文摘

高机动组框1 (HMGB1)是一个无处不在的核dna结合蛋白质的功能取决于其细胞的位置。细胞外HMGB1作为启动延迟中介的促炎细胞因子和放大炎症反应,而核HMGB1可以防止心脏肥厚和心力衰竭。因为非诺贝特,一个过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARα)受体激动剂,显示两个保护作用对心脏肥大和抑制效应对炎症,HMGB1表达和分泌的潜在调制非诺贝特的极大兴趣。我们在此提供证据表明,非诺贝特调节基底和LPS-stimulated HMGB1表达和定位除了HMGB1在心肌细胞的分泌。此外,政府的非诺贝特老鼠预防心脏肥大的发展引起的胸主动脉横缢痕(TAC),同时增加核HMGB1的水平。总之,这些数据表明,非诺贝特可能抑制心脏肥大的发展通过调节HMGB1表达,它提供了一个新的潜在策略来治疗心脏肥大。

1。介绍

高机动组框1 (HMGB1),核dna结合蛋白,表达在不同的细胞类型,包括心肌细胞(1,2]。HMGB1展品根据其不同功能细胞的位置。在细胞外室,它在炎症反应中起着重要的作用积极从强调细胞分泌3]。然而,除了其细胞外功能,细胞内HMGB1参与的基本细胞过程如转录、复制和DNA修复(4,5]。HMGB1已经证明在心血管疾病中发挥至关重要的作用在不同的研究6]。此外,维护稳定的核HMGB1水平已成为一个潜在的治疗心脏肥大因为HMGB1原子核中的超表达可以通过抑制DNA损伤预防肥厚和心力衰竭(2]。

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs) ligand-dependent属于核受体超家族转录因子(7]。有三个已知的PPAR亚型, , , 展览,组织分布和legend-specific效应(8,9]。特别是,PPAR 丰富代谢活跃的组织,包括肝脏、棕色脂肪,肾脏,骨骼肌,心脏(10]。心中除了他们的代谢作用,PPAR 及其受体激动剂非诺贝特收到了极大的关注,因为他们影响相关心脏炎症和肥大(11,12]。在心肌细胞中,与非诺贝特共同抑制肥厚性反应引起endothelin-1通过减少心肌细胞表面积和蛋白质合成减少13]。非诺贝特也降低了Ang-II TGF -的诱导表达 1、胶原蛋白沉积和巨噬细胞浸润过程中心肌炎症(14]。考虑到HMGB1心肌细胞中高度表达,促进心脏炎症和心脏肥大,我们假设HMGB1可能受非诺贝特。因此,我们调查是否激活PPAR 非诺贝特,PPAR 特殊受体激动剂,调节HMGB1表达和定位在心肌细胞。此外,我们提供洞察PPAR的可能机制 抑制心肌肥大的恶化,HMGB1参与。这项研究揭示了一个小说在调制HMGB1表达和非诺贝特的作用提供了一种新的非诺贝特治疗心脏肥大的潜在机制。

2。材料和方法

2.1。试剂

非诺贝特(目录:F6020)和有限合伙人(目录:L3755)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州)。所有的细胞培养基从σ和补品。HMGB1抗体(目录:3935)从细胞信号技术(丹弗斯,MA)。的anti-PPAR 抗体(目录:ab8934)和anti-histone H3抗体(目录:ab1791)获得Abcam(香港)。anti-actin抗体(目录:A2668)从σ。引物的定量实时反向transcriptase-PCR设计使用基因库序列。

