文摘

本研究的目的是评估的特征提取的影响Citrus bergamia汁脂肪形成和/或脂类分解使用间充质干细胞从人类脂肪组织作为细胞模型。评估对脂肪形成的影响,一些细胞培养脂肪形成的介质处理+ 10或100年μ克/毫升的提取。确定属性在脂类分解,额外的间充质干细胞和脂肪形成的培养基培养14天之后,这一次补充道Citrus bergamia为进一步的14天。验证脂肪形成的差异化,油红O染色,14日,21岁,28天。此外,过氧物酶体的表达proliferator-activated受体(PPAR -γγ),脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(A-FABP),脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL),荷尔蒙脂肪酶(高速逻辑),单甘油酯脂肪酶(球型)5′腺苷monophosphate-activated蛋白激酶(AMPK)α1/2,pAMPKα1/2被免疫印迹分析和评估释放甘油比色测定。Citrus bergamia提取隐含的积累细胞内的脂质在脂肪形成的间充质干细胞分化,促进了脂类分解抑制脂肪形成的基因的表达和激活分解脂肪的基因。Citrus bergamia提取可能是一个有用的天然产品改善脂肪动员与肥胖相关的疾病。

1。介绍

肥胖、积累过多的脂肪组织,已经成为主要的公共卫生问题之一在过去几十年。多余的脂肪组织增加了风险的代谢疾病如动脉粥样硬化、高血压、胰岛素抵抗和癌症(1]。Adipocyte-derived pro -抗炎发病在能量平衡和内稳态中起着关键作用。系统性炎症、胰岛素抵抗和肥胖引起的代谢紊乱引起的反应增加生产和分泌的促炎发病2]。因此,肥胖是一种慢性低度炎症,遗传素质的,一个现代的久坐不动的生活方式,减少了体育活动,和无限的食品有重要作用(3,4]。

事实上,最有效的治疗减肥是一个急剧变化的生活方式,健康的饮食,有规律的体育锻炼、戒烟。

几项研究在细胞、动物和人类的生热作用和能量消耗增加,表明饮食生物活性化合物减少炎症和氧化应激反应,并支持减肥进展和/或代谢紊乱降低(5,6]。

近年来,有益的属性Citrus bergamia果汁有日益增长的兴趣和潜力的促进健康物质的主题研究[7]。的果汁Citrus bergamia是一种天然黄酮类化合物的来源,如柚皮苷、橘皮苷,neohesperidin, neoeriocitrin,扮演一个重要的角色在人类健康保护8,9]。我们的一些研究展示了一种提取物的抗氧化/抗炎活动Citrus bergamia在一个在体外模型发炎的皮肤角化细胞(10]。此外,最近,一个临床研究报道Citrus bergamia提取补充血浆脂质水平的有利影响也在主题与温和高胆固醇血症(11]。

肥胖与炎症和炎性细胞因子在脂肪组织是高度调节的肥胖受试者(12- - - - - -15]。因此,我们提出的提取Citrus bergamia汁具有抗炎礼节可能影响脂肪组织动力学和脂肪细胞的分化。因此,本研究的目的是评估的特征提取的影响Citrus bergamia在脂肪细胞分化使用间充质干细胞从人类脂肪组织细胞模型。

2。材料和方法

2.1。样品制备和测定黄酮类化合物

Citrus bergamia果汁是来自剥落Risso等Poteau收集的水果种植园位于雷焦卡拉布里亚(意大利)。中描述的汁然后加工Graziano et al。10]。纯标准(neoeriocitrin、柚皮苷和neohesperidin)买来Extrasynthese (Genay Cedex,法国),与实验室混合用作比较。在任何情况下,重要的是要强调,没有一个标准单独使用给这些提取的结果类似Citrus bergamia含有的黄酮类化合物。

2.2。间充质干细胞的培养

脂肪组织收集从10捐助者、男性和5女性5(从22到30岁,平均身体质量指数29±3)做抽脂手术。Lipoaspirates获得受试者的知情同意后,根据意大利政府的法律。获得的间充质干细胞从lipoaspirates报道在Lo Furno et al。16]。

