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PPAR研究
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PPAR研究/2017年/文章

研究文章|开放获取

体积 2017年 |文章的ID 2647129 | https://doi.org/10.1155/2017/2647129

Ya-Ge金、元人民币,青青,宁张Di粉丝,燕格瓦拉,杨小,赵鹏Wang Sha-Sha Wang启朱汤, ”葛根素防止心脏纤维化的抑制TGF -β1 / Smad2-Mediated Endothelial-to-Mesenchymal过渡”,PPAR研究, 卷。2017年, 文章的ID2647129, 14 页面, 2017年。 https://doi.org/10.1155/2017/2647129

葛根素防止心脏纤维化的抑制TGF -β1 / Smad2-Mediated Endothelial-to-Mesenchymal过渡

Ya-Ge金,1,2,3 元人民币,1,2,3 青青吴,1,2,3 宁张,1,2,3 Di风扇,1,2,3 燕切,1,2,3 赵鹏王,1,2,3 杨小,1,2,3 Sha-Sha王,2,3 和 启朱唐1,2,3

1武汉大学人民医院心内科,武汉,中国

2武汉大学心血管研究所,武汉,中国

3湖北省重点实验室心脏病,武汉,中国

学术编辑器:Qinglin杨
收到了 2017年2月13日
接受 2017年4月23日
发表 2017年5月30日

文摘

背景。葛根素是一种黄酮类化合物,从中药中提取葛根。葛根素作为辅助治疗被广泛使用在中国诊所。但对其对调节心脏纤维化的影响。方法。小鼠主动脉受到横向收缩(TAC) 8周;同时给出了葛根素TAC后1周。心脏纤维化被病理染色评估。CD31的信使rna和蛋白质变化和波形蛋白在动物和人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)模型被发现。CD31免疫荧光colocalization和波形蛋白和划痕试验检查TGF -β1-induced HUVECs的变化。过氧物酶体的受体激动剂和拮抗剂proliferator-activated受体-γ(PPAR -γ)被用来探索底层机制。结果。葛根素减轻TAC-induced心脏纤维化,伴随着镇压endothelial-to-mesenchymal过渡(EndMT)。在模型HUVECs取得了一致的结果。TGF -β1 / Smad2信号通路被钝化,PPAR -γ表达式是puerarin-treated老鼠和HUVECs调节。HUVECs吡格列酮可以繁殖的保护作用,而GW9662逆转这种效应由葛根素。结论。葛根素防止TAC-induced心脏纤维化,这种保护作用可能是由于upregulation PPAR -γ和抑制TGF -β1 / Smad2-mediated EndMT。

1。介绍

心肌纤维化是一个广泛的最后共同通路的心脏疾病,包括心肌梗死(1),缺血再灌注损伤(2),肥厚性心肌病(3),和糖尿病心肌病(4]。心脏纤维化的特点是不受控制的细胞外基质(ECM)的过度积累和胶原蛋白,增加心室僵硬,心脏舒张功能恶化,最终导致心力衰竭。Myofibroblasts,表达α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma),表现出巨大的生产能力的ECM和胶原蛋白(类型和III),以及抑制基质金属蛋白酶的活性(基质金属蛋白酶),被称为负责心脏纤维化的主要效应细胞。Myofibroblasts可以源自原位静成纤维细胞,可以激活和transdifferentiate Myofibroblasts心脏损伤后迅速(5];骨骨髓来源循环纤维细胞,吸引着不同种类的细胞因子和趋化因子,迁移和积累在心肌,代表myofibroblasts[的另一个重要来源6];最近的研究报告的另一个来源myofibroblasts:应对各种各样的压力,上皮/内皮细胞失去内在特点和获得间充质细胞的特征,这一过程称为上皮/ endothelial-to-mesenchymal过渡(EMT / EndMT) [7,8]。首次提出通过Karasek [9),EMT / EndMT不断证明纤维化中发挥重要的作用,应给予足够的重视。

