文摘

核受体PPARγ脂肪形成的主要监管机构,改变它的功能与代谢综合征相关的不同的病理过程。我们最近发现两个PPARG记录的编码- PPAR占统治地位γ亚型。不同的存在PPARG变异表明,可变剪接调节PPAR至关重要γ潜在功能,低估了一些方面的监管。在这里,我们调查PPARG表达在不同的组织和细胞在代谢综合征的影响,特别是在人类间充质干细胞的脂肪细胞的分化。我们定义了transcript-specific表达模式PPARG变体编码规范和占主导地位的消极的亚型,发现了一个小说PPARG成绩单,γ1 orf4。我们的分析表明,在脂肪生成过程中,转录的替代PPARG变异是有时限的调控是通过微分使用不同的启动子。此外,我们的分析描述第一——微分三ORF4变异的贡献这一过程,表明仍然未知的作用这些显性负亚型在脂肪生成。因此,我们的研究结果强调的至关重要的方面PPARG规定,建议需要进一步调查排除所有的不同影响PPARG成绩单在生理和病理条件下,如代谢相关疾病。

1。介绍

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs,也被称为核受体家族1 c, NR1C)是ligand-dependent属于核激素受体的转录因子超家族。三个成员的PPAR PPAR出名,PPAR/,PPAR由不同的基因位于不同的染色体编码已确定(1- - - - - -3]。

毫无疑问,PPAR是最广泛研究和特征PPARs成员,鉴于其参与生理几个州,以及病理条件。事实上,它调节多个基因的表达在葡萄糖发挥核心作用,脂质和胆固醇代谢、炎症、血管生成、增殖和分化4- - - - - -7]。特别是,PPAR脂肪形成的是主监管机构,因为它的转录调节细胞分化和脂质积累的基因数量(8,9]。PPAR缺陷信号改变表达式和/或激活,以及多态性/突变,是涉及不同病理条件下发生代谢综合征,如胰岛素抵抗、肥胖(10)、血脂异常和高血压,显著增加2型糖尿病的风险(11- - - - - -13),以及心血管疾病和癌症3,4,14- - - - - -17]。

代谢综合征的患病率增加比例和流行,迄今为止,还没有建立足够的治疗。的临床利益,PPAR的合成配体,属于一类thiazolidinediones噻唑烷二酮类),如troglitazone、罗格列酮、吡格列酮,作为胰岛素增敏剂,用于治疗2型糖尿病患者的高血糖(7,18- - - - - -20.]。然而,他们在2型糖尿病治疗上的应用受到了一定的限制,弯曲的影响。因此,PPAR的更好的理解信号是至关重要的制定更有效的和有针对性的治疗代谢综合征及其并发症治疗策略。

然而,完全定义PPAR的景观活动,需要考虑一些相关的方面。最相关的一个特性的能力PPARG基因产生不同的成绩单。事实上,人类PPARG由9个外显子基因开始差动启动子的使用和替代splicing-generates至少四个主要拼接变异(即。,PPARG2 PPARG1 PPARG3, PPARG4)。这些记录显示不同的5′非翻译区(utr),其次是6个外显子编码。然而,尽管存在这些数量可变的PPARG成绩单,这个基因编码只有两个蛋白亚型。事实上,PPARG1 PPARG3, PPAR PPARG4编码相同的蛋白质1-localized在脂肪组织、肝脏、心脏和骨骼muscle-whereas PPARG2收益率有28个额外的蛋白质氨基酸N -终点站被称为PPAR2,完全本地化的脂肪组织(21- - - - - -23]。

不同的能力为PPAR诱导脂肪生成已被证明1和PPAR2,表明一个更相关的PPAR脂肪形成的活动2。虽然两种亚型在脂肪细胞分化被认为是必不可少的,他们的相对贡献尚未澄清(24- - - - - -27]。

最近,我们组在零星的结直肠癌中确定了两本小说PPARG成绩单窝藏在基因内区通读4,命名2 orf4和3 orf4,显示相同的5′utr PPARG2 PPARG3,分别为(28]。产品缺乏的蛋白质配体结合域(小黑裙)和作为主导向PPAR -。虽然它已被证明ORF4在结直肠癌发病机制中所起的作用,它的存在和表达水平尚未在其他细胞和/或组织调查。

