文摘

多形性胶质母细胞瘤(GBM)代表了大脑最常见的恶性肿瘤之一。当前的疗法并不提供真正的解决方案这一病理。他们的失败可以归结于一个叫做神经胶质瘤干细胞具有干细胞特性的细胞群(gsc)。因此,新的治疗策略GSC-targeted是必要的。PPARγ核受体参与脂类代谢,已经表明作为一个有前途的抗肿瘤的治疗目标。最近的研究报告说,合成PPARγ受体激动剂,已在临床应用治疗II型糖尿病,表现出抗肿瘤的效果在多种恶性肿瘤细胞,包括神经胶质瘤细胞。我们研究了合成PPAR的效果γ受体激动剂吡格列酮在可行性、核扩散、形态和分化在六GSC线隔绝GBM患者。我们也分析了Pioglitazone-induced Wnt /转录水平的变化β连环蛋白相关基因。结果表明,吡格列酮是异构反应诱导细胞生存能力的明显降低,扩散只在GSC线的一个子集。我们没有发现任何迹象表明细胞分化细胞形态学观察和分析具备干细胞和分化标记物的表达。此外,Wnt /β从转录信号通路只有轻微影响吡格列酮暴露后的观点。

1。介绍

多形性胶质母细胞瘤(GBM);谁等级IV)是最常见的和侵略性的脑部肿瘤的成年人。尽管改善治疗结果存活率仍然很穷,只有三分之一的病人活着一年后(1]。

越来越多的证据表明,神经胶质瘤干细胞(gsc)可能会扮演一个关键的角色在GBM发病和阻力占标准治疗和肿瘤复发2,3]。到目前为止仍然没有成功治疗可以根除GSC分组人口;事实上新GSC治疗靶点的研究是必要的为了真正提高GBM患者存活率。

PPARγ配体依赖性转录因子是一个属于类固醇/甲状腺核受体家族。特别是,它是参与脂类代谢4)及其表达式是诱导脂肪细胞所需在脂肪生成和终端分化(5]。在激活由于同源配体相互作用,如长链多不饱和脂肪酸(6)或前列腺素(7),PPARγ移动到原子核,形成异质二聚体类维生素a X受体(RXR)。然后,这个复杂的绑定(PPRE)过氧物酶体扩散国响应元素,导致目标基因的转录激活(8]。

广泛的合成PPARγ配体已确定,其中一些,如(吡格列酮,罗格列酮),在临床使用糖尿病药物(9]。

有趣的是,PPARγ受体激动剂也被发现是癌症治疗的兴趣(10]。特别是,PPAR的激活γ优质的神经胶质瘤中表达,已被证明有几个人类和老鼠的神经胶质瘤细胞株抗肿瘤的影响,诱导生长逮捕和细胞凋亡在体外和在活的有机体内(11,12)和抑制CD133 +细胞扩张(13]。此外,一项回顾性研究表明,糖尿病患者GBM thiazolidinedione药物有增加生存中值(14),这表明PPARγ可以代表一种新的潜在的治疗目标为优质神经胶质瘤的治疗。

在这项研究中,我们分析在体外吡格列酮的影响暴露在细胞生存和增殖6隔绝GBM GSC行。我们研究了它对具备干细胞和分化的影响通过特定标记物的表达。最后,因为Wnt /β连环蛋白通路异常激活在癌症干细胞(15,16吡格列酮)和抑制β连环蛋白表达在神经胶质瘤细胞17,第一次我们扩展我们的知识分析这个途径分析七个相关基因的表达水平。

2。材料和方法

2.1。细胞系和细胞培养条件

所有GSC线用于这项工作(GBM2、G144 G179, G166, GliNS2,和GBM04)从病人受到孤立的“绿带运动”和广泛的干细胞特征属性。GBM2、GBM7 G144、G166 GliNS2,和经典GBM04源自多形性成胶质细胞瘤,而G179来自胶质母细胞瘤巨细胞变体。所有的GSC行已经扩大在体外稳定的细胞系和强大的模型用于研究其生物学和药敏测试(18,19]。2013年,我们的研究小组cytogenomic和外遗传性特征资料(20.]。的具备干细胞属性GSC线路定期监控,正如已经Baronchelli et al . 2013中描述20.]。细胞扩张进行了扩散宽容介质由DMEM F-12 (Euroclone)和Neurobasal 1: 1(表达载体),B-27补充维生素a(表达载体),2毫米谷酰胺(Euroclone) 10 ng / mL重组人类bFGF和20 ng / mL重组人表皮生长因子(Miltenyi研究),20和20 UI /毫升青霉素μg / mL链霉素(Euroclone)(完全培养基)。gsc培养的贴壁培养条件T-25厘米²烧瓶内涂有10μg / mL层粘连蛋白(英杰公司)5%的股份有限公司₂/ 95%啊₂的气氛。