葛根素(7,4′-dihydroxy-8 -β-D-glucosylisoflavone C21H20.O9)(Pue) (10]是一种黄酮类化合物,从中药中提取葛根和广泛用于中国诊所作为辅助治疗心绞痛的治疗,糖尿病(11缺血性脑血管疾病[],12]。我们之前(13和别人的研究14)表明,葛根素减压力或血管紧张素II-induced小鼠心脏肥大,和葛根素可以抑制炎症和细胞凋亡在LPS-stimulated心肌细胞(15]。然而,缺乏数据葛根素对心肌纤维化的影响。我们目前的研究旨在阐明葛根素的保护作用主动脉横向收缩引起的心脏纤维化(TAC)。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

葛根素(98%纯度检测的高效液相色谱法分析)收购从上海Winherb医疗科技发展有限公司(上海,中国)。TGF -β1从PEPROTECH购买(100 - 21 c)。GW9662购买从σ(M6191)和吡格列酮也从σ(CDS021593)购买。

2.2。动物

本研究中使用的所有动物程序批准的动物保健和使用委员会武汉大学人民医院(协议编号:00013274)和符合发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版物编号为85 - 23,1996年修订)。8-week-old,男性C57 / BL6小鼠体重23.5 - -27.5 g购买实验动物研究所的科学,凸轮&曾经(中国,北京)和保存在特定病原体自由动物实验室12 h明暗周期和恒定的温度和湿度。经过1周的适应,老鼠被随机分配到四组,假+车辆,假+ pue TAC +车辆,和TAC + pue,其中车辆或葛根素TAC后1周。剂量(65毫克/公斤体重/天)和管理路线(预拌在日常提要)测定葛根素的指的是我们之前的研究(13]。所有的老鼠都免费饮水和饲料。食品消费是每周监控一次和四组之间没有差异。选择剂量葛根素没有不利影响的增长或食物和水的消耗。虚假的或TAC 8周后,小鼠被牺牲了,他们的心被进一步研究。

2.3。细胞培养

人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)第12行从YRGene购买(NC006)和培养Gibco RPMI1640中补充10%胎牛血清的边后卫,内皮细胞生长补充(ecg ScienCell, 1052年,10μl /毫升)和肝素(0.1毫克/毫升)在湿润有限公司5%2孵化器在37°C。细胞之间的第四和第六章节融合到70 - 80%的速度增长。

经过12个小时的饥饿的同步,HUVECs preincubated有不同浓度的葛根素(10μ25米,μ50米,μ米)或吡格列酮(20μ米)的存在与否GW9662 (10μ米)30分钟,然后用重组人类孵化TGF -β1 (10 ng / ml)或磷酸缓冲盐(PBS) 48小时。葛根素浓度的选择指的是以前的研究(14,15]。整个细胞溶解产物和RNA提取深造。葛根素、吡格列酮和GW9662 predissolved在二甲亚砜(σ,D2650)和选择浓度没有有害影响。

2.4。西方墨点法

蛋白质样品从小鼠心脏或HUVECs溶解产物进行评估使用BCA-kit(23227年,热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)和归一化到相同浓度之前西方墨点法(WB)实验。50μ克蛋白质样本由钠十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转移到Immobilon-FL转移膜(IPFL00010、微孔Billerica,妈,美国)。膜被封锁的5%牛奶Tris-buffered盐水Tween-20 (TBST) 3小时然后孵化表示主要抗体在一夜之间在4°C。抗体的蛋白质从细胞信号技术购买(美国马丹弗斯):Smad2(# 3103年代),glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH) (# 2118) (# 3101)。以下蛋白质是抗体购自Abcam(美国Cambridge, MA):α-平滑肌肌动蛋白(αsma) (# ab7817)及1 (# ab66043)和CD31 (# ab24590)。以下蛋白质是抗体购自圣克鲁斯生物技术(美国圣克鲁斯,CA):过氧物酶体proliferator-activated受体-γ(PPAR -γ)(# sc - 7196), Smad4 (# sc - 7966)、波形蛋白(# sc - 5565)。墨迹扫描了一种双色红外成像系统(美国LI-COR奥德赛,林肯,NE)。特定的蛋白质表达水平正常化GAPDH蛋白质总细胞溶解产物。

