-1α表达和导致有害的骨骼肌线粒体适应性(6,13]。来确定Q和RO可能改善HFD-induced骨骼肌线粒体通过表观遗传调节适应不良Pgc-1α,重亚硫酸盐测序Pgc-1α子了,特别是测量DNA甲基化的百分比在监管−260元。亚硫酸氢转换的DNA序列和焦磷酸测序引物和已知DNA甲基化位点的位置如图所示4(一)。Pgc-1α−260元甲基化是在高频与低频(图相比显著增加4 (b))。Q和罗伊补充一天50 ug /防止HFD-induced DNA甲基化的增加,导致这些组织的甲基化的百分比,如果动物(图中观察到的类似4 (b))。

4所示。讨论

DNA甲基化的Pgc-1α启动子减少骨骼肌Pgc-1α表达和线粒体数量和功能,这两个可能是重要的决定在肥胖的胰岛素敏感性(5,6,8,9,13,33,34]。环境输入,如饮食和锻炼,改变Pgc-1α表达式来确定骨骼肌线粒体适应性(1,2,4,14]。膳食补充剂类黄酮Q和/或植物提取物红洋葱防止HFD-induced肥胖和胰岛素抵抗增加骨骼肌Pgc-1α表达和线粒体功能和数量(7,31日,32]。由于他们的影响Pgc-1α和线粒体适应的能力Pgc-1αepigenetically监管,有可能问的影响,罗伊通过表观遗传机制涉及DNA甲基化发生。在这里,我们表明,9周内HFD喂食,导致肥胖和胰岛素抵抗在C57BL / 6 j小鼠32),导致260−nt的甲基化Pgc-1α启动子。问和罗伊减弱HFD-induced肥胖和胰岛素抵抗,同时防止HFD-induced−260 nt的甲基化Pgc-1α。虽然我们以前发现50 ug /天的问补充上调骨骼肌Pgc-1α与增加线粒体功能的形式更完整的氧化脂肪酸(7)和老鼠在目前研究显示~ 50%增加骨骼肌线粒体数量(32),在目前的研究中我们观察到的没有区别Pgc-1α表达式(测量总Pgc-1α表达式)之间的高频,高频+ Q或高频+ RO。

重要的是,补充膳食问对骨骼肌的影响Pgc-1α表达和线粒体适应发生在剂量和时间的方式(7,31日]。我们先前的研究显示增加Pgc-1α在8周内补充(7),在目前的研究中,Pgc-1α测量后9周内补充。尽管缺乏总数增加Pgc-1α我们继续观察Q - ROE-induced增加能量消耗和线粒体数量32),这可能部分是之前的结果Pgc-1αupregulation在8周内。然而,线粒体营业额迅速发生,从1 ~ 17天的修复方式,这可以增加周转率膳食干预,如热量限制(35,36]。因此,人们会预计,如果Q和罗伊不再是有益的影响后9周内由于缺乏变化Pgc-1α表情,连续动力HFD会导致类似的骨骼肌生理机能在高频,高频+ Q和HF + RO组;然而在9周内,我们还观察到线粒体数量增加(32)和减少Pgc-1α甲基化在HF + Q和HF + RO。因此,看来虽然总Pgc-1α不变,其他机制可以弥补这个损失Pgc-1αupregulation延续有益线粒体在HF + Q和HF + RO改编。

有趣的是,DNA甲基化驱动信使rna剪接和已被证明Pgc-1α有几个已知亚型由于可变剪接和备用启动子启动网站(17- - - - - -19,21,26]。这些亚型有独特的和互补或重叠功能,特定于每个变体(17,18,21,25]。因此,它是可能的,Q和罗伊的影响可能是由于表观遗传调控的信使rna剪接和随后的改变Pgc-1α拼接变量表达式。事实上,我们在这里展示,Q和罗伊的表达下降FL-Pgc-1α和同种型,在不改变亚型b, c,或4。此外,问而不是罗伊下降Pgc-1α同种型B相比,低频高频。在这里,没有治疗的影响Pgc-1α亚型4和c。唯一的同种型显示减少后9周内HFD喂养NT-Pgc-1α;,问和罗伊能够防止这种HFD-induced减少。这些结果符合变化260−nt DNA甲基化状态,在甲基化与高频增加但HF + Q和HF + RO显示类似的低频的甲基化水平。因此在9周内喂养,有可能是Q和罗伊的有利影响线粒体数量和功能通过upregulation介导的NT-Pgc-1α同种型表达依赖于表观遗传调控的Pgc-1α。的确,NT-Pgc-1α已知的互补和重叠的功能吗FL-Pgc-1α并可能弥补损失FL-Pgc-1α或其他亚型(17,25];它最近被证明Pgc-1α同种型表达式epigenetically由组蛋白甲基化运动,与表达Pgc-1α-b和Pgc-1α-c但不是的Pgc-1α-a被调节与增加组蛋白启动子甲基化的外显子1 b相比,外显子1 (16]。

