文摘
组织因子(TF)的发起者是凝血级联后与激活因子VII (FVIIa)。此外,TF / FVIIa复杂也激活胞内信号通路导致炎性细胞因子的生产。TF / FVIIa复杂的组织因子途径抑制inhibitor-1 (TFPI-1)。过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγγ)是一种转录因子,PPAR在一起α和PPARβ/δ、控制巨噬细胞功能。然而,是否PPARγ人类巨噬细胞激活调节的表达TFP1-1尚不清楚。在这里,我们报告,PPARγ激活增加TFPI-1的表达在人类巨噬细胞在体外和体内循环外周血单核细胞。PPAR TFPI-1表达式的感应γ配体,共享的PPAR的激活产生影响α和PPARβ/δ也发生在M1促炎和抗炎M2巨噬细胞极化。作为一个功能的后果,PPAR治疗γ配体显著降低了FVIIa引起的炎症反应,以引发的变化来衡量,MMP-2, MCP-1表达式。这些数据确定PPAR小说的角色γ特遣部队的控制途径。
1。介绍
巨噬细胞是异质细胞显示一系列的功能表型从M1促炎M2抗炎,根据他们的微环境1]。巨噬细胞在动脉粥样硬化的发病机制发挥至关重要的作用。事实上,在动脉粥样硬化斑块,巨噬细胞控制炎症反应、脂质处理(胆固醇积累、贩运和流出)和efferocytosis2- - - - - -4]。此外,巨噬细胞也参与了动脉粥样硬化斑块thrombogenicity通过他们的生产能力组织因子(TF)和其自然抑制剂TFPI-1 [5,6]。
TF是一种跨膜糖蛋白的细胞因子受体超家族成员作为启动的关键因素的凝血级联7]。TF表达内皮细胞和单核细胞/巨噬细胞刺激后氧化低密度脂蛋白、脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子(TNF)α(8]。不恰当的脉管系统内的TF表达在动脉粥样硬化斑块破裂导致互动循环FVIIa导致TF / FVIIa复杂的形成启动外在凝血途径通过酶的级联反应——推动外汇转换成凝血酶的产生,最终导致血栓形成(9]。
旁边止血的功能,TF / FVIIa复杂也扮演着重要的角色在细胞迁移,转移和血管生成,可能通过细胞内信号事件(10,11]。事实上,TF / FVIIa复杂导致促炎细胞因子的生成,如il - 6和引发12,13]。TF / FVIIa-mediated外在凝血途径是由组织因子途径抑制inhibitor-1 (TFPI-1)——Kunitz-type抑制剂可以阻止一代(8]。TFPI-1主要由血管内皮细胞和巨噬细胞合成,也出现在等离子体自由形式或与脂蛋白或血小板8]。特遣部队和TFPI-1比之间的不平衡将影响TF / FVIIa-mediated凝血和炎症。
的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγγ),连同PPARα和PPARβ/δ,属于一个家族的转录因子表达了在他们控制炎症反应,巨噬细胞胆固醇代谢和吞噬作用[14,15]。PPARs也调节巨噬细胞thrombogenicity;事实上,PPARα配体减少LPS-induced TF表达(16,17而PPAR的作用γ在控制TF表达不清楚;在一些报道PPARγ被描述为没有影响(17当别人显示PPAR]γ减少TF表达(18]。然而,没有数据可用的监管由PPAR TFPI-1表达式γ在人类巨噬细胞。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
单核细胞的密度梯度离心法分离健康志愿者和分化成巨噬细胞通过7天的RPMI1640媒介文化与庆大霉素(表达载体、法国)补充(40μg / mL),谷酰胺(2毫米)(Sigma-Aldrich、法国),和10%的人类血清(Abcys、法国)19]。M2巨噬细胞分化得到的单核细胞在人类的存在il - 4 (15 ng / mL, Promocell,德国),而得到了M1巨噬细胞通过激活巨噬细胞分化与有限合伙人(100 ng / mL, 4 h) (20.]。表明,合成配体PPAR吗γ(600 nM或罗格列酮GW1929 100海里),PPARα(600海里),GW647 PPARβ/δ(GW1516 100海里)添加24 h到分化的巨噬细胞。一些实验进行分化的巨噬细胞的激活与GW1929 24小时(600海里),清洗,随后在没有或在激活FVII (FVIIa 10 nM, Cryoprep)进行进一步的24小时。