2.2。药物和治疗

吡格列酮(Pio)(开曼化学)溶解在二甲亚砜(DMSO)做一个20毫米储备溶液,然后稀释到最终选定的浓度(1-10-30-50μ与PBS 1 x M)。备料是储存在−20°C。DMSO对细胞存活率没有影响。

2.3。MTT试验

MTT(细胞代谢活动评估3 - 4,5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyl溴化四唑)分析以评估Pio的功效(1-10-30-50μ米)治疗。细胞被镀在96 -孔板的密度4×10⁴细胞/在100μL培养基和孵化37°C。24 h后,Pio添加细胞培养基。药物孵化时间后(24、48或72 hs) MTT的解决方案(1毫克/毫升,σ)添加到每个好,细胞培养3 hs 37°C。因此,甲瓒在绝对乙醇和可溶性染料的吸光度测定spectrophotometrically FLUOstarω微型板块的读者(BMG Labtech) 595海里。抑制的百分比决定通过比较药物治疗细胞的吸光度值与未经处理的控制:[(treated-cell吸光度/未经处理的细胞吸光度)×100]。报告的结果是两个不同的实验的平均值至少执行一式三份。

2.4。Cytomorphological分析

细胞被镀在T-25厘米²。当细胞达到80%的融合,他们对待Pio 10μM 48 h。随后,染色体的准备工作进行的标准程序(如前所述)(20.]。短暂,染色体QFQ-banded使用奎纳克林芥末和幻灯片被安装在恩缓冲区。幻灯片进行了分析使用尼康Eclipse 80我荧光显微镜(尼康)(60 x放大)配有COHU高性能CCD相机。细胞有丝分裂指数(MI)评估计算的百分比有丝分裂得分至少1000核。数据为平均值,获得来自两个独立实验用细胞在不同的段落。

细胞形态学研究细胞在6-well盘子镀层粘连蛋白涂层增生性宽容介质在3×10³-10年⁴细胞/毫升,根据每个细胞株的生长速率,24 h后,他们对待Pio (1-10-30-50μ米)的不同时期(24、48和72 hs)。的存在形态变化估计通过相差显微镜观察,比较Pio-treated和未经处理的细胞。代表图像被为每个细胞株,为每个治疗。

2.5。免疫荧光

免疫荧光试验进行治疗和Pio 10μM 72年文化商品对待。实验进行的所有使用鼠标anti-PPAR GSC线γ(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国;1:50),兔子anti-CD133(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国;1:50),鼠标anti-Nestin(美国微孔,Billerica的;1:50),兔子antiglial原纤维酸性蛋白(GFAP、Dako 1: 200),兔抗β三世微管蛋白(Covance 1: 100),和山羊anti-Myelin碱性蛋白(MBP),圣克鲁斯生物技术,1:50)作为主要抗体。细胞被放置到幻灯片cytospin和免疫荧光试验进行了如前所述[21]。荧光细胞使用共焦显微镜检查的准备工作(710年蔡司LSM)。期间通过卡尔曼滤波降噪的收购。为了进行半定量的分析,免疫反应性的细胞的数量计算,评估至少100细胞/样本在不同地区的下滑。

2.6。RNA提取

从未经处理和Pio 10中提取RNAμ细胞治疗96 hs都使用了RNeasy迷你包(试剂盒),根据制造商的协议。

2.7。真正Time-PCR数组

RT²分析器PCR数组(试剂盒)在未经治疗的评估和Pio 10μ细胞治疗96 hs为了评估Pio影响基因的表达参与Wnt通路。RNA样本处理和未经处理的细胞转化为第一链cDNA使用RT²第一链工具包(试剂盒)。然后,RT²分析器PCR数组评估根据制造商的协议使用自定义数组PCR,包含7 Wnt pathway-focused基因引物(WNT1、FZD4 CTNNB1、EP300 CREBBP, TCF7,和MYC)和2看家基因(HPRT1,真沸点)。短暂的互补是与一个适当的混合RT SYBR绿色Mastermix。这种混合物能整除的井PCR数组和实时PCR的执行周期计(应用生物系统公司)正确编程(1周期:10分钟95°C, 40周期:15秒95°C, 1分钟60°C)。相对基因表达决心使用数据的实时循环和ΔΔCT方法。基因表达变化建立了折叠的截止值+ /−1,5:值≥+ 1,5表示基因upregulation,而值≤−1,5表示。差别基因对这些基因表达的褶皱变化数据得到平均值来自两个独立的实验。