2.5。定量即时逆转录-聚合酶链反应

RNA提取从HUVECs使用试剂盒(表达载体,15596 - 026)和相对地转录成cDNA实时聚合酶链反应(rt - pcr)分析使用益生元(DT)引物和Transcriptor合成第一链cDNA工具包(04896866001,罗氏、巴塞尔、瑞士)。2的互补脱氧核糖核酸合成μ克的总RNA。PCR扩增是量化使用LightCycler 480 SYBR绿色我主人混合(罗氏,04707516001)和结果规范化GAPDH基因表达。被显示在表使用的引物1。
基因 向前 储备 加入基因数量
GAPDH 5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′ 5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′ NM_001256799.2
CD31 5′-GAGTCCTGCTGACCCTTCTG-3′ 5′-TCAGGTTCTTCCCATTTTGC-3′ NM_000442.4
波形蛋白 5′-GAAATTGCAGGAGGAGATGC-3′ 5′-ATTCCACTTTGCGTTCAAGG-3′; NM_003380.3
αsma 5′-CTGAGCGTGGCTATTCCTTC-3′ 5′-AGAAGAGGAAGCAGCAGTGG-3′ NM_001141945.2
胶原蛋白我 5′-ACCTGGTCAAACTGGTCCTG-3′ 5′-CCTGTGGTCCAACAACTCCT-3′ NM_000088.3
胶原蛋白3 5′-GATCAGGCCAGTGGAAATGT-3′ 5′-GTGTGTTTCGTGCAACCATC-3′ NM_000090.3
CTGF 5′-GTTCCAAGACCTGTGGGATG-3′ 5′-TCTCTTCCAGGTCAGCTTCG-3′ NM_001901.2
Fn 5′-CAAACTCCGTCACCCTCAGT-3′ 5′-GGTGCCAGTGGTTTCTTGTT-3′ NM_001306129.1
CTGF:结缔组织生长因子;Fn:纤连蛋白。
表1
Gene-specific引物用于定量实时PCR。
2.6。划痕附着力试验

HUVECs被播种在six-well盘子,直到他们成立了一个支流单层。经过12个小时的饥饿,HUVECs用不同浓度的葛根素预处理(10μ25米,μ50米,μ米)30分钟,然后用PBS治疗或TGF -β1 (10 ng / ml) 48小时。划痕是在HUVECs单层200μl无菌的微量吸液管尖和盘子清洗与消毒PBS的两倍。与此同时逮捕细胞增殖中取代Gibco RPMI1640中补充没有的边后卫。照片拍摄在0、6、12、24小时后划痕用倒置显微镜(IX51,奥林巴斯、东京、日本)观察HUVECs的迁移。

2.7。组织学分析和免疫组织化学

老鼠的心被固定在10%福尔马林被捕后,在舒张期阶段10%的氯化钾,然后嵌入石蜡。这些石蜡包埋标本分为4 - 5μ米厚片垂直于顶端,以确保两心室充分体现。Picrosirius红色(PSR)染色进行评估纤维化水平。图像捕获的200 x放大每箱5个字段。检测的表达和位置αsma,石蜡包埋的心脏部分被封锁在3% H2O2,沾主要抗体αsma(1: 50)在4°C一夜之间,然后孵化peroxidase-coupled二次抗体和民建联作为衬底。图像捕获的400 x放大每箱5个字段。

2.8。免疫荧光

CD31 colocalization和波形蛋白和免疫荧光检测。冻结部分小鼠的心脏是在室温下至少1小时,直到他们干。浸泡在0.3%后H2O2(稀释在TBS 1 x) 30分钟,冲洗了部分TBS (1 x) 5分钟然后用10%阻塞山羊血清(Gibco, 16210 - 064) 10分钟前孵化与主要抗体CD31 (Abcam ab24590)和波形蛋白(圣克鲁斯,sc - 5565)在37°C 2小时。之后,部分与TBS冲洗15分钟和孵化两种不同IRDye®800 cw-conjugated二级抗体在室温下为60分钟。下半场清洗后,部分被SlowFade黄金不变色复染色试剂包含4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI S36939,英杰公司)然后倒置显微镜下观察。HUVECs免疫荧光法,有一些额外的步骤:血清阻断前,HUVECs坚持细胞爬片(12 - 545,费舍尔科学,美国),需要固定的0.2%与4%多聚甲醛10分钟和permeabilized Triton x - 100(0694年,Amresco佩恩,美国)在室温下5分钟。