2.2。RNA提取和分析
细胞总RNA提取使用试剂盒(生活技术,法国)。RNA是反向转录和互补是量化通过Q-PCR MX3000装置(Stratagene)使用特定的引物(表1)。还有的mRNA水平正常化。每个基因的相对表达被ΔΔCt计算方法,其中ΔCt是价值减去Ct(循环阈值)的价值还有Ct值的目标基因。还有目标的数量相对于mRNA表达为。
2.3。体内研究
四十非糖尿病患者冠状动脉支架植入术后患者服用吡格列酮(30毫克每天8周)(补充表1网上http://dx.doi.org/10.1155/2016/2756781)[21]。RNA提取外周血单核细胞(PBMC)使用Paxgene血液RNA系统在研究的开始和八周的随访。
2.4。蛋白质的提取和免疫印迹分析
洗后在寒冷的PBS,细胞收获在寒冷的裂解缓冲(里帕)。由离心收集细胞匀浆和蛋白质浓度决定使用BCA化验(皮尔斯Interchim)。蛋白溶解产物(20μg)是解决10% sds - page,转移到硝化纤维素膜(Amersham),然后显示兔单克隆抗体TFPI-1 (Abcam)或山羊多克隆抗体β肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术)。与二次孵化后peroxidase-conjugated抗体(圣克鲁斯生物技术),免疫反应性的乐队是由化学发光显示发射极耦合逻辑检测设备(Amersham)和带强度量化使用数量一个软件。
2.5。测量TFPI-1, ELISA MCP-1分泌
大量TFPI-1蛋白质测定培养基的巨噬细胞治疗与GW1929 24小时(600海里)没有或未分离肝素的存在(1 U /毫升,赛诺菲-安万特添加1 h中收集之前)(22),使用人类TFPI Quantikine酶联免疫试剂盒(研发系统)。MCP-1分泌是衡量ELISA (Peprotech、法国)根据制造商的指示。
2.6。TFPI-1特定活动的测量
TFPI-1比活度测量使用Actichrome TFPI活性分析(美国Diagnostica)制造商的指令后培养基的细胞治疗与否与GW1929 24小时(600海里)。
2.7。Short-Interfering (si) RNA转染和Adenoviral感染
分化RM巨噬细胞转染了人类PPAR siRNA具体γ小干扰rna (Ambion)和nonsilencing控制炒,使用转染试剂DharmaFECT4 (Dharmacon)。16小时后,细胞被孵化GW1929(600海里)或车辆(DMSO)和收获24 h后。adenoviral感染,巨噬细胞感染了重组腺病毒编码绿色荧光蛋白(绿色荧光蛋白,Ad-GFP)或PPARγ(Ad-PPARγ)所描述的23,24]。16 h(感染后,细胞进一步孵化24小时没有或罗格列酮(Rosi 100海里)的存在。
2.8。ChIP-seq数据处理和分析
染色质免疫沉淀反应之后,高通量测序(ChIP-seq)进行监控H3K9ac水平M2巨噬细胞对H3K9ac使用抗体(微孔(17 - 658))25]。ChIP-seq数据被映射到Hg18和信号归一化的总数标签之前可视化使用集成的基因组浏览器(游戏)26]。PPARγChIP-seq数据主要从人类脂肪细胞获得(27)和PPARγ响应元素(PPRE)搜索使用龙PPAR响应元件(PPRE)观察员v.2.0 (http://www.cbrc.kaust.edu.sa/ppre/)。
2.9。统计分析
统计学生的团体之间的差异进行了分析以及和认为重要的时候。
3所示。结果
3.1。PPARγ激活增加TFPI-1表达和分泌的主要人类巨噬细胞
调查是否PPARγ激活调节TFPI-1表达式,外周血单核细胞(PBMC),细胞群包括循环单核细胞,分离得到吡格列酮前后患者管理。有趣的是,吡格列酮治疗显著增加TFPI-1 mRNA的表达在PBMC(图1)。
