文摘

蛋白质转译后的修改(天车)对各种细胞过程至关重要。然而,很少有研究天车在特定蛋白质通过公正的方法。在这里,我们报告试图识别天车在过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ)蛋白用我们之前建立了多功能天车分析系统。在这项研究中,我们确定了几天车PPAR在体内表达γ2蛋白质从293 t细胞以及内生PPARγ1从Caco-2结肠癌细胞株蛋白质。确定了多功能天车包括丝氨酸的磷酸化PPAR的112年和81年丝氨酸γ2和PPARγ1,分别,这两个是众所周知的增殖蛋白激酶- (MAP激酶)介导的PPAR天车γ蛋白质,从而确认我们的实验方法。此外,未知的天车也确认,证明该方法可以应用于在PPAR找到未知天车γ蛋白质和其他蛋白质包括核受体。

1。介绍

过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγligand-dependent核受体和NR1C3),最初是建立在脂肪细胞分化的主要监管机构(1,2]。PPARγ是由天然配体激活的,多不饱和脂肪酸和类花生酸等,在脂肪细胞分化中起着主导作用,调节代谢和炎症免疫细胞,具有强烈的抗生长性能。尽管PPARγ水平最高的脂肪细胞,大量的水平还发现在某些其他类型的细胞,如结肠上皮和上皮细胞的乳腺癌和前列腺癌。

的PPARγ基因编码两个主要拼接亚型:PPARγ1和PPARγ2。PPARγ1表示在许多组织和器官,包括胃、小肠和大肠,而PPARγ2表达特别是在脂肪细胞(1,2]。每个PPARγ蛋白结合的异质二聚体类维生素a X受体(RXR)识别网站叫做PPRE, TGACCTxTGACCT序列。在绑定到DNA, PPARγ新兵转录辅活化因子如类固醇受体共激活剂1 (SRC1)和积极调节靶基因的表达3,4]。尽管潜在的分子机制尚不清楚,PPARγ介导transrepression炎性基因也被描述(5]。

PPARγ也经历了几天车反应发病如生长因子和外源信号,导致其功能的调制(6]。例如,增殖蛋白激酶(MAP激酶)使磷酸化PPAR的氨基端AF-1域γ(人类PPAR丝氨酸84年或112年γ1或PPARγ2、职责),这天车抑制ligand-dependent PPARγ(转录活动7- - - - - -11]。此外,PPARγ同时也经历了SUMOylation c端配体结合域ligand-dependent方式(精神的小黑裙)。SUMOylated PPARγ结合NCoR辅阻遏物等复杂从而transrepresses炎症基因伊诺基因在巨噬细胞(12]。

在基因组时代,它变得明显,多样性的生物现象无法解释仅由许多不同的基因。蛋白质翻译后修饰(天车)是最有效的生物信号的扩大遗传密码中起重要作用,不同的细胞过程,如蛋白质运输、DNA修复、基因转录(13- - - - - -15]。我们之前已经开发出了一个全面的多功能天车蛋白质分析系统,结合生物化学和蛋白质组学方法(16]。在这个系统中,我们利用非限制性的序列比对铝电解分析和该方法能识别天车未经规范,使天车的公正的分析(17,18]。

最近的调查结果表明,表观遗传的功能监管机构,包括PPARγ,控制天车的细胞信号和营养(6,19]。在这里,我们在PPAR不受限制的综合分析应用于铝电解γ并从过表达PPAR发现铝的一个子集γ2从293 t细胞和内生PPARγ1从Caco-2结肠癌细胞蛋白质。

2。材料和方法

2.1。质粒、抗体、试剂

长篇PPAR的表达质粒γ2 cDNA从cDNA克隆文库的人类脂肪细胞(20.)和插入pcDNA3向量(生活技术,卡尔斯巴德,CA)国旗标签序列。Anti-PPARγ抗体(# sc - 7273)是购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。Troglitazone(σ,圣路易斯,密苏里州)溶解在DMSO溶液。

2.2。细胞培养和转染

293 t和Caco-2杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM) + 10%胎牛血清和抗生素的边后卫。THP-1细胞培养在RPMI + 10%的边后卫和抗生素。转染的FLAG-PPARγ2到293 t细胞在10厘米的菜肴,我们使用Lipofectamine 2000(生命技术)根据制造商的指示和孵化24小时的细胞。

2.3。净化的PPARγ蛋白质和免疫沉淀反应

净化的PPARγ如前所述(执行蛋白质16]。简单地说,我们交联2μ30 g的抗体μL蛋白G Dynabeads(表达载体)新鲜溶解20毫米pimelimidate二甲酯(DMP) 0.2米三乙醇胺缓冲区(pH值8.2)。交联反应在室温下进行1 h。反应停在更换缓冲了50 mM Tris-HCl (pH值7.5)。