2.9。统计分析

数据显示为±SEM。组织测试的意义区别单向方差分析(方差分析)测试,后跟一个事后图基测试使用SPSS 22.0统计软件(SPSS,芝加哥,美国)。小动物——一张长有 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。葛根素减毒TAC-Induced心脏纤维化小鼠

TAC 8周后,小鼠的心在TAC +汽车集团著名的纤维化而虚假的团体PSR染色(图就证明了这一点1(一))。葛根素管理显著降低心肌细胞外基质的沉积,胶原蛋白。这是值得注意的αmyofibroblast sma阳性染色,一个特殊的标志,是老鼠的血管周的空间中稀疏的TAC + Pue集团与TAC +汽车集团(图1(一))。一致的结果被认为在免疫印迹αsma蛋白质水平显著下调(图1 (b))。和钝化TGF -β(图1 / Smad2信号蛋白质1 (b))提供了另一个证据,葛根素对心脏纤维化的抑制作用。这些迹象表明,葛根素减毒TAC-induced心脏纤维化,这种保护作用可能与心脏的血管。

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图1
心脏纤维化是缓解压力overload-induced puerarin-treated老鼠。(一)组织学部分表示组左心室的纤维化沾染了PSR(上部和中部面板,酒吧规模:100μ米)。αsma与免疫组织化学检测(降低面板,酒吧规模:200μ米)。(b) TGF -β1 / Smad2信号通路αsma蛋白质组由世行指出,GAPDH规范化 。 与假+汽车集团; 与TAC +汽车集团。
3.2。葛根素对心脏纤维化小鼠的保护作用与EndMT

葛根素抑制心脏纤维化TAC-induced但是吗?一些研究(16,17)发现EndMT提供了重要来源的成纤维细胞在病理条件下,导致心肌纤维化与压力过载。我们假设葛根素的保护作用可能与抑制EndMT相关。免疫荧光在冰封的心部分进行了测试这个假说。首先,测试CD31的敏感性和波形蛋白抗体,我们使用鼠标肌肉组织中丰富的血管和小鼠睾丸组织中丰富的间充质细胞,作为积极的控制(图2(一个)左面板)。为了测试这两个抗体的特异性,我们使用老鼠心脏组织孵化与PBS代替主CD31抗体或波形蛋白,作为消极的控制(图2(一个)左面板)。TAC诱导间充质细胞的显著增加标记波形蛋白(绿色)和显著减少内皮细胞CD31标志(红色),表示在图2(一个)。这些变化表明,间充质细胞的一部分来自内皮细胞导致TAC-induced心脏纤维化。然而与葛根素政府,这一趋势显然是赎回,或换句话说EndMT过程受阻,表达下调如图所示的波形蛋白和调节CD31在TAC + Pue组。取得了一致的结果在免疫印迹(图2 (b))。这些结果表明,葛根素防止TAC-induced心脏纤维化,这种效果是参与EndMT的抑制。

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图2
葛根素对心脏纤维化的抑制EndMT保护。(一)免疫荧光colocalization CD31(红色)和波形蛋白(绿色)测试在冰冻的老鼠心脏表示组(酒吧规模:200μ米)。左侧面板是积极的和消极的控制。积极的控制:CD31(红色)与DAPI复染色(蓝色)在老鼠的肌肉;波形蛋白(绿色)与DAPI复染色(蓝色)在小鼠的睾丸。消极的控制:心脏组织孵化用PBS代替主CD31或波形蛋白抗体。(b)蛋白的表达CD31和波形蛋白是由世行,GAPDH规范化 。 与假+汽车集团; 与TAC +汽车集团。
3.3。葛根素抑制EndMT HUVECs TGF -对待β1