这里,我们测量的百分比−260元DNA甲基化,甲基化网站管理Pgc-1α表达和骨骼肌线粒体适应性是位于外显子1的近端启动子上游。鉴于Q和罗伊下降Pgc-1α亚型Pgc-1α-a和Pgc-1α-b在不改变Pgc-1α-c,Pgc-1α-a包括外显子1,Pgc-1α-b包括外显子1 b,Pgc-1α-c包括外显子1 b′,似乎−260元甲基化并不发挥作用在调节5′剪接或转录起始Pgc-1α近端与选择,远端启动子。这是符合最近的出版物Lochmann et al . 2015年,同样表明了谁Pgc-1α甲基化是不相关的Pgc-1α同种型a、b或c表达式(16]。有趣的是,总Pgc-1α表达也不是与DNA甲基化在260−nt。然而,目前尚不清楚在之前的出版物的亚型Pgc-1α被测量并与−260 nt DNA甲基化。先前的报道可能使用的引物测量亚型的不同拼接的3′端;在目前的研究中,尽管我们没有观察之间的关联−260元甲基化和5′剪接或特定的启动子起始,我们的确看到改变同种型表达式基于拼接的3′地区与DNA甲基化水平在260−nt。值得注意的是,FL-Pgc-1α减少高频+ Q和HF + RO和总NT-Pgc-1α增加了。尽管这些亚型选择性剪接产生发生在外显子6和7之间和intronic地区这些外显子17)和DNA甲基化发生在启动子区域,启动子的结构是重要的可变剪接(26]。启动子甲基化调节连接通过一个复杂的过程,涉及表观遗传修饰和启动子转录激活物占领的26]。DNA甲基化不仅改变转录因子结合,而且还直接调节可变剪接招聘rna结合蛋白可以被转移到mRNA改变拼接模式(26]。尽管目前的研究只通过测量260−nt甲基化状态,其他人已经表明,甲基化在260−nt发生在整个Pgc-1α启动子是hypermethylated [6]。因此,过度和hypomethylation−260元作为替代措施可能表明整个启动子甲基化状态或基因的甲基化可能发挥作用在确定可变剪接和同种型表达式。

总之,Q和罗伊在防止显示类似的效果Pgc-1α−260元甲基化引起HFD喂食,上调NT-Pgc-1α在骨骼肌拼接变量表达式。因此,保持有益的Q和罗伊对体重的影响,身体成分、能量消耗、胰岛素敏感性和骨骼肌线粒体数量和功能的小鼠后9周内补充(32通过总量的upregulation]可能是介导NT-Pgc-1α。有进一步需要研究的功能和表观遗传调控NT-Pgc-1α和其他亚型的Pgc-1α来确定他们的特定的角色在调节骨骼肌适应性有助于精益,胰岛素敏感状态。

5。结论

HFD原因Pgc-1α甲基化−260元Pgc-1α近端启动子与改变Pgc-1α在骨骼肌拼接变量表达式。Q和罗伊同样防止HFD-induced甲基化Pgc-1α和增加NT-Pgc-1α在骨骼肌表达。问,ROE-induced upregulationNT-Pgc-1α通过表观遗传机制和可能发生可能足以增加骨骼肌线粒体数量和完整的脂肪酸β氧化,导致肥胖和胰岛素抵抗的衰减。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

普拉萨德p Devarshi和Aarin d·琼斯的贡献同样这项工作。Aarin d·琼斯进行实验,分析数据,编辑了手稿。Prasad p Devarshi分析数据及撰写并编辑了手稿。艾琳·m·泰勒和芭芭拉Stefanska进行实验和编辑了手稿。塔拉·m·Henagan概念化、设计和执行实验,分析数据,撰写并编辑了手稿,并提供资金。

确认

这项工作是由印第安纳州CTSI核心试点资金UL1TR001108和NIH它5 p50-at002776-09赠款。