2.3。间充质干细胞标记的识别

为了检测细胞的类型来自lipoaspirates,流式细胞术进行了报道在Musumeci et al。17]。

2.4。在脂肪细胞分化的间充质干细胞

间充质干细胞分化的能力向脂肪形成的线在实验的检查这些是放在文化7、14、21、28天。一些细胞,控制,被孵化DMEM-1 g(10%的边后卫,1%青霉素和链霉素,1%的MSC增长补充)。额外的细胞与脂肪形成的介质(维护人类MesenCult MSC基础培养基+脂肪形成的刺激补充;猫。# 05401和# 05403,分别地;干细胞技术,意大利米兰)。

2.5。治疗与Citrus bergamia提取

评估对脂肪形成的影响,一些细胞培养有或没有脂肪形成的介质处理10或100年μ克/毫升的特点和冻干Citrus bergamia每2 ~ 3天添加到媒介在媒介改变了28天。

确定脂解作用上的属性,附加有或没有脂肪形成的培养基培养细胞为14天。经过这一次,他们增加了10或100μ克/毫升Citrus bergamia为进一步的14天。

2.6。油红O染色

验证脂肪形成的分化的细胞培养,油红O染色,14日,21岁,28天。油红O lysochrome重氮染料(脂溶性)用于染色的中性甘油三酯和脂质部分和细胞。,细胞6-well盘子轻轻冲洗了PBS和固定formalin-PBS 10%解决方案1小时。在125年消除这个解决方案μL 0.3%的石油红色O-isopropyl酒精添加到每个好,在室温下保持15分钟,染色细胞。15分钟后,每个好洗了三次,和染料在细胞筛选了125μ异丙醇的L。然后,100年μL的洗出液在每个被转移到96孔板,光学密度 纳米测量使用标。

2.7。决心去和分解脂肪的标记

过氧物酶体的表达proliferator-activated受体(PPAR -γγ),脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(A-FABP),脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL),荷尔蒙脂肪酶(高速逻辑),单甘油酯脂肪酶(球型)5′腺苷monophosphate-activated蛋白激酶(AMPK)α1/2,pAMPKα1/2是评估通过免疫印迹分析中描述Lo Furno et al。16]。anti-PPAR——使用的抗体γ(h - 100: sc - 7196,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,)(稀释1:300),anti-A-FABP (C-15: sc - 18661)(稀释1:300),anti-ATGL (h - 144: sc - 67355)(稀释1:300),anti-HSL (h - 300: sc - 25843)(稀释1:200),anti-MGL (h - 300: sc - 134789)(稀释1:200),anti-AMPKα1/2 (H300: sc - 25792)(稀释1:200),anti-p-AMPKα1/2(刺172:sc - 33524)(稀释1:300)和反α微管蛋白(T9026;Sigma-Aldrich)(1: 5000稀释)。主要抗体绑定的信号强度与ImageJ软件和规范化的方法,定量地分析了加载控制α微管蛋白。值表示为任意密度测量单位(ADU)相应的信号强度(比例)。

2.8。甘油试验

甘油测定从开曼群岛是由比色测定工具(项目编号10010755),甘油酶反应系统的耦合。甘油是由甘油激酶磷酸化产生glycerol-3-phosphate和腺苷′二磷酸。glycerol-3-phosphate是氧化磷酸甘油生产二羟丙酮磷酸氧化酶和过氧化氢(H2O2)。过氧化物酶催化作用的redox-coupled反应H2O2(与4-aminoantipyrine N-ethyl-N) - 3-sulfopropyl -m-anisidine,产生一个才华横溢的紫色产品的最大吸光度 nm。结果表示为μg / L 0-20甘油(动态范围的工具μg / L甘油)。

2.9。细胞生存能力分析

影响细胞的可行性Citrus bergamia评估测试的乳沟3 - (4 5-dimethyl-2噻唑基)2,5-diphenyl-2H-tetrazolium溴化(MTT)有代谢活跃的细胞线粒体脱氢酶(18]。的光密度 纳米测量使用标。

2.10。统计分析

所有数据被当作平均数±标准差至少三个独立的实验。统计分析是由使用双向方差分析Dunnett的紧随其后事后测试多个与控制。所有统计分析使用统计软件包SYSTAT版本11(美国埃文斯顿IL SYSTAT Inc .)。未配对学生的 以及被用来比较两个不同的组。一个 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。类黄酮测定