细胞溶解产物与FLAG-PPAR转染293 tγ2和Caco-2细胞(从10厘米菜和48个盘子,resp)。用1% NP-40缓冲区(10毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值7.8)液,1毫米EDTA, 150毫米氯化钠,和1% NP-40)。溶菌产物受到免疫沉淀反应蛋白G Dynabeads耦合到每个抗体3 h。免疫沉淀反应是冲1% NP-40缓冲和筛选了0.1 glycine-HCl缓冲区(pH值2)。洗出液煮了Laemmli样品缓冲,然后被钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和胶体蓝色(技术)、银染色(银的追求,生活技术),或与表示抗体免疫印迹。

2.4。质谱分析

PPAR的质谱(MS)分析γ蛋白质和天车进行分析(如前所述)(16]。简单地说,PPARγ蛋白质凝胶的切除,减少与10毫米二硫苏糖醇溶液在0.1碳酸氢铵60分钟56°C,烷基化55毫米0.1碳酸氢铵在黑暗中碘乙酰胺溶液在室温下45分钟,并与25 ng /凝固态消化μL胰蛋白酶黄金(Promega,麦迪逊,WI)在50 mM碳酸氢铵16 h 37°C。消化肽提取,取而代之的是0.1%的甲酸2%乙腈(ACN),并受分析电喷雾电离(ESI), MS / MS使用LTQ velos Orbitrap与要领(热费希尔科学)。nano-LC采用的是迪娜系统(KYA科技公司,东京,日本)配有C-18 ESI毛细管柱(100μm×150毫米,NIKKYO科技,日本东京)。梯度包括(A) 0.1%的甲酸2% ACN和(B) 0.1%的甲酸80% ACN: 0 - 100% B从0到110分钟,100% B从111年到115分钟,0% B从116年到120分钟。流量是300 nL /分钟从0到120分钟。女士从一系列光谱被记录下来米/z350 - 1500在100000决议,紧随其后的是视collision-induced离解(CID) MS / MS谱和电子转移离解(等)20 MS / MS光谱产生的前体离子强度最高。离子喷嘴和之间的电压转移管被设置为1800 V。肽+ 2或更大的电荷被选为MS / MS实验。

2.5。计算分析蛋白质识别和天车的分析

蛋白质鉴定和天车PPAR的分析γ蛋白质进行如前所述[16]。简单地说,对蛋白质识别、光谱处理使用蛋白质组发现者版本。1.3(热费希尔科学)与SEQUEST受到错误发现率5%的截止(罗斯福)。人类蛋白质NCBI数据库使用10 ppm质量准确性截止为父母的女士和英尺0.8 MS / MS和Da对离子阱MS / MS谱截止。Carbamidomethylation(半胱氨酸)被设置为一个固定的修改和氧化(蛋氨酸)被设置为一个变量修改。

对天车识别、光谱处理使用MODIRO版本。1.1 (Protagen,波鸿,德国)软件对人类PPAR FASTA格式γ1,人类PPARγ2氨基酸序列。搜索参数设置如下:两个最大失踪乳沟网站,15 ppm肽的肽质量宽容宽容,1.5 Da片段质量公差(离子阱MS / MS), 15 ppm片段质量公差(英尺MS / MS),和修改的第1 carbamidomethyl(半胱氨酸)。在所有确认铝,铝可能发生在样品准备工作如谷氨酸(甲基化21从列表中)被排除在外。

3所示。结果

3.1。净化的外生PPARγ2从293 t和内源性PPARγ1从Caco-2细胞

PPAR天车的综合分析γ蛋白质,我们执行PPAR的亲和纯化γ蛋白质从293 t细胞和Caco-2结肠癌细胞,这是表达外源FLAG-tagged PPARγ2和内源性PPARγ1蛋白,分别使用方案如图1(一)。1% NP-40可溶性部分细胞溶解产物从293 t和Caco-2细胞没有PPAR准备γ配体准备与G蛋白和孵化Dynabeads anti-PPAR交联γ抗体。纯化protein-antibody复合物与裂解缓冲洗,然后从抗体筛选了通过添加酸性glycine-HCl缓冲区;洗出液然后进行sds - page和可视化银染色。如图1 (b),我们成功地检测到外源FLAG-PPARγ2 anti-PPARγ亲和纯化洗出液在预期的分子大小。我们还发现内生PPARγ1在anti-PPAR蛋白质γ亲和纯化从Caco-2洗出液。THP-1人类单核细胞被用作PPAR的指标γ1分子大小(22]。浓缩的FLAG-PPARγ2和内源性PPARγ1蛋白质也证实了使用anti-PPAR西方墨点法γ特定的抗体(图1 (c))。