2.2。细胞培养

新生大鼠心肌细胞的主要文化进行如前所述[15,16]。总之,心被从1 -收集幼童新生儿老鼠安乐死之后,立即斩首。心室组织部分受到多次酶和胶原酶消化II(沃辛顿)。消化样品然后在800 g离心5分钟在4°C和收集细胞。Nonmyocytes被移除的两轮preplating文化菜肴。丰富了心肌细胞培养在4毫升的生长培养基(杜尔贝科的修改鹰中补充10%胎牛血清和10μM胞嘧啶1 - -d-arabinofuranoside)。胞嘧啶1 - -d-arabinofuranoside抑制污染nonmyocytes的增长。超过90%的心肌细胞(阳性细胞 辅肌动蛋白)。心肌细胞与PBS第二天洗去除游离细胞和被用于实验后在3 d细胞稳定。

2.3。肥厚性心肌模型

心脏肥大是由胸主动脉收缩横诱导小鼠(TAC),一个著名的外科技术,过载会导致压力。TAC模型一直是以前用于检查HMGB1的作用[2,17]。健康的10周大雄性老鼠重26克被随机分为模型组和虚假的组。胸TAC如胡锦涛等。所述执行18]。简单地说,老鼠麻醉通过腹腔内注射氯胺酮的混合物(80毫克/公斤)和甲苯噻嗪(8毫克/公斤),和主动脉弓暴露在胸腺,没有开胸,老鼠在自然呼吸。以丝线在通过主动脉之间的起源右无名和左颈总动脉和主动脉,就和一个弯曲27-gauge针放置与主动脉弓。结扎后,针很快就被移除,皮肤被关闭,老鼠被允许恢复在红外线下直到他们完全清醒。虚假的操作是一样的,除了线程不结扎。

2.4。超声心动图

超声心动图是用来确定心脏参数住老鼠,包括心室壁厚(IVS)室舒张维度(LVEDD)、左室收缩末期维度(LVESD)。超声心动图进行小鼠镇静与异氟烷氧蒸发。Vevo 770高分辨率回波系统配备了35 MHz传感器被用来获取图像。所有的老鼠进行了超声心动图在TAC或虚假的手术后4周。

2.5。RNA提取和实时PCR

从心肌细胞总RNA,心被隔离使用试剂盒试剂(技术)。总RNA reverse-transcribed互补使用TaqMan反转录试剂盒(应用生物系统公司)根据制造商的协议。实时PCR进行设备使用一个iCycler SYBR绿色我探头(Bio-Rad大力神,CA)。分析了每个样本一式三份和mRNA水平正常化GAPDH mRNA水平。老鼠HMGB1 PPAR 信使rna水平,除了鼠标ANP、BNP, mhc mRNA水平,实时rt - pcr定量测定。引物序列表1。PCR产品在2%琼脂糖电泳进行验证。

表1
实时PCR引物。
2.6。免疫印迹分析

细胞质和核蛋白质的新生儿鼠和成年小鼠心室提取使用核和胞质提取试剂(皮尔斯,罗克福德,IL)根据制造商的指示。心肌样品的蛋白质含量是决定使用一种蛋白质浓度测定(Bio-Rad实验室、大力神、CA)。提取的蛋白质在蛋白质缓冲煮5分钟,12% sds - page分离,并转移到硝酸纤维素。膜在室温下孵化了1 h TBS-T (Tris-buffered盐水含0.1%渐变20)含5%脱脂奶阻止非特异性结合位点。膜被孵化一夜之间在4°C的主要抗体。5分钟的膜被TBS-T缓冲三次,然后用辣根孵化peroxide-conjugated二级抗体室温1 h。最后,膜的开发使用ECL试剂(有力的生物技术,北京)和暴露于柯达XBT-1电影。

2.7。ELISA分析HMGB1的媒介

ELISA分析如前所述[19]。HMGB1水平心肌细胞上清液测定使用商用酶联免疫试剂盒从Shino-Test公司(日本东京)根据制造商的指示。吸光度测量在450 nm ELISA阅读器(Bio-Rad实验室)。

2.8。统计分析

使用SPSS软件分析数据。所有的实时PCR和ELISA数据给出平均值±标准平均误差(SEM)。所有的实验至少重复三次。组之间的差异进行评估使用单向方差分析方差分析与事后Bonferroni测试。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。非诺贝特抑制HMGB1的基底和LPS-Induced表达心肌细胞