的黄酮类化合物Citrus bergamia提取富含多酚类物质在Graziano et al。10]。简单,主要的类黄酮通过高效液相色谱和HPLC-MS芹黄素6 8-diC葡萄糖苷,8-di diosmetin 6日C葡萄糖苷、neoeriocitrin柚皮苷,neohesperidin。黄酮类化合物的总量Citrus bergamia固体提取物是25 - 27% w / w。类黄酮的含量,高效液相色谱分析,如下:neoeriocitrin ( %),柚皮苷( %),neohesperidin ( %),和其他类黄酮( %)。

3.2。间充质干细胞标记的识别

第一段后,流式细胞仪分析表明,间充质干细胞造血线没有礼物标签标记(CD45, CD14、CD34)和CD44阳性,CD90、CD105(表1)。

表1
间充质干细胞标记被流仪分析。
3.3。的影响Citrus bergamia对细胞生存能力

MTT试验(图的结果1)表明,Citrus bergamia对细胞生存能力没有影响,因为治疗1、10、50、100μg / mL 48小时没有减少干细胞培养的能力在任何浓度代谢四唑盐。


图1
的影响Citrus bergamia提取(CBE)间充质干细胞生存能力,确定使用3 - (4,5-dimethyl-2噻唑基)2,5-diphenyl-2H-tetrazolium溴化(MTT)试验,经过48小时的治疗,10、50或100μ克/毫升的CBE。光密度测量的值 nm报道是关于光密度百分比注册未经处理的控制(控制),后者被认为是细胞生存能力的100%。执行的三个实验值均值±SD一式三份。
3.4。的影响Citrus bergamia在脂肪生成或脂类分解

脂肪细胞被证实存在细胞内囊泡含有脂质通过染色油红o .在控制细胞没有染色在间充质干细胞治疗脂肪形成的媒介可以欣赏大液泡的形成含有脂质中很明显的橙色染色(图2(一个)),它以时间依赖方式的规模增长。这些细胞的数量不断增加,文化(图28日的一天2(一个))。超过60%的人类间充质干细胞分化成脂肪细胞在四周诱导期。不同,与脂肪形成的细胞培养介质处理10或100μ克/毫升Citrus bergamia显示的数量和大小减少细胞内脂质空泡浓度的方式(图2(一个))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
10和100的效果μ克/毫升Citrus bergamia提取的脂质含量(CBE)间充质干细胞沾油红O在脂肪形成的分化。细胞检查在7、14、21、28天的开始分化。(a)代表三个独立实验的照片未经处理的控制(控制),脂肪形成的medium-treated细胞(AM),我+ 10或100μg / mL CBE。(b)的水平油红O合并被量化测量异丙醇提取液的吸光度 nm。数据显示相对于我和表达为平均数±标准差从三个独立的实验。 和我在同一天(100%); 与CBE 10μ在7天g / mL; 与CBE 100μ在7天g / mL。

相比于分化的脂肪细胞,间充质干细胞培养与脂肪形成的媒介14天之后,这一次添加10或100μ克/毫升Citrus bergamia为进一步14天显示较低数量的小液泡大小(图3(一个))。油红O脂质量化证实Citrus bergamia减少脂质积累时间和浓度的方式(数字2 (b)和3 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
10和100的效果μ克/毫升Citrus bergamia提取(CBE) 14日分化脂肪细胞的脂质含量沾油红o . (a)代表三个独立实验的照片未经处理的间充质干细胞(控制)、14日(脂肪细胞)分化细胞,脂肪细胞与10或100μg / mL CBE在7和14天。(b)的水平油红O合并被量化测量异丙醇提取液的吸光度 nm。数据显示相对于14天分化脂肪细胞和表达为±SD从三个独立的实验。 和14天分化脂肪细胞在同一天(100%); 与CBE 10μ在7天g / mL; 与CBE 100μ在7天g / mL。
3.5。测定脂肪生成标记