到目前为止,准确表达模式的分析PPARG成绩单是失踪。例如,我们所知,这种考虑适用特别脂肪形成,PPAR是主要的驱动程序(4,7,29日]。改变脂肪细胞的分化是严格与肥胖和代谢相关疾病相关,因此密切相关的生理病理学代谢综合征(30.,31日]。详细描述了目前所有已知的相对贡献PPARG成绩单和其主要负面isoforms-in脂肪形成,以及在组织和细胞在代谢综合征相关流程改变,将提供一个坚实的基础,以排除,如果如何,他们可能占代谢相关的疾病。

在这里,我们描述了一个完整的表达分析的注释PPARGtranscripts-PPARG1、PPARG2 PPARG3, PPARG4-as及其主导负同等型ORF4在人类组织和细胞代谢综合症的影响。特别是,我们关注他们的微分表达式在人类脂肪生成,使用人类间充质干细胞(hMSCs)隔绝的间质血管分数脂肪组织(32]。后在体外hMSCs在脂肪细胞的分化,通过使用transcript-specific rt - PCR和定量实时PCR检测,我们测量的表达PPARG记录在不同时间点从脂肪细胞分化的诱导,展示每个替代的微分贡献拼接变体。类似的模式总PPAR的表达式也观察到和ORF的蛋白质。此外,在这里,我们描述,第一次,一个新颖的记录PPARG,名叫1 orf4,类似于占主导地位的消极2 orf4和3 orf4之前确定(28]。最后,我们评估了大量的所有ORF4变体在脂肪细胞的分化,也suggesting-for——这些显性阴性亚型参与第一个人类脂肪形成。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

媒体、血清和抗生素对细胞培养来自Lonza(瑞士巴塞尔)。293年人类胚胎肾细胞(HEK239)在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,2更易/ L谷氨酰胺,100单位/毫升青霉素、链霉素和100单位/毫升。

人类间充质干细胞(hMSCs)通过腹部活检和文化建立如前所述[33]。这些细胞被种植在DMEM-F12(1: 1)与10%的边后卫,2更易/ L谷氨酰胺,青霉素100单位/毫升,100单位/毫升链霉素。文化是保持在湿润的气氛中95%的空气和5%的公司₂在37°C。

2.1.1。脂肪细胞的分化

脂肪细胞的分化是实现如前所述34]。简单地说,hMSCs被播种(10000细胞/厘米²直到融合)和培养six-well板块。脂肪细胞的分化是诱导分化鸡尾酒由850 nmol / L胰岛素,10μ0.5 mol / L地塞米松,更易与L IBMX (isobutylmethylxanthine) 10μmol / L吡格列酮,33μmol / L生物素,17岁μ在DMEM-F12 mol / L泛酸盐(1:1)补充3%的边后卫,2更易/ L谷氨酰胺,抗生素。3天后,媒介改变了在DMEM-F12中只包含胰岛素和吡格列酮(1:1)与10%的边后卫,补充谷氨酰胺和抗生素。培养基是改变每2天8天获得完整的hMSCs脂肪细胞的分化。脂质积累是由油红O染色•艾萨克森和同事所描述的(34]。脂肪细胞的分化从hMSCs一式三份。

2.2。RNA提取和rt - pcr检测

总RNA为HEK239孤立,hMSCs在脂肪细胞分化的不同阶段,使用试剂盒解决方案(英杰公司)根据制造商的指示。RNA提取其他人体组织、心脏、肝、和甲状腺细胞,人类结肠癌癌,内皮祖细胞(epc),巨噬细胞,和乳腺癌MCF7,工作在我们的分析中,获得了在先前的研究28,33,35,36]。对于每一个样本,总RNA (1000 ng)是反向转录使用“高容量cDNA逆转录工具包”(应用生物系统公司,培育城市,CA)。互补获得人体组织和细胞被用作rt - pcr检测模板。与特定的引物PCR扩增pairs-designed使用益生元4.0和表中列出1——使用1执行μL的逆转录反应模板的PCR反应建立AmpliTaq黄金(珀金埃尔默)。PCR分析使用这些放大条件执行:95°C 10分钟,其次是35周期在95°C 40秒,60°C 40秒,30秒72°C, 70°C 7分钟。rt - pcr产品预期的长度(见表1)。在每个实验中,样品没有逆转录酶作为消极的控制,这是放大在相同条件下reverse-transcribed RNA。