进一步具体的这个理论,我们建立了体外模型使用HUVECs对待TGF -β1 (10 ng / ml)连续48小时内,TGF -β1是证明有效地触发EndMT过程[16]。HUVECs使用葛根素浓度梯度(10、25、50μ米)30分钟然后孵化TGF -β1 48小时。对照组治疗用PBS代替TGF -β1。EndMT模型成功建立rt - pcr和免疫印迹结果(图所示3(一个),3 (b),3 (h)):有显著减少CD31在信使rna和蛋白质水平伴随着显著增加波形蛋白mRNA和蛋白水平。除了CD31和波形蛋白、肝纤维化激活TGF -也是显而易见的β1组指出的mRNA水平的升高αsma,胶原蛋白,胶原蛋白三世,CTGF, Fn(数字3 (c)- - - - - -3 (g))。然而,葛根素预处理能显著缓冲CD31和波形蛋白(数据的变化相反3(一个),3 (b),3 (h)),同时也减轻纤维化激活(数字3 (c),3 (d),3 (e)),尽管CTGF, Fn的mRNA水平显示TGF -相比无统计学差异β1组。另一个相当大的结果是抑制影响EndMT纤维化与巧克力摄入量有关,最好的结果是达到50岁μm .免疫荧光的一致的结果可以看到colocalization CD31的结果(红色)和波形蛋白(绿色)(图3(我))。

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图3
葛根素抑制TGF -β在HUVECs 1-induced EndMT。(g) HUVECs preincubated与不同浓度的葛根素(10、25、50μ米)30分钟,然后处理TGF -β1 (10 ng / ml) 48 h。CD31 mRNA水平,波形蛋白,αsma,胶原蛋白,胶原蛋白三世,CTGF, Fn在表示组被rt - pcr检测,GAPDH规范化 。 相对于对照组; 与TGF -β1组。以同样的方式(h) HUVECs治疗如前所述。CD31的蛋白质含量和波形蛋白在细胞溶解产物显示组被白平衡测试。 相对于对照组; 与TGF -β1组。(我)HUVECs如上所述相同的方式对待。CD31免疫荧光colocalization(红色)和波形蛋白(绿色)与DAPI复染色(蓝色)在表示进行组(酒吧规模:200μ米)。
3.4。葛根素抑制TGF -β1-Induced HUVECs迁移率

除了表型改变,细胞生物学行为的改变是EndMT的另一个重要的特征(18,19]。我们下一个执行划痕试验检查葛根素对TGF -的影响β1-induced HUVECs的迁移率。在倒置显微镜(图4),除了spindle-like形状改变,HUVECs TGF -β1组显示更多的细胞运动原本整洁的划痕边缘划痕在6小时后与对照组相比,这一运动在我们观察的结束阶段达到顶峰后24小时划痕。这个形状和行为变化表示HUVECs收购间充质细胞的迁移能力,EndMT的另一个强有力的证据。然而,葛根素能有效地钝HUVECs的变化引发了TGF -β1,注意到整洁的边缘划伤的痕迹。同样,这种效应存在剂量依赖的相关性,在50岁μM剂量葛根素施加的抑制效果比其他两个剂量。


图4
葛根素抑制TGF -β1-induced HUVECs迁移率。HUVECs与不同浓度的preincubated葛根素(10、25、50μ米)30分钟,然后处理TGF -β1 (10 ng / ml) 48 h,直到单层成立。划痕是直在菜肴。两次冲洗后,介质取代RPMI1640没有的边后卫。照片拍摄在表示时间(酒吧规模:50μ米)。
3.5。葛根素对EndMT的抑制作用与抑制TGF -β1 /在HUVECs Smad2通路

鉴于规范TGF -的至关重要的作用β1 / Smads信号通路在许多纤维化疾病的发病机理,我们测试了TGF -的下游分子β1。如图5TGF -β1-induced Smad2磷酸化激活抑制剂量依赖性的方式,这是符合减轻EndMT和葛根素治疗后肝纤维化(数字3和4)。


图5
葛根素抑制Smad2 HUVECs磷酸化。HUVECs与不同浓度的preincubated葛根素(10、25、50μ米)30分钟,然后处理TGF -β1 (10 ng / ml) 48 h。蛋白质含量p-Smad2和Smad2细胞溶解产物显示组被世行发现,GAPDH规范化 。 相对于对照组; 与TGF -β1组。
3.6。通过PPAR -葛根素可能施加有益的影响γUpregulation