阐明了分化的抑制作用的机制Citrus bergamia蛋白表达水平的PPAR -γA-FABP, AMPKα1/2 7点被免疫印迹分析评估,14日,21日,并在不同的细胞治疗28天。PPAR -γ弱探测到在未分化的细胞,其表达水平在脂肪细胞分化的时间依赖的方式,增加的价格相比未分化细胞(图4)。相比之下,当细胞向脂肪细胞分化引起中包含Citrus bergamia在10或100μg / mL, PPAR -的表达γ是减少了。在100μg / mL, PPAR -的水平γ被减少到大约39岁,45岁,58岁和66%的7点,14日,21日,28天,分别与分化细胞(图4)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
100年10或抑制效应μ克/毫升Citrus bergamia提取(CBE)对脂肪细胞分化的间充质干细胞向脂肪细胞分化诱导通过使用脂肪形成的媒介CBE的存在与否。7、14、21、28天,脂肪细胞分化的间充质干细胞是PPAR -检查γ工厂,AMPKα1/2,p-AMPKα通过免疫印迹1/2。蛋白质水平的表达为任意密度测量单位(ADU)和p-AMPK比例α1/2 / AMPKα1/2。数据显示相对于adipogenic-treated细胞和表达为±SD从三个独立的实验。 与间充质干细胞治疗脂肪形成的媒介在同一天; 与CBE 10μ在28天g / mL; 与CBE 100μ在28天g / mL。

A-FABP cytoplasmatic蛋白质脂肪细胞中高度表达。我们的研究结果表明,间充质干细胞分化为脂肪形成的媒介相比,28天,孵化Citrus bergamia减少总A-FABP内容时间和浓度的方式(图4)。

阐明的抑制效应的分子机制Citrus bergamia提取脂肪形成,我们调查的可能性Citrus bergamia作为一个的AMPK激活α1/2。众所周知,激活AMPK抑制脂肪形成的19]。AMPKα即使在没有1/2表达结构上Citrus bergamia。AMPK的磷酸化α1/2时增强细胞在DMEM培养包含10或100μ克/毫升Citrus bergamia,虽然AMPKα1/2水平在任何样品没有被这种治疗改变(图4)。此外,AMPK的磷酸化效率类似于7天,在28天,揭示Citrus bergamia迅速磷酸化AMPKα这些细胞的1/2。

3.6。测定脂类分解标记

分化脂肪细胞与脂肪形成的间充质干细胞培养媒介14天之后,这一次接受10或100μ克/毫升Citrus bergamia为进一步14天显示浓度和时间减少PPAR -γ(图5)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
的影响Citrus bergamia提取PPAR -γATGL高速逻辑,和球型:14天分化脂肪细胞治疗10或100年μg / mL为7到14天。蛋白质表达的水平作为任意密度测量单元(ADU)。数据显示相对于14天分化脂肪细胞(组织)和表达为平均数±标准差从三个独立的实验。 和14天分化脂肪细胞(100%)。

此外,我们研究了基因的表达参与了脂类分解ATGL等高速逻辑,球型和测量甘油释放细胞治疗或不是Citrus bergamia提取。

ATGL的生产,高速逻辑,球型调节Citrus bergamia提取时间和浓度的方式,相比与14天分化脂肪细胞(图5)。

此外,治疗14天分化脂肪细胞与10或100μ克/毫升Citrus bergamia提取显著增加的内容自由甘油19±8±2和4μg / mL,分别与控制细胞3±0.5μ克/毫升(图6)。


图6
刺激的脂类分解10或100μ克/毫升Citrus bergamia提取(CBE) 14天分化脂肪细胞,评估的甘油释放到媒体。数据表示(μg / mL)的平均数±标准差代表一式三份的实验。 和14天分化脂肪细胞; 与CBE 10μ在7天g / mL; 与CBE 100μ在7天g / mL。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现一个Citrus bergamia提取隐含的积累细胞内的脂质在脂肪形成的间充质干细胞分化,促进了脂类分解抑制脂肪形成的基因的表达和激活分解脂肪的基因。的Citrus bergamia介导的抑制脂肪形成的发生通过减少PPAR -γA-FABP和激活AMPK。的Citrus bergamia通过增加ATGL介导激活的脂解作用发生,高速逻辑,球型表达式和甘油释放。

众所周知,肥胖是因为能量摄入和支出之间的不平衡,导致脂肪细胞的数量增加(增生)和增加脂肪细胞大小(肥大)[2]。相反,脂解作用是最重要的一个机制来减少脂肪质量,导致三酰甘油储存在脂肪细胞的分解和释放游离脂肪酸和甘油3]。因此,抑制脂肪细胞的分化和增殖和/或促进脂肪动员脂肪细胞可以作为肥胖的治疗和预防的策略。