2.3。克隆和测序

多重PCR产品(约211和137个基点,职责),获得在PPARG1 / PPARG4 rt - PCR检测,已克隆到威尼斯平底渔船向量II(英杰公司)根据制造商的指示。桑格克隆和其他rt - pcr产物直接测序的方法,证实了反应的特异性。

2.4。实时聚合酶链反应

定量实时pcr进行cDNA hMSCs样本和未分化在脂肪细胞分化的不同阶段(6小时、12小时、24小时,2天,4天,7天,10天之后感应的过程)。放大反应混合包含1 x SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司),每个引物160海里,50 ng的互补脱氧核糖核酸(RNA等效)作为模板。定量实时PCR检测进行7900年根据制造商的说明ht实时PCR系统(应用生物系统公司)中描述的相同条件下(37]。每个试验分析了5记录了三个生物复制所有的时间点。对于每一个细胞复制,在两个重复的井进行了实时分析。相对基因表达是通过使用来衡量的方法。对于每一个分析,表达水平正常化的参考价值(时间点0小时或6小时)使用3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为看家基因。存在数据报告为平均值和标准偏差的三个生物复制和结果分析了成对的学生测试。价值被认为是具有统计学意义。

2.5。免疫印迹法

总细胞溶解产物分离,得到钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)如前所述38]。短暂,hMSCs无差别,在脂肪细胞分化的不同阶段(2和10天)可溶性2小时在4°C溶解缓冲区包含50 mM玫瑰,150毫米氯化钠,EDTA 10毫米,10毫米Na₄P₂O₇氟化钠,原钒酸钠2毫米,50毫米,1毫米phenyl-methyl-sulfonyl氟化物,10μ10 g / mL抑肽酶μg / mL亮抑酶肽,pH值7.4,1% (v / v)特里同x - 100(所有试剂裂解缓冲来自Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。溶菌产物被澄清在12000转离心20分钟在4°C。蛋白质是由sds - page分离(Bio-Rad大力神、钙、美国),涂抹在Immobilon-P膜(微孔、Billerica MA)。膜是孵化与多克隆抗体针对PPAR的n端结构域γ(美国圣克鲁斯生物技术,CA)和antiactin抗体(圣克鲁斯生物技术、钙、美国)。涂抹蛋白质是由增强化学发光检测(ECL, Amersham生物科学、阿灵顿高地,美国)根据制造商的指示。光密度分析使用图像实验室软件(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。为每个蛋白质同种型(PPARγ和γORF4),数据显示为像素密度比和控制蛋白(肌动蛋白)。

3所示。结果

3.1。表达谱的PPARG成绩单

四个主要PPARG记录目前已知,被哥et al。3]。此外,我们组最近确定了两个亚型代理向PPAR asdominant负面(28),相同的启动子的转录PPARG2 PPARG3成绩单,分别(细节图1)。

使用特定的引物对(表1),我们进行了大量的表达分析PPARG1 PPARG2, PPARG3, PPARG4, ORF4相关组织和细胞代谢并发症syndrome-such改变葡萄糖和脂类的代谢(肝脏),增加炎症反应(巨噬细胞),动脉粥样硬化(epc、心脏和巨噬细胞),癌症(结肠癌癌和MCF7)和甲状腺功能障碍(甲状腺)——在一个广泛使用的细胞模型中,HEK293 [3,6,17,39,40]。高相似性5′utr PPARG1 PPARG4记录,使用的引物分析PPARG4放大两种变体(区分PCR产品不同的大小),而我们可以设计PPARG1特定的引物。