据报道,HMGB1和PPAR 在心肌细胞中表达的是既定的2];因此,我们研究是否激活PPAR 影响HMGB1表达新生大鼠心肌细胞的主要文化。非诺贝特诱导时间减少HMGB1表达在mRNA水平和蛋白质水平(数字1(一)和1 (b)HMGB1的浓度差别),这对这些(数据的依赖1 (c)和1 (d))。此外,HMGB1的分泌也抑制了非诺贝特(图1 (g))。

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图1
非诺贝特抑制HMGB1的基底和LPS-induced表达。(a)和(b)非诺贝特诱导时间的表达抑制HMGB1在初级心肌细胞在mRNA水平(a)和(b)蛋白水平。细胞治疗10μ米非诺贝特的12、24、36 48岁和60 h之前被用于实验。(c)和(d) Fenofibrate-induced浓度抑制HMGB1在原发性心肌细胞信使rna的表达水平(c)和蛋白质(d)水平。细胞治疗,10,100μ米非诺贝特实验前36小时。(e)和(f)非诺贝特抑制心肌细胞的基底和LPS-induced HMGB1表达由实时PCR (e)和免疫印迹(f)。细胞治疗DMSO车辆或相同剂量的非诺贝特的最终浓度10μ为36 h M;有限合伙人(50 ng / mL)然后添加和孵化10 h。(g)非诺贝特的基础和LPS-induced分泌抑制HMGB1的心肌细胞;类似的治疗方法进行描述(e)和(f),并通过ELISA HMGB1水平进行了分析。所有的数据至少代表三个独立的实验中,在(a)和数据,(c), (e)和(g)提出了均值±SEM。 和DMSO车辆和 与有限合伙人。

考虑到表达HMGB1可能增加的疾病,除了评估非诺贝特对HMGB1表达在基础层面上,我们也调查了影响upregulation HMGB1的有限合伙人。如数据所示1 (e)和1 (f),HMGB1表达增加与有限合伙人的待遇。然而,预处理与非诺贝特减毒LPS-induced upregulation HMGB1。HMGB1水平上层清液也由ELISA,发现变化与HMGB1表达(图1 (g))。

3.2。激活的PPAR非诺贝特调节HMGB1的本地化

众所周知,HMGB1通常是位于细胞核chromatin-associated蛋白质,其功能是依赖于其细胞的位置。然而,这仍然是未知的非诺贝特是否调节HMGB1的nuclear-cytoplasmic易位。在这里,我们发现的蛋白质水平HMGB1在细胞核和细胞质的心肌细胞有或没有非诺贝特治疗。如图2,HMGB1主要表达在DMSO溶液对照组心肌细胞的细胞核,和非诺贝特治疗在细胞核中HMGB1蛋白水平降低而DMSO的控制。然而,LPS刺激导致HMGB1急剧增加心肌细胞的细胞核和细胞质,这也抑制了非诺贝特。因此,非诺贝特调节HMGB1表达也可以调节其核和细胞质本地化。

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图2
非诺贝特调节HMGB1在心肌细胞的定位。细胞治疗10μ米非诺贝特或DMSO 36 h,然后有或没有LPS刺激(50 ng / mL) 10 h。(一)细胞被免疫印迹分析来确定非诺贝特对HMGB1的分布在细胞核和细胞质之间。组蛋白H3和胞质微管蛋白被用作核加载控制蛋白和胞浆蛋白,分别。数据是代表三个独立的实验。(b)微免疫印迹结果, 表示比较;所有的数据都表示为±SEM手段, 。
3.3。HMGB1表达和位置的老鼠的心有或没有心脏肥大