报导了几个天然产品,参与脂肪形成的抑制19]。在这其中,黄酮类化合物是天然多酚类化合物存在于各种水果、蔬菜、种子(19]。这些产品具有许多生理、药理、抗氧化和抗菌活动(20.- - - - - -22]。

柑橘是全世界最重要的水果作物之一,有丰富的营养物质和生物活性的化合物。柑橘类水果不仅包含基本的营养成分,如维生素、矿物质、果胶、膳食纤维,而且充足的生物活性化合物包括类黄酮、类胡萝卜素、柠檬苦素类似物,香豆素类。近年来,柑橘类水果的研究使用的预防和治疗肥胖及其相关代谢疾病已经吸引了越来越多的关注(23- - - - - -27]。

Citrus bergamia,通常叫佛手柑,是一种水果主要用于从果皮中提取的精油的制药行业,化妆品行业,食品行业的香味。相反,苦味的果汁,因为没有找到一个真正的行业中使用,它被认为是一种浪费的精油产量。然而,果汁是一种天然黄酮类化合物的来源,尤其是在柚皮苷、橘皮苷,neohesperidin, neoeriocitrin [18]。在这个研究中,我们证明了Citrus bergamia提取影响脂肪形成和脂类分解给一个新行业的有用建议使用佛手柑汁,否则将是一个不能用的垃圾产品。

脂肪细胞的分化是由一个复杂的机制包括转录监管协调adipocyte-specific基因的表达变化(28]。PPAR -γ核受体是一个关键的转录因子在脂肪生成和脂肪生成29日- - - - - -33]。它调节基因的表达与脂肪酸氧化,合成和脂肪生成。我们的结果表明,Citrus bergamia提取了PPAR -的表达γ抑制preadipocytes进入脂肪细胞的分化。

众所周知,激活AMPK减弱脂肪生成包括甘油的合成脂质和增强脂肪酸氧化34,35]。据报道也可以激活AMPK黄酮类化合物槲皮素、儿茶素等(32),这两个抑制脂肪形成。对于分子机制,Thr172 AMPK的残渣α子单元是由肝脏激酶磷酸化B1或钙/ calmodulin-dependent蛋白激酶激酶-β(36,37]。

我们的数据表明,Citrus bergamia提取的磷酸化增强AMPK在间充质干细胞,表明它作为AMPK的活化剂。也许,Citrus bergamia提取调节钙的活性/ calmodulin-dependent蛋白激酶激酶-β在脂肪细胞,触发了AMPK级联,减弱脂肪形成的进展。

总之,我们目前显示Citrus bergamia抑制脂肪形成的差别通过对这些PPAR -γ函数通过激活AMPK在脂肪细胞分化的间充质干细胞。因此,Citrus bergamia提取有潜力作为antiadipogenic代理来降低身体脂肪的含量,防止体重增加。也需要强调3 t3-l1细胞已被用来作为模型的多数在体外发表的研究到目前为止(38- - - - - -40]。在目前的研究中,我们使用间充质干细胞从人类脂肪组织证实他们是一个很好的模型来研究茶多酚或其他天然化合物对肥胖的影响。

5。结论

总之,这项研究的结果表明Citrus bergamia提取物,含有的化合物如neoeriocitrin、柚皮苷,neohesperidin,和其他类黄酮,有效地降低了细胞内的中性脂质水平通过促进甘油三酯代谢,以减少脂肪储存在脂肪细胞中,从而对抗肥胖。此外,Citrus bergamia提取显示脂肪形成显著的抑制作用,减少生产能力成熟脂肪细胞和间充质干细胞调节脂肪组织质量。

因此,Citrus bergamia提取可能是一个有用的天然产品改善脂肪动员与肥胖相关的疾病。

相互竞争的利益

作者声明没有实际或潜在的利益冲突。

作者的贡献

黛博拉罗Furno和阿德里亚娜卡罗爱Graziano这项研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

这项工作是支持的拨款Ricerca Finanziata Ateneo(卡塔尼亚大学)鳕鱼。21040104。