组织表达的模式PPARG替代变量,包括也记录编码相同的蛋白质(PPARG1、PPARG3和PPARG4),如图2。这样的分析显示,PPARG1成绩单是所有分析组织和细胞系中表达,确认它是在人体组织中表达的丰富,几乎无所不在地21]。同样,PPARG4-which从相同的启动子转录表达在几乎所有的分析样本,尽管比PPARG1在较低水平。因此,我们表明,在大多数的研究样本,PPARG1和PPARG4有助于PPAR的翻译1蛋白质,而PPARG3表达只在内皮祖细胞和心脏在低水平。值得注意的,还在epc PPARG2转录表达,以及心脏,而其表达式是探测不到在其他研究组织和细胞系。这可能会相关的抗炎作用核受体在心血管系统(41- - - - - -43)表明,PPAR2主要表达在这些成年组织。令人惊讶的是,占主导地位的消极的同种型ORF4,直到现在与肿瘤发病机制有关,是所有分析组织和细胞系中表达,暗示不微不足道的贡献PPARG活动也在其他细胞生理和病理过程。值得注意的是,结果如图2指ORF4成绩单总表达式。

3.2。的表达PPARG变异在脂肪生成

后在体外hMSCs向脂肪形成的诱导分化(见方法),我们选择了七个不同的时间点(图3)。特别是,我们调查了脂肪细胞分化的早期阶段(6、12和24小时后感应),中间时间点(2天),和“晚期”(4和7天)根据可见细胞形态学和端点的变化在细胞分化成脂肪细胞(图10天3)。

rt - pcr分析表明,首先,总数PPARG表达式(即。,of the entire pool of canonicalPPARG在整个过程中记录)非常高。详细使用variant-specific底漆我们观察到PPARG成绩单在变量-检查expressed-albeit分化阶段(图4(一))。有趣的是,在hMSCs PPARG2不是表达,而表达非常高诱导后的早期阶段向脂肪细胞分化。特别是,如图4(一)2天后,这个记录达到最高表达的诱导和是完全沉默的过程。同样,PPARG3温和但检测到表达只在中间和晚期的细胞的分化,其最高表现在2天。这一分析显示,PPARG1和PPARG4是唯一规范记录导致PPAR的最终表达蛋白质在未分化hMSCs,因此这些细胞只表达PPAR1同种型。特别是PPARG1表示在水平远高于PPARG4变体,鉴于缺乏PPARG3剪接变体,它可以被视为功能性PPAR的合成的主要贡献者在未分化细胞(图1蛋白质4(一))。

然而,PPARG1 PPARG4表达也在脂肪细胞的分化,尽管前者是最表达PPARG记录所有的阶段。

3.2.1之上。的识别1 orf4和分析PPARG占主导地位的消极的成绩单

给出的两个不同亚型的存在PPAR ORF4,以前称为显性负γ(28),我们被问及其他ORF4变异可能从上游启动子的转录_1.1外显子的PPARG基因。因此,使用特定的引物对(表中描述1),我们能够识别在hMSCs小说ORF4变体,命名加入1 orf4(数量仍在过程;参见图1详情)。同样PPARG1, 5′UTR由_1.1和一个₂外显子,而从外显子编码区扩展1到4,通读的基因内区,与其他ORF4成绩单(结构细节图1)。

鉴于hMSCs发现这样的新记录,我们决定调查的整个池的表达ORF4变体(ORF4t图4 (b)期间)在体外脂肪形成。值得注意的是,rt - pcr分析显示,这些变异表达以及脂肪细胞的分化,尤其是在这个过程的关键阶段(24小时,2和4天)。随后三ORF4成绩单显示,独立的分析3 orf4变体表达整个过程,而2 orf4 mRNA经历大幅增加2天从分化的诱导。值得注意的,这部小说变体1 orf4-identified无差别hMSCs-is表示变量水平在脂肪生成,在某个阶段(图虽然察觉4 (b))。