2.8。统计分析

统计分析进行了表演以及(MTT),耶茨卡方检验(细胞有丝分裂指数)和确切概率法(免疫荧光试验)原始数据,利用Excel电子表格(Microsoft Office 2013,微软公司)。被设定为临界水平的意义。

3所示。结果

3.1。GSC行表示PPARγ

PPAR的表达γ6 GSC行评估通过免疫荧光检测。结果表明,所有gsc PPAR表示γ在高水平(几乎100%的细胞在所有GSC行)(图1)。

3.2。Pio暴露不定地GSC生存和增殖的影响

GSC可行性Pio的影响是通过MTT测定(图确定2)。

治疗后24 h GBM04 G179细胞系表现出剧烈和剂量依赖性降低新陈代谢活跃的细胞,而匹配的未经处理的细胞()。G166、GBM2 GliNS2细胞系强调适度但代谢活动的显著下降()。相反G144细胞系是抵抗Pio后第一次显示甚至新陈代谢活跃的细胞的百分比的增加药物浓度检测。

有趣的是,48 h后,增加剂量的Pio导致进步降低代谢活动的所有GSC线,包括G144。

72年之后hs Pio诱导剂量依赖性降低G179的代谢活动,GBM2和G166细胞系()。在G144细胞系减少是很有意义的只有在接触Pio 50μm . GliNS2细胞系中突出显示一个有趣的行为似乎是较不敏感的药物暴露时间的延长,稍稍减少Pio的代谢活动只有在治疗后10μ米()。

在所有的GSC行减少新陈代谢活跃的细胞不含时除了GBM2。

为了研究Pio GSC上扩散的影响,我们评估了细胞有丝分裂指数(MI),一个至关重要的参数与肿瘤侵犯有关。我们清点的数量每1000年中期细胞核后暴露在Pio 10μ米,最低浓度诱导显著变化的代谢活动(图3)。Pio政府48 h GBM2通常决定明显降低心肌梗死,G166,匹配和GliNS2细胞株,而未经处理的细胞。MI G179细胞系表现出微弱的减少,但无统计学意义。在G144 GBM04细胞株增殖率非常低甚至在未经处理的细胞。这个特性使我们从观察这两个细胞系在MI显著变化。

3.3。gsc Pio没有引起任何形态变化

GSC形态学分析强调了治疗和Pio-treated GSC增长在neurospheres不依从增长模式,形成殖民地不同大小。一般Pio管理没有引起任何相关的修改在细胞形状(图4)。然而,在最高浓度测试(50μ米),Pio梭状沉淀产生,揭示了当今盛行的细胞毒性效应,特别是在48 h和72 h。

3.4。Pio影响具备干细胞和分化标记的表达水平

Pio的prodifferentiating能力是评估通过表达分析选择具备干细胞(CD133和巢蛋白)和分化标记(GFAP、β三世微管蛋白和MBP)先前文献中使用(3,18,22,23),比较细胞未经处理或处理Pio 10μ米,最小有效浓度,72海关。代表图像如图5。表达的数据概述表明gsc具备干细胞和分化标记变量水平(表1)。一般来说,巢蛋白表达在中等或高强度在所有未经处理的细胞系(范围:75 4 - 99,2%)。CD133免疫反应性的细胞被发现在大部分未经处理的gsc 5/6细胞系(63 - 100%)。只有G166细胞系表现出低表达的标记(只有7中,3%的CD133 +细胞)。

Pio治疗引起的减少细胞阳性的比例至少一个具备干细胞标记在3/6行。G166显示CD133 +细胞减少(从7、4%到0%)。GBM2和GliNS2显示有关减少巢蛋白免疫反应性的细胞从75年的4%到0%,从79年开始,分别为6%,50%。GBM2显示也轻微但不会在CD133阳性细胞显著减少。这两个两行Pio政府显示也显著减少的细胞分化标记阳性。反之G144和GBM04细胞系细胞阳性的比例的增加至少一个具备干细胞标记。

至于分化标记,G144 G166显示,增加细胞免疫反应性的的百分比β三世微管蛋白(分别地。,from 45,8% and from 25,9% to 100%) and GFAP (resp., from 82,5% and from 83,9% to 100%) and a reduction of cells positive for MBP (from 100% to 0%), while 100% of GBM04 cell were positive to all the differentiation markers after Pio treatment. In G179 Pio treatment caused a change only in the percentage of cells positive for MBP (from 0% to 100%).