令人惊讶的是,我们注意到过氧物酶体proliferator-activated受体-γ(PPAR -γ)蛋白水平调节小鼠和HUVECs葛根素治疗(数字6(一)和6 (b))。PPAR -γ是很出名的,负面作用调节纤维化和EMT (20.- - - - - -22]。并增加PPAR -γ有什么与葛根素的有益的效果吗?如果是,什么是PPAR -之间的关系γ和葛根素吗?这些疑虑驱使我们去做进一步的研究。

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(b)
图6
PPAR -γ蛋白表达是葛根素调节的。(一)PPAR -γ蛋白质含量在表示组小鼠的心被世行,GAPDH规范化 。 与假+汽车集团; 与TAC +汽车集团。(b) HUVECs与不同浓度的preincubated葛根素(10、25、50μ米)30分钟,然后处理TGF -β1 (10 ng / ml) 48 h。PPAR -γ在细胞溶解产物中蛋白质含量检测到世行表示组,GAPDH规范化 。 相对于对照组; 与TGF -β1组。
3.7。对EndMT GW9662中和葛根素抑制的影响

探索葛根素和PPAR -之间的关系γ,我们使用外源性PPAR -γ受体激动剂,吡格列酮(Pio),一种药物用于治疗2型糖尿病,干预前HUVECs进行预处理的TGF -β1。西方墨点法和rt - pcr结果显示(图7)、吡格列酮对TGF -施加相同的抑制作用β1-induced波形蛋白的增加,以及其他profibrotic基因,减少CD31的葛根素在TGF -β1 + Pue组。然而GW9662,特定的PPAR -拮抗剂γ,抑制效应由葛根素部分破坏:CD31蛋白质和profibrotic基因Fn, CTGF,αsma TGF -β1 + Pue和TGF -β1 + Pue + GW9662组在统计学上不同。但Fn和CTGF的mRNA水平不高,在TGF -β1组。

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图7
对EndMT GW9662中和葛根素抑制的影响。(一)HUVECs preincubated葛根素(50μ米)或吡格列酮(20μ米)的存在与否GW9662 (10μ米)30分钟,然后处理TGF -β1 (10 ng / ml) 48 h。CD31的蛋白质含量,波形蛋白、p-Smad2 Smad2 Smad4, PPAR -γ在世行表示组织的细胞溶解产物进行检测,GAPDH规范化 。 相对于对照组; 与TGF -β1组;☆ 与TGF -β1 + Pue组。(b) HUVECs治疗同样如上所述。波形蛋白mRNA水平CD31, CTGF, Fn,αsma和胶原三世表示组被rt - pcr检测,GAPDH规范化 。 相对于对照组; 与TGF -β1组;☆ 与TGF -β1 + Pue组。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现葛根素可能抑制压力overload-induced心脏纤维化,这种保护作用可能施加的upregulation PPAR -γ和抑制TGF -β1 / Smad2-mediated EndMT过程。

葛根素在中国广泛应用由于其广泛的药理特性。康等。23)在非小细胞肺癌中发现葛根素的潜在抗肿瘤效应异种移植模型。其他的研究(24,25]证明了葛根素可能有利于脂质代谢,防止与生活方式有关的疾病。李等人。26和钟等。27]显示葛根素的有益影响糖尿病动物的确凿证据。在我们先前的研究[13,15),发现葛根素延缓心脏肥大和凋亡在老鼠的心受到TAC和葛根素可以减弱LPS-stimulated心肌细胞的炎症反应和细胞凋亡。至于纤维化,葛根素防止chemical-induced肝纤维化在啮齿动物28,29日]。特别是在心脏纤维化,葛根素能抑制小鼠的病理过程与心肌梗死(30.]。然而,什么葛根素在压力overload-induced心脏纤维化没有完全阐明。