3.3。定量分析的规范化和占主导地位的消极PPARG剪接变体在脂肪生成

有一个定量的估计PPARG成绩单后诱导的脂肪形成的过程中,我们进行定量实时分析与特定的引物对在上述时间点。这种定量分析证实rt - pcr检测的结果,显示全部的表达PPARG增加了2天脂肪形成归纳。的确,在这个阶段,PPARG表达式是约20倍增加而未分化细胞和线性减7天后,达到表达水平与未分化细胞(图5(一个))。

然而,最相关的结果来自规范化transcript-specific分析。事实上,它显示所有PPARG表达规范化记录有一个类似的趋势但表现出不同的折叠过程中增加(图S1看到网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/537865)。PPARG2和PPARG3表达式值6小时被用作基线,因为它们不会在未分化hMSCs(图表示5(一个))。然而,尽管他们的表达水平较低,这些记录大大高于PPARG1表现出增加的表达式。事实上,在2天的分化的诱导,PPARG2的表达和PPARG3提高约110,45-fold分别而PPARG1增加(图约10倍5(一个))。

定量研究ORF4成绩单、区别对待不同的变体的唯一方法是通过分析大型PCR扩增子(约900 - 1000个基点,图4 (b)),不存在。因此,ORF4定量数据,如图5(一个),请参阅ORF4成绩单。特别是,我们观察到,对于这些变体,不同的表达趋势相比,在整个过程中PPARG规范记录,确认rt - pcr检测(图4 (b))。事实上,ORF4总表达显著下调分化的早期阶段,在2天达到最高价值观。尽管如此,它的增长是远远低于规范化记录(褶皱增加= 4;图5(一个))。

最后,两两比较褶皱的变化的变化,在两个随后的时间点,显示最重要的增加发生在表达式的值从第一天到第二天在诱导脂肪细胞的分化(图S1)。值得注意的是,最引人注目的增加已经观察到PPARG2和PPARG3变体(约90和40倍,职责),暗示诱导启动子在这个过程的性质。相反,高度明显降低观察这两个接头variants-immediately后第二天的感应过程。一个共同的行为观察PPARG1和ORF4记录。特别是,这些变体进行温和的表情变化之间的过渡阶段,显示一个相当恒定的基础表达整个脂肪形成的过程(图5(一个)和S1)。因为最明显的变化PPARG记录的大量被分化诱导发现2天后,我们调查了蛋白质含量在三个时间点,一天0(未分化细胞),第二天(即。的最高峰PPARG表达式),第十天(即。分化细胞)。没有商用ORF4蛋白抗体存在,我们使用多克隆抗体针对n端结构域,能够识别规范化和最短的PPARG亚型。我们发现规范PPAR在67 kDa和免疫反应性的乐队在40 kDa, ORF4蛋白质的预测重量同种型。正如所料,与mRNA水平变化一致,2天后分化诱导,PPAR的表达式——最短的isoforms-were高于完全未分化和分化细胞(图5 (b))。

4所示。结论

流行病学研究表明,代谢综合征的发病率正在增加在西方国家和发展中国家,和迄今为止一个适当的治疗还没有建立(17,44]。

毫无疑问,PPARG是研究最多的基因占代谢紊乱。事实上,它调节多个基因的表达与葡萄糖的关键作用,脂质和胆固醇代谢,胰岛素信号,发病的生产的不平衡会导致胰岛素抵抗、肥胖、2型糖尿病和心血管疾病3,4,7,14]。PPAR也是一个药物的目标,目前,其合成配体用于治疗高脂血症和insulin-sensitizing抗糖尿病的药物(18]。因此,定义PPARG活动相关的组织和细胞能量代谢可能提供有用的见解来开发新的有效的治疗策略治疗代谢综合征及其并发症。

目前已知的人类,通过不同的推广使用和替代接合PPARG基因生成多个变体编码两种蛋白质,PPAR1和PPAR2。因为不同的PPARG蛋白质剪接变体编码相同的同种型,他们的微分表达式,这两个空间和时间,可能反映了不同的规定,翻译,信使rna稳定,和/或本地化。复杂的图片,最近的识别γORF4 isoform-able作为显性负和肿瘤发生的影响(28)表明,PPARγ活动是通过transcript-specific调制的监管。