后证明PPAR的效果 在心肌细胞的HMGB1表达和定位,我们接下来研究了这种效应是否会影响心脏肥大的进展。心脏肥大引起的TAC小鼠模型用于调查HMGB1和PPAR的表达 在模型小鼠的心。控制老鼠受到虚假的手术。在手术后4周,TAC小鼠和虚假的老鼠都牺牲了,他们的心被迅速切除实验。我们发现心脏的重量的增加明显高于TAC小鼠比虚假的老鼠(图3(一个)),这意味着心脏肥大模型已成功构建。我们接下来检查HMGB1的表达和PPAR 心的TAC集团和虚假的集团,和结果表明,PPAR 虚假的组的表达高于TAC组。相比之下,HMGB1表达更高的TAC组(图3 (b))。此外,我们还确定HMGB1的本地化心肌细胞在TAC和虚假的老鼠。sham-operated发现的老鼠相比,核的表达HMGB1的TAC组低,而细胞质HMGB1较高(图的表达3 (c)),这表明HMGB1的位置在心肌细胞可能与心脏肥大的进展。

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图3
减少PPAR的表达 和增加在肥厚性引起的心TAC HMGB1的表达。(一)心脏体重:体重在TAC和sham-operated老鼠在手术后4周。PPAR下降(b) HMGB1蛋白水平增加,心肌细胞在TAC操作;免疫印迹分析执行PPAR的表达 HMGB1, 肌动蛋白作为加载控制。(c)易位的HMGB1核后细胞质TAC操作;组蛋白H3和胞质微管蛋白被用作核加载控制蛋白和胞浆蛋白,分别。所有的数据都是代表至少有三个独立的实验。(a)中的数据提出了均值±SEM五从每组小鼠。 与sham-operated老鼠。
3.4。非诺贝特防止心脏肥大的发展可能通过调节HMGB1本地化

的在体外实验清楚地表明,非诺贝特调节HMGB1表达和定位在心肌细胞。此外,核HMGB1在TAC小鼠心肌细胞也发现调节。确定非诺贝特也调节HMGB1在活的有机体内,老鼠接受了TAC操作被随机分为两组:一组非诺贝特(50毫克/公斤通过填喂法)每天手术后4周,另一组注射生理盐水。Sham-operated老鼠作为正常对照组和接收盐水而非非诺贝特。非诺贝特治疗HMGB1蛋白水平增加的细胞核在更大程度上TAC(图组4(一))。

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图4
非诺贝特抑制心脏肥大的发展和增加心脏核HMGB1的表达。(a)小鼠治疗用生理盐水或相同剂量的非诺贝特(50毫克/公斤通过填喂法)术后4周;的心核HMGB1含量分析的老鼠免疫印迹,组蛋白H3是用作加载控制。(b)小鼠治疗如上所述,ANP、BNP mhc基因表达在老鼠身上被实时PCR定量分析。所有的数据至少代表三个独立的实验,和(b)中的数据均值±SEM从五个老鼠为每个组。 和 显示的比较。(c)数据显示超声心动图测量小鼠治疗如上所述。静脉注射:心室壁厚;LVEDD:室舒张维度;LVESD:左室收缩末期维度。数据均值±SEM从三个老鼠为每个组。 和 显示的比较。

因此我们随后确定fenofibrate-mediated促进HMGB1离原子核易位细胞质在心脏肥大的发展过程中发挥作用。心脏功能在4周后评估了TAC或虚假的操作检查胎儿心脏基因的mRNA的表达。如图4 (b)、ANP、BNP, mhc显著调节TAC组与虚假手术组相比,这upregulation明显减毒当老鼠用非诺贝特治疗手术后。此外,收缩功能障碍和TAC减弱了非诺贝特治疗后左室扩张(图4 (c))。这些发现表明,非诺贝特抑制心脏肥大和调节HMGB1易位;因此,我们假设fenofibrate-mediated HMGB1本地化的监管也可能发挥作用在抑制心肌肥厚的发展。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们发现PPAR的激活 非诺贝特会使HMGB1在心肌细胞和调节定位在细胞核和细胞质之间。这些影响的非诺贝特也可能发挥作用在心脏肥大的发展。据我们所知,这是第一次研究证明非诺贝特防止心脏肥大发展通过抑制核HMGB1表达。