此外,激活人类的主要合成PPAR分化的巨噬细胞γ配体GW1929和罗格列酮(Rosi)导致TFPI-1基因表达的诱导时间和剂量依赖性的方式(数字2(一个)和2 (b))。本条例也发生在蛋白质水平巨噬细胞治疗24小时或48小时GW1929(600海里)(图2 (c))。诱导TFPI-1 PPAR基因表达也被观察到β/δ和PPARα分别激活GW1516和GW647配体(补充图1)。此外,培养基TFPI-1浓度被PPAR增加γ激活与GW1929没有以及肝素的存在,已知这一因素增强TFPI-1释放(22)(图2 (d))。然而,TFPI-1特定活动不是由PPAR修改γ人类巨噬细胞(补充图2)激活。总的来说这些数据表明PPARγ人类巨噬细胞激活增加表达和释放TFPI-1无需修改其活动。
(一)
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(c)
(d)
3.2。PPARγ活化诱导TFPI-1人类巨噬细胞基因表达在M1和M2
由于巨噬细胞可以呈现不同的功能表型相关的微环境(1),PPAR的影响γGW1929激活的研究不极化巨噬细胞(RM)以及M2蛋白的M1促炎和抗炎巨噬细胞。TFPI-1的基础表达水平明显高于RM和M1相比,M2巨噬细胞巨噬细胞(图3)。此外,PPARγ激活显著诱导TFPI-1基因和蛋白质表达的三个不同的巨噬细胞亚型(图3)。
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3.3。PPARγ配体调控TFPI-1 PPAR表达式γ端依赖的方式
支持的直接监管TFPI-1基因表达的PPARγ,我们发现附近活跃的监管区域包含或本地化这个基因的启动子,发现通过浓缩9组蛋白H3赖氨酸乙酰化作用(H3K9ac) M2巨噬细胞,包括假定的PPARγ(PPRE)和招募PPAR响应元素γ在人类的脂肪细胞,程控高表达(图4(一))。为了确认TFPI-1由于PPAR GW1929治疗引起的监管γ在巨噬细胞,实验进行了PPAR的调制γ表达水平。TFPI-1基因表达的诱导GW1929治疗是PPAR的存在显著降低γ核(图4 (b))。功能互补获得实验使用PPAR的腺病毒编码γ(Ad-PPARγ)表明,PPAR TFPI-1诱导的基因表达γ配体在Ad-PPAR罗格列酮显著增强γ来华的巨噬细胞,而Ad-GFP感染细胞作为控制(图4 (c))。这些结果表明,GW1929和罗格列酮激活TFPI-1 PPAR表达式γ端依赖的方式。
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3.4。PPARγ激活块FVIIa-Induced人类巨噬细胞炎症反应
确定的潜在生物学意义被PPAR TFPI-1感应γ考虑到TF / FVIIa复杂可以增强炎症反应(12,13),在巨噬细胞实验进行处理GW1929 24小时(600海里),清洗,随后刺激FVIIa(10海里)。MMP-2 FVIIa诱导基因表达,引发和MCP-1炎性分子(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。有趣的是,巨噬细胞的治疗GW1929(600海里)大大阻止了促炎反应由FVIIa(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。孵化与GW1929 MCP-1 FVIIa-induced分泌降低(图5 (d))。这些数据表明,PPARγ激活能抵消促炎效应由TF / FVIIa复杂,TF被巨噬细胞表达(5),可能通过增加TFPI-1表达式。事实上,TF / TFPI-1比率是PPAR的存在显著降低γ受体激动剂(补充图3),因此PPAR确凿γ激活块FVIIa-induced炎症反应。
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(c)
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4所示。讨论
特遣部队和FVIIa凝血级联的关键组件,导致纤维蛋白凝块的形成。在动脉粥样硬化斑块破裂引起血栓一代,急性缺血综合征的一个主要原因,如心肌梗死(28]。TF / FVIIa复杂但是其他潜在的角色,因为它是参与调节细胞迁移和转移以及血管生成(29日]。的确,TF / FVIIa可以诱导促炎细胞因子和因素的生产在角化细胞和肿瘤细胞(12,13,30.]。
