过氧物酶体Proliferator-Activated受体γ调节脂质磷酸盐Phosphohydrolase 1的表达在人类血管内皮细胞

文摘

磷酸脂质phosphohydrolase 1 (LPP1)膜ectophosphohydrolase调节的可用性生物活性脂质磷酸盐,扮演重要的角色在细胞信号和生理过程,如血管生成和血管内皮迁移。然而,监管的表达LPP1在很大程度上仍是个未知数。在这里,我们旨在检查过氧物酶体的角色proliferator-activated受体γ(PPARγ)的转录控制LPP1基因的表达。在人类脐静脉内皮细胞(HUVECs),定量逆转录酶聚合酶链反应(存在)表明,PPAR的激活γLPP1的mRNA水平增加。染色质免疫沉淀反应试验表明,PPARγ结合公认的PPAR-responsive元素(ppr)内5′侧翼地区的人类LPP1基因。启动子区域的基因组片段包含1.7千碱基使用PCR克隆。PPAR的荧光素酶记者化验表明,超表达γ罗格列酮,PPAR的特定的配体γ,可以显著上调记者活动。然而,定点诱变PPRE主题废除了归纳。总之,我们的结果表明,PPARγ转录激活的表达LPP1基因ECs,暗示PPAR的潜在作用γ在磷脂的代谢。

1。介绍

磷酸脂质phosphohydrolases(牧民联盟),也称为phosphatidate phosphohydrolase-2 (PAP-2), Mg^{2 +}独立和N-ethylmaleimide-insensitive N-glycosylated积分膜ectophosphohydrolase [1,2]。牧民联盟催化脱磷酸作用范围的脂质磷酸盐,如lysophosphatidic酸(LPA)和鞘氨醇1-phosphate (S1P) [3,4]。细胞外LPA和S1P绑定到G-protein-coupled受体(GPCRs)和产生一系列病理生理行为,如血管生成、血小板激活,炎症,平滑肌细胞(smc)增殖和迁移,和心血管重构(4,5]。牧民联盟水解这些脂质磷酸盐终止信号动作或产生新的信号分子(6]。三种亚型的牧民联盟(LPP1、LPP2 LPP3)被发现(7]。LPP1负调节lysophospholipid信号通过降解生物活性溶血磷脂释放血小板和调节细胞增殖的影响,移民、炎症、凝血和伤口愈合5,6]。LPP1的活动主要是通过全程监管表达而非磷酸化等转译后的修改。的表达LPP1被人类前列腺癌雄激素诱导卵巢癌细胞减少(8,9]。然而,转录机制监管的表达LPP1基本上仍不清楚。

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)是一个家庭ligand-activated核受体和转录因子(10]。在三个PPAR亚型(α,β/δ,γ),PPARγ主要是表现在脂肪组织和血管包括血管平滑肌细胞(VSMCs)和内皮细胞(ECs) [11,12]。PPARγ形式与RXR异质二聚体和结合PPAR响应元素(ppr)在目标基因的启动子区域13]。当激活各种自然和合成配体,如前列腺素代谢物15 d-pgj2 [14)和胰岛素敏化剂罗格列酮(15),PPARγtransactivates基因表达,调节脂肪形成16)和胰岛素反应(17]。此外,PPARγ具有antiatherogenic和ECs(抗炎作用18,19]。因此,我们试图检查PPAR的角色γ的监管LPP1ECs的基因表达。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和试剂

培养的人脐静脉内皮细胞(通过传代形成细胞(如前所述)(20.]。牛主动脉内皮细胞(BAECs)是从牛主动脉和维护与10%的边后卫DMEM (21]。罗格列酮、GW501516 GW9662从开曼群岛获得化学。多克隆兔anti-PPARγ和兔免疫球蛋白是来自圣克鲁斯生物技术。荧光素酶检测试剂、MMLV逆转录酶聚合酶,限制性内切酶(XhoI NheI)和DNA连接酶来自Promega公司。Lipofectamine 2000和试剂盒试剂获得表达载体。QuikChange定点诱变工具包是Stratagene公司。