到目前为止,几种方法被用来HMGB1目标,包括使用anti-HMGB1抗体,多肽拮抗剂,可溶性受体,抑制分子丙酮酸乙酯和thrombomodulin等(6,20.,21]。在目前的研究中,我们发现PPAR的激活 由非诺贝特也有效地抑制HMGB1表达心肌细胞在基底和LPS-enhanced水平。到目前为止,还没有研究解决PPAR的角色 在调节HMGB1表达。然而,最近的一份报告表明,PPAR 端依赖抑制HMGB1可能发挥作用在抑制炎症反应在缺血后损伤(22]。此外,先前的调查还显示,PPAR 受体激动剂troglitazone抑制HMGB1表达内皮细胞(19]。因为PPAR的生理功能 和PPAR 在许多疾病交叉,非诺贝特是一个合乎逻辑的候选人来阻止LPS-induced炎症通过抑制HMGB1表达。

除了发现非诺贝特抑制HMGB1的表达,我们还发现非诺贝特可能调节HMGB1定位在细胞核和细胞质。先前的研究已经报道,转译后的修改赖氨酸残基的乙酰化培养细胞修改绑定HMGB1的DNA和HMGB1的核外定位23,24]。Hyperacetylation HMGB1诱导的脂多糖和过氧化氢引发易位到细胞质(24- - - - - -26]。最近的一份报告也显示,在心肌细胞,随后ET-1 AngII提升HMGB1乙酰化作用和抑制心脏肥大的发展(2]。在这项研究中,我们证明了非诺贝特维护核HMGB1的水平,可能影响HMGB1的乙酰化和磷酸化。但是,应该提供更多的证据来确定分子机制HMGB1定位在fenofibrate-induced PPAR 激活。

几种细胞,rodent-based研究已经证明了PPAR 端依赖上下文中的心脏保护心脏肥大。非诺贝特被发现抑制endothelin-induced Akt和糖原合成酶激酶3 - 磷酸化,从而抑制心肌细胞肥大的发展(27]。核易位prohypertrophic factor-nuclear转录因子激活T细胞(NFAT)已经被证明是被非诺贝特(12,27]。然而,这些结果并不能完全解释这种机制的作用在心脏肥大,非诺贝特和这个过程需要更多的证据。我们表明,PPAR的便利化 表达式由非诺贝特伴随着HMGB1表达减少。此外,我们发现核的HMGB1含量降低了小鼠心脏肥大和非诺贝特治疗逆转这种减少和抑制这种疾病的发展。之前的研究表明,核HMGB1可能发挥作用在预防大脑的DNA损伤和神经元(28,29日]。最近的实验Funayama et al。2维持核心HMGB1]表明,水平可能防止心肌细胞DNA损伤,从而减少心脏肥大的严重程度。综上所述,这些研究结果进一步支持我们的假设,激活PPAR的非诺贝特可能防止心脏肥大的发展,调制HMGB1表达和本地化。

这项研究有一些局限性。在目前的研究中,我们表明,upregulation核非诺贝特HMGB1的TAC手术后心肌细胞和心脏防止心脏功能障碍;然而,我们没有发现之间的直接联系核HMGB1含量增加,心脏肥大在活的有机体内。确认这种关系,可能需要评估心脏功能在心脏HMGB1基因敲除小鼠在未来的研究。然而,我们证明了非诺贝特可以防止心脏肥大的发展,调制HMGB1表达和本地化,也提供了一个新颖的方法来调查心脏肥大的发病机理。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Zhankui贾庆林和鲁伊·雪同样对本文亦有贡献。

确认

本研究支持由中国自然科学基金会(U1304804)和青年创新基金的郑州大学第一附属医院。