TF /天然抑制剂TFPI-1 FVIIa行动受阻。TFPI-1已经报道的存在在人类动脉粥样硬化病变,巨噬细胞表达的物理领域接近表达特遣部队和FVIIa [6]。这表明体内,在人类动脉粥样硬化斑块,TFPI-1控制TF-driven凝固路径以及thrombogenicity和可以防止并发症与斑块破裂有关。然而,TF表达的不平衡和TFPI-1在动脉粥样硬化斑块可以影响血栓形成以及炎症。
转录因子是否PPARγ控制TF-activated途径以及其抑制剂TFPI-1物质的表达不同的研究导致了矛盾的结果。虽然它已经被PPAR的首次报道γ激活对LPS-induced TF表达没有影响巨噬细胞(17),其他的研究也显示出抑制作用的机制涉及干扰AP1信号通路(18]。此外,表达TFPI-1已被证明是罗格列酮诱导的平滑肌细胞而不是THP1巨噬细胞细胞系(18]。在这里,我们提供PPAR的证据γ激活增强基因、蛋白质表达和释放TFPI-1在人类主要分化的巨噬细胞而不影响其特定的活动。有趣的是,PPARγ激活的吡格列酮治疗显著增加的表达TFPI-1 PBMC,异质的细胞群,包括循环单核细胞,从而表明PPARγ激活体内调节TFPI-1表达式也。我们还表明,PPAR TFPI-1表达式的感应γ激活发生在M1促炎以及M2抗炎极化巨噬细胞。此外,我们发现TFPI-1更高的基础表达水平M2巨噬细胞相比,未极化的和M1巨噬细胞,这表明这些M2巨噬细胞可以控制中发挥重要作用的血小板血栓形成和纤维蛋白沉积。这些数据,生成monocyte-derived巨噬细胞与健康志愿者,吻合在在M2巨噬细胞与动脉粥样硬化患者中,基因表达水平的TFPI-1也更高的M2与M1巨噬细胞(31日]。M2巨噬细胞高表达TFPI-1可能因此导致他们的建议在斑块稳定有益作用[32,33]。
有趣的是,在大鼠颈动脉球囊损伤模型体内,以增加neointima形成和TF过度,罗格列酮注射增强TFPI-1蛋白的表达在受伤的动脉(18]。然而,体外治疗人类动脉粥样化的标本与罗格列酮导致TFPI-1蛋白表达降低与吡格列酮治疗时导致增加TFPI-1表达式(34]。这些矛盾的影响可以解释为PPAR的作用γ在其他细胞动脉粥样硬化斑块的组件。此外,他们取得了使用高浓度的配体(10μ罗格列酮和5米μM为吡格列酮,分别地。)34,不能保证在PPAR行动的特异性γ激活(35]。TFPI-1表达的诱导刺激罗格列酮和人类巨噬细胞是依赖PPAR GW1929化合物γ在PPAR作为证明γ沉默或超表达实验。
最后,我们报告,PPARγpreactivation FVIIa-driven的巨噬细胞显著降低炎症反应,产生影响,可以通过诱导介导至少部分通过PPAR TFPI-1生产γ。
5。结论
总之,我们描述一个PPAR的新功能γ在人类巨噬细胞TF的控制通路通过感应TFPI-1表达式,规定影响的thrombogenicity动脉粥样硬化斑块的炎症状态引发的TF / FVIIa复杂。
信息披露
b . Staels是法国大学医疗研究所的一员。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是支持由法国基金会,基金会倒拉医学研究院(DPC2011122981)的国家de la矫揉造作的(AlMHA项目),和“欧洲基因糖尿病研究所”(EGID ANR-10-LABX-46)。
补充材料
补充表1。患者的基线参数。数据平均±标准差,n或中位数(四分位范围)。
补充图1。PPARα和PPRβ/δ活化诱导人类主要TFPI-1巨噬细胞的表达。表达TFPI-1是衡量Q-PCR分化的巨噬细胞在没有治疗或GW1516的存在(100海里),GW647(600海里)或GW1929(600海里),24 h。结果代表从3获得独立的巨噬细胞的准备和未经处理的细胞中表达水平相对于设置为1。每个酒吧都是一式三份的平均值±SD决定。治疗和控制指示(统计上的显著差异*p< 0.05;* *p< 0.01)。
补充图2。PPARγ激活不修改TFPI-1活动在人类主要的巨噬细胞。TFPI-1特定活动是否以分化的巨噬细胞治疗GW1929为24小时(600海里)。
补充图3。PPARγ激活降低了TF / TFPI-1比率。分化的巨噬细胞治疗与GW1929 (24 h, 600海里),洗净,然后孵化的FVIIa (10 nM)为24小时。特遣部队和TFPI-1 mRNA水平衡量Q-PCR还有规范化的,和他们的比率计算并表示为一式三份的平均值±SD决定。统计上显著的差异是表示(*p< 0.05)。