2.2。Adenoviral感染

细胞被感染腺病毒编码人类PPAR野生型α,β/δ,或γ1 (Ad-WT-PPARα或Ad-WT-PPARβ/δ,Ad-WT-PPARγ)一起Ad-tTA,编码tetracycline-responsive反式激活因子。50岁以前这些病毒结构描述和使用多样性的感染(22,23]。感染细胞保持在四环素(0.1的存在与否μg / mL, tet-off表达式)所描述的48小时20.]。

2.3。RNA提取和实时定量rt - pcr(存在)

总RNA提取试剂盒试剂和反向转录成互补脱氧核糖核酸与oligo-dT M-MLV逆转录酶作为底漆。实时PCR进行SYBR-green染料和DNA聚合酶引擎内髓实时系统(Bio-Rad实验室Inc .)。GAPDH是作为内部控制。引物序列是:LPP1 5′-TCAACTGCAGCGATGGTTAC(向前),5′-GCCCACATAAATGGATACGG(反向);GAPDH 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC(向前),5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA(反向)。

2.4。突变质粒,转染,记者分析

基因组片段包含1921−−221个基点上游的转录起始站点的人类LPP1从人类基因组DNA基因PCR扩增的引物(5′-CTTGATAGTACAACAGGGTCA和5′-TCAGGTGGTCTCCGAACT)侧翼NheI XhoI场所。放大产品subcloned进pGL3-basic向量生成pGL3 / LPP1-luc荧光素酶。Quickchange定点诱变工具包用于生成pGL3 / mLPP1-luc中断的假定的PPRE网站(624−−611个基点)使用诱变引物的5′-GAGGGATTCTGGCTAAAGGCG(一)克T(G) TCCC(AA) GGT(G) CTTCTACAAC和5′-GTTGTAGAAG一个(C) CCGG(TT)遗传算法一个(C) CC(T) GCCTTTAGCCAGAATCCCTC。质粒转染pRSV——一起β加质粒进入BAECs利用Lipofectamine 2000。荧光素酶活性测定的荧光素酶检测装备和规范化β牛乳糖活动。

2.5。染色质免疫沉淀反应

HUVECs Ad-WT-PPAR感染γ,48 h后,用1%甲醛交联。剪切染色质dna immunoreacted 2μg anti-PPARγ抗体(免疫球蛋白G -控制)和沉淀蛋白A / G琼脂糖珠。的筛选了免疫沉淀反应和蛋白酶k消化qPCR DNA扩增的引物侧翼的假定的ppr。芯片检测的引物见表1。

2.6。统计分析

数据表示为均值±SEM从至少三个独立的实验。用单向方差分析进行了统计分析。的值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。ppr反复出现的主题在5′侧翼地区的人类LPP1基因

我们分析了人类LPP1使用MatInspector 5′侧翼(NC_000005.9) (http://www.genomatix.de/),确定了三个假定的PPRE图案,分别定位在−418个基点(AGGTCAACGTTGA)−548个基点(AATTCAACGGTGA)和−611个基点(AGGTCAAGGGCTT)上游的转录开始网站的人类LPP1基因(图1)。

3.2。PPARγ移植LPP1基因表达在ECs

检查是否PPARγ调节LPP1,我们被感染与Ad-WT-PPAR HUVECsγ一起Ad-tTA四环素(0.1的存在与否μg / mL) 24 h。然后,PPAR细胞治疗γ罗格列酮配体(5μ米)24 h。LPP1的存在结果表明mRNA水平显著诱导ECs激活与罗格列酮或overexpressing PPARγ。罗格列酮进一步增强PPAR的感应γ超表达(图2)。