3.5。Pio温和调制Wnt信号途径

Wnt信号表达谱进行治疗和10上使用定制PCR数组μPio-treated细胞96 hs探索7基因的表达变化。

结果表明,Pio能够温和调节Wnt信号通路在3 6 GSC线(表2)。特别是,G179和配体的差别G144显示对这些WNT1。G179突出的upregulation辅活化因子EP300和CREBBP。在GBM2有一个明显的表达水平增加WNT1 TCF7,和下游致癌基因MYC。

4所示。讨论

PPARγ是PPAR的ligand-activated核转录因子受体超科表示作为一个有前途的新治疗方法的发展目标(4]。大量的研究报道,PPAR的激活γ通过自然和合成配体有化疗效果(10,24,25]。

在目前的研究中我们调查的影响吡格列酮(Pio), PPARγ受体激动剂常用于临床治疗II型糖尿病,六隔绝GBM GSC行。尽管改善治疗结果,GBM患者仍表现为预后不良(1)和gsc已经证明发挥关键作用在肿瘤发生和复发的标准疗法(2,3]。因此,鉴定新的治疗策略GSC-targeted根除“绿带运动”似乎是不可避免的,和PPARγ受体激动剂可以是一个伟大的选择26,27]。

首先我们PPAR的验证γ在所有GSC行表示,在协议与先前的报道28]。后来,我们调查如果Pio政府能够影响细胞的生存和增殖能力,作为癌症的特点之一是对正常组织增生性的优势。

MTT实验和细胞有丝分裂指数评价强调高可变性对Pio暴露在我们六GSC线,识别的子群Pio-sensitive GSC线。这个发现让著名的interpatient描述这种类型的肿瘤的异质性。大规模基因组分析已经表明GBM intertumoral分子异质性可能占病人对治疗的敏感性和预后的差异(29日,30.]。也因此,我们组的一项研究显示一个了不起的基因组和外遗传性变异gsc [20.]。至于Pio治疗G179 GBM2、G166 GBM04显示,最明显的减少细胞生存和增殖,这可能是由于不同的机制,如upregulation proapoptotic蛋白质或逮捕了细胞周期进展,如前所述[11- - - - - -13,31日]。

之后,我们评估如果Pio治疗可能导致差异像过程在我们的gsc诱导细胞形态学的变化或具备干细胞和分化标记物的表达。许多研究表明,PPARγ受体激动剂可以调节nsc的分化或gsc下调具备干细胞基因的表达或增加神经胶质细胞标志物的表达(32- - - - - -34]。相反,前面展示的是,我们没有观察细胞形态学的改变和一个明显分化gsc签名。事实上Pio暴露gsc持续增长后neurospheres和留存的coexpression具备干细胞和分化标记,观察到的未经处理的细胞。然而,这个标记coexpression培养neurospheres并不奇怪,因为它反映了intratumor异质性中观察到病人:每个肿瘤可以呈现出复杂的分层组织不同的积累与多样化的形态和生物学行为(30.]。此外,最近的一项研究也表明,个体肿瘤的多个亚种群gsc可以共存特点是独特的表面标记分子概要文件相关的不同的表达和单细胞大部分组织分子亚型(35]。

最后,我们评估Pio影响Wnt相关基因的表达,因为gsc的一个关键特性是胚胎的异常激活信号通路(15,36),先前的研究已经证明,Pio能够表达下调β连环蛋白在神经胶质瘤细胞17]。7基因的表达水平的分析(WNT1、FZD4 CTNNB1、EP300 CREBBP, TCF7,和MYC)表明,Pio略调制gsc Wnt通路,有趣的是它并没有改变β连环蛋白水平。净与先前的研究不同,这一发现的报道,Pio能够表达水平的降低β连环蛋白的蛋白质(17,37或表达下调Wnt /β连环蛋白信号通路下游转录目标基因(38]。

5。结论

总之,这项工作表明,合成PPAR的潜力γ受体激动剂Pio小说作为一个有前途的治疗神经胶质瘤是不那么显而易见。Pio效果在不同高度异质化的GSC线。它只减少细胞生存和扩散的一个子集GSC线,建议进一步研究PPAR的抗肿瘤的作用机制γ受体激动剂是必要的。有趣的是,Pio并不影响细胞形态也不引起任何差异像过程和Wnt /β连环蛋白信号通路并不是很高的主要中介Pio抑制gsc增长。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持到目前为止2011 n。12 - 155 Milano-Bicocca大学的安吉拉Bentivegna。作者想感激地感谢史密斯教授奥斯汀(威康信托基金会医学研究理事会干细胞研究所,剑桥大学剑桥,英国)和安东尼奥博士数据(IRCCS-AOU圣Martino-IST、热那亚、意大利)请提供细胞株用于这项研究。