因此,我们的努力已经进行调查PPARG表达在不同组织和影响在代谢综合症和hMSCs脂肪细胞的分化。除了关注规范PPARG成绩单,特别强调了对定义的表达式模式变体编码占主导地位的消极的亚型。在我们的研究中我们发现1 orf4,一部小说PPARG记录,类似于前面所描述的2 orf4和3 orf4 [28),可以作为主导向PPAR -γ。

我们的表达分析表明不同的倡导者PPARG有一个特殊的转录活动。这样的发现是特别相关的脂肪细胞的分化,PPAR是一个关键的球员(4,9,29日]。几乎无处不在的PPARG1 / PPARG4表达,特别是在脂肪生成,显示更明显活动的发起人和其他人相比,表明这是PPAR的主要贡献者γ蛋白质合成。此外,PPARG1在脂肪细胞分化的温和表情变化加强假设其发起人提供本构的水平PPARG信使。相反,组织和stage-specific PPARG2表达式,以及它的戏剧性的变化在整个脂肪形成,清楚地展示其诱导自然。

有趣的是,几乎无处不在的表情ORF4变体在组织和细胞中,以及在脂肪生成,支持的假设PPARG通过显性阴性亚型调节本身。此外,我们的研究结果表明,类似PPARG规范记录,三个ORF4变异给PPAR不同的贡献活动。的确,而1 orf4和2 orf4展览stage-specific表达式,3 orf4不断表达以及脂肪细胞的分化而不是成熟的脂肪细胞。这些发现,严格与那些关于规范化亚型,表明(1)启动子上游外显子B是诱导规范化和ORF4变体,(2)本构的水平PPARG变异、编码占主导地位的消极的亚型,提供在分化的启动子上游非编码外显子_1.2,(3)几乎全部转录γ3 orf4而非规范化PPARG3。因此,这些证据表明如果不是exclusive-role启动子3 - PPAR orf4和PPARG3变体监管。此外,蛋白质分析证实,通过分化诱导PPAR 2天后蛋白高表达而未分化和完全分化的细胞。此外,我们观察到同样的趋势较短的蛋白质的表达也40 kDa,相应的预测重量ORF4同种型。

尽管这里描述的结果只是一个起点,理解的影响PPARG记录在人类脂肪形成,他们支持了这样的观点,即这generegulates关键过程平衡的水平不同的剪接变体。进一步的研究——特别是考虑到PPARG蛋白产品是绝对严格要求建立所有剪接变体在脂肪细胞分化的作用。值得注意的是,我们的研究结果揭示了以前低估了的方面PPARG监管和提出但未开拓的作用占主导地位的消极亚型在脂肪生成。事实上,寻找,在一个至关重要的过程PPARG是一个“主基因”——转录和蛋白质编码占主导地位的消极的亚型是既定的表达和/或可调制与规范PPARG变异,执行需要调查向这个方向。了解更多关于PPARG脂肪形成的过程直接相关的活动的可能贡献代谢相关疾病的发病和进展,包括代谢综合征及其并发症。

最后,我们不能排除,记录编码的存在PPARG显性负其他人体组织中的蛋白质在生理过程可能会造成他们的有趣的角色以及在其他病理条件。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

m . Aprile和m . r .(同样这项工作。

确认

作者感谢旗舰“InterOmics”项目(PB.P05) a . Ciccodicola资助和支持的意大利MIUR CNR组织和意大利教育部大学和研究(MIUR)项目国家作战计划”研究和竞争力”2007 - 2013 PON01 02460 a . Ciccodicola p Formisano和f . Beguinot。金融支持通过项目ORTO11TSM3 f . Beguinot和FIRB项目RBNE08NKH7(绩效计划)f . Beguinot和p . Formisano感激地承认。m . Aprile博士生在分子和细胞生物技术在环境科学与技术、生物和制药那不勒斯第二大学“DISTABiF”。m . r .(博士生在分子肿瘤学和内分泌学的转化医学科学,那不勒斯大学“费德里科•二世”。

补充材料