调查其他两种亚型的PPARs是否也有类似的效果,我们也感染了ECs Ad-WT-PPARα或Ad-WT-PPARδ与他们的特定的受体激动剂和治疗非诺贝特(5μM)和GW501516 (1μ米)24 h。无论是PPAR LPP1 mRNA水平没有影响α或PPARβ/δ超表达。同样,PPARα和PPARβ/δ受体激动剂没有影响LPP1表达式(图2)。

为了检查是否罗格列酮是PPAR特定的效果γ,我们使用GW9662选择性拮抗剂,预处理ECs前曝光。如图3,PPARγ罗格列酮对抗明显减毒LPP1感应。综上所述,这些研究结果表明LPP1基因被PPAR诱导γ激活。

3.3。PPARγ启动子的PPRE结合人类LPP1基因

序列分析的5′侧翼地区的人类LPP1基因显示三个假定的PPRE图案。检查是否PPARγ绑定到这些地区,与anti-PPAR芯片进行分析γ抗体和免疫球蛋白的控制。结果表明,PPARγ可以绑定到PPRE位于611−624 /−英国石油公司上游的人吗LPP1基因,而这两个近端网站481 / 468年和561−−−−548没有绑定(图4)。这一结果表明,在611−624 /−PPRE可能调解PPAR的感应γ。

3.4。PPARγ增加了启动子的人类活动LPP1通过绑定PPRE3基因

进一步检查是否PPARγ促进了LPP1基因转录活动,我们构造pGL3 / LPP1-luc记者由包含三个假定的ppr(图的片段5(一个))。BAECs与pGL3 / LPP1-luc质粒转染。荧光素酶检测表明,该记者PPAR的活动增加了罗格列酮或超表达γ(图5 (b))。然而,定点诱变PPRE 611−624 /−废除PPAR的感应γ,这表明在611−624 /−PPRE PPAR cis-element调停γtransactivation。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们已经展示了一个转录调节的表达机制LPP1基因。我们提供了新颖的PPAR的证据γ和它的特定受体激动剂罗格列酮积极调节的转录LPP1ECs的基因。我们还确定了PPRE监管区域的主题LPP1基因介导PPAR的作用γ。

转录调节的说明LPP1因为生理重要吗LPP1是一个关键酶的分解代谢LPA和S1P生物活性脂质磷酸盐(5]。因此,考虑到质量和ECs的广泛分布,感应的LPP1表达可能导致深远的LPA和S1P的浓度下降,在循环和组织,发挥重要的生物学效应。尽管PPARγ其主要角色在脂肪生成和胰岛素敏感性的规定,也有各种各样的保护对心血管功能的影响,从动脉粥样化形成血压调节(24,25]。的发现PPARγ诱发LPP1ECs的表达式可能提供新的见解PPAR的心血管效应的分子机制γ调制。

LPP1是一种胞外酶的活性位点位于质膜的外表面。降解细胞外LPA monoacylglycerol,可以带进细胞产生细胞内LPA酰基甘油激酶。有趣的是,细胞内LPA已知是PPAR激动剂γ(26,27]。因此,它被PPAR假定LPP1的规定γ可以作为细胞外的正循环LPA退化。在人类动脉粥样硬化病变,LPA在脂质积累的核心斑块和体内促进动脉粥样硬化的发展28,29日]。Lipoprotein-derived LPA促进了动脉粥样硬化动物模型(30.]。相比之下,PPARγ受体激动剂thiazolidinediones (TZD)减少动脉粥样硬化斑块在糖尿病患者和动物模型(31日]。因此,LPP1和随后的减少LPA的感应是否有助于antiatherosclerotic PPAR的效果γ还有待调查。此外,PPAR的影响γ激活蛋白水平,LPP1酶活性,细胞外LPA水平和S1P将来需要检查。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究由美国国家科学基金会支持的中国(81220108005和81220108005)和中国科技部(2010 cb912500)。

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