EndMT EMT的一种形式,是很出名的,在房室在胚胎心脏发育形成缓冲中的作用[31日]。在最近的研究中,EMT被认为参与许多疾病的发生和进展,如特发性门脉高压(32),肺动脉高血压(33),动脉粥样硬化(34)、肿瘤转移和一些重要器官的纤维化病变(35]。通过执行谱系分析,成纤维细胞在Tie1Cre招募心肌;R26RstoplacZ double-transgenic FSP1-GFP转基因小鼠接受主动脉分班,Zeisberg和同事(16)发现EndMT导致心脏纤维化。相同的结果再次证实糖尿病mellitus-induced心脏纤维化模型,其中Widyantoro et al。36]发现EndMT负责从内皮细胞和成纤维细胞的出现大约15 - 20%的成纤维细胞coexpressed CD31和FSP1 27 - 35%的比例相比Zeisberg等的研究(16]。与这些研究一致,尽管使用一种间接方式,我们发现HUVECs TGF -后进行了表型和生物学行为转变β1治疗和是由至少一个纤维发生的一部分。葛根素预处理,心脏纤维化和EndMT有效地削弱了。这些结果为葛根素治疗纤维化疾病的前景。

PPAR -γ核激素受体,并以其在调节各种基因多效性的角色参与脂类代谢,葡萄糖体内平衡,细胞分化,生存和增殖37),以及炎症反应(38,39]和抗癌作用[40,41]。最近的研究揭示了PPAR -的另一个重要功能γ心中的负调节纤维化(42),肺动脉高压(43- - - - - -45系统性硬化患者),(46,47]。PPAR -γ干扰Smad-dependent启动子活性和抑制TGF -β全身的胶原蛋白表达和myofibroblast分化转移在正常成纤维细胞(48]。PPAR -的激活γ外源性配体或异位PPAR -的瞬时表达γ可以显著减轻TGF -β全身profibrotic响应(49]。有趣的是,在我们的研究中,除了缓解EndMT和纤维发生,PPAR -γ蛋白表达是老鼠和HUVECs葛根素治疗调节。这一现象引发了一个假定:葛根素可以作为潜在的PPAR激动剂-γ或PPAR -γ作为表演者对EndMT负责葛根素抑制的影响。这个假定是基于一些确凿的证据显示PPAR -γ是参与EMT:通过得罪EMT, PPAR -γ激活抑制两种癌细胞的转移50]。在肺泡上皮细胞,激活PPAR -γ是有利于减轻TGF -β1-induced EMT (22]。

为了验证这个理论,我们使用外源性PPAR -γ受体激动剂,吡格列酮,一种thiazolidinediones噻唑烷二酮类)是已知的治疗2型糖尿病。就是明证图7,吡格列酮重复TGF -抑制效应β1-induced EndMT和HUVECs纤维化,葛根素。波形蛋白的抑制程度在增加,减少CD31在统计学上没有不同的TGF -β1 + Pue和TGF -β1 + Pio组。探讨这种影响是否PPAR -γ端依赖,我们使用了特定的PPAR -拮抗剂γ,GW9662。在同一图中,由葛根素抑制效应被GW9662破坏,如图所示的统计上的不同变化CD31蛋白质和其他profibrotic基因(CTGF, Fn和αTGF - sma)β1 + Pue和TGF -β1 + Pue + GW9662组。这些结果表明,葛根素可能发挥其保护作用通过upregulation PPAR -γ。

TGF -β1 / Smads信号通路是一种最经典通路底层纤维发生和EMT过程(51- - - - - -55]。任何目标旨在切断TGF -β1 / Smads承诺antifibrogenic试剂。在我们的研究中,葛根素能直言不讳Smad2磷酸化激活方式存在剂量依赖的相关性,但吡格列酮(图7(一))。这是因为,而不是废除Smad2/3的磷酸化和核易位,PPAR -γ针对转录共激活剂和组蛋白乙酰转移酶p300在细胞核和干扰Smad2/3绑定profibrotic基因的启动子(49]。这可能解释了改变蛋白质的p-Smad2 HUVECs与吡格列酮治疗。

在我们的研究有一定的局限性。除了Smads, c-Jun NH2终端激酶和增殖蛋白激酶(MAPKs)是导致经典之中TGF -β信号通路(56]。在本文中我们没有测试他们的角色。这需要更深刻的学习。

总之,我们的研究表明,葛根素可防止心脏纤维化引起过载的压力,这种保护作用可能施加的upregulation PPAR -γ和抑制TGF -β1 / Smad2-induced EndMT。葛根素可能提供一种新的辅助antifibrotic心脏病患者的治疗策略。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Ya-Ge金和人民币元同样都贡献给了工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(号。81270303,81470516,81530012)。

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