3.2。PPAR的识别γ蛋白质使用SEQUEST算法

的纯化FLAG-PPARγ2从293 t细胞和PPARγ1蛋白质Caco-2从胶体凝胶中细胞减少,为胶液与胰蛋白酶消化,并受质/女士使用的分析结合collision-induced离解(CID)和电子转移离解(等)激活。前体女士光谱探测到Orbitrap质量分析仪(傅里叶变换(FT)质量分析仪能够测量肽米/z精度高)(< 5 ppm),女士和MS / MS谱检测使用离子阱分析仪(女士Da p < 0.5)。女士第一次分析光谱数据使用SEQUEST算法在蛋白质组发现者版本。1.3和PPARγ蛋白质被确认准确的高分子量(序列覆盖率67.92%,罗斯福PPAR < 5%γ2从293 t细胞,覆盖率49.79%,罗斯福PPAR < 5%γ1从Caco-2细胞),表明成功的蛋白质纯化和PPAR质量测量γ蛋白(数据2(一个),2 (b)和2 (c))。

3.3。非限制性的铝电解净化PPAR的分析γ蛋白质使用MODIRO算法

接下来,光谱数据使用MODIRO搜索算法,使不受限制的所有可能的目标蛋白质的天车的识别。结果,确定了各种多功能天车外生PPAR的活性肽γ2蛋白质从293 t细胞(数字3(一个)和3 (b)),确定了多功能天车的意义提出了分数> 90的数字3 (b)和3 (c)。在列表的顶部,112 PPAR丝氨酸的磷酸化γ2认同意义得分= 100。这个磷酸化站点是PPAR特征明显的一个多功能天车的网站γ2蛋白质,由MAPKs催化和抑制ligand-dependent PPAR的转录功能γ(7- - - - - -11]。这个结果证实了我们的实验方法检测PPAR的天车γ正确的蛋白质。此外,这个多功能天车名单还包括一些铝487苏氨酸残基的甲基化、泛素化等160年赖氨酸,新的PPAR天车γ蛋白质。

进一步证实了这些发现天车,我们又分析了肽质/女士。在这种测量,获取更严格的MS / MS数据,从而更可靠的多功能天车的搜索结果中,我们利用英国《金融时报》对父母的MS和MS / MS谱分析仪。如图3 (d),两三个多功能天车包括S112磷酸化和T487甲基化与SEQUEST再次确定算法,从而确认最初的结果。

接下来,PPARγ1蛋白Caco-2细胞以同样的方式进行分析。如数据所示4(一),4 (b)和4 (c)磷酸化的丝氨酸得分= 100 84被发现意义。此丝氨酸残基对应丝氨酸PPAR的112γ2。我们进一步测试了PPARγ1蛋白质从10μM Troglitazone-treated Caco-2细胞(24小时)。然而,没有其他多功能天车除了S84磷酸化被确定从这个分析(数据未显示)。

4所示。讨论

在这里,我们描述了第一次报告的综合多功能天车PPAR的分析γ蛋白质使用质谱和成功地识别一些以前已知和未知的天车包括丝氨酸磷酸化和苏氨酸甲基化。

在标识的天车、S112的磷酸化和S84 PPARγ2和PPARγ1,分别是著名的PPAR天车γ蛋白质。据报道,磷酸化在PPAR S112γ2是由一个增殖作用催化(地图)激酶,参与镇压脂肪细胞的转录活动(7]。然而,这种修改是否存在PPARγ1蛋白在结肠癌细胞中是难以捉摸的。因此,在这项研究中我们可以确认在PPAR S84磷酸化的存在γ1在结肠癌细胞。虽然在结肠癌S84磷酸化的作用尚不清楚,PPAR的磷酸化模拟突变γ1 (S84D)稍微脱阻抑的PPARγ介导的transrepressionβ连环蛋白使用TOPflash记者系统(23),并进一步描述关于转录功能的影响是必要的(富山庄桂太郎,未发表的结果)。

在目前的研究中,我们还可以识别K160泛素化和PPAR T487甲基化γ蛋白质,虽然有一些关于这些修改的报告。蛋白质泛素化可以针对一些生物学途径蛋白酶体降解和信号转导等根据共轭降解酶的数量和连接类型(24]。因为数量和连接类型的共轭注射从目前的实验,不清楚需要进一步详细分析描述的功能K160 PPAR泛素化γ2蛋白质。至于苏氨酸甲基化,目前还不清楚这是否修改之前发生在样品制备分析或转译后的[女士14]。我们避免了甲醇在我们每一步的实验过程,这样蛋白质没有nonenzymatically甲基化,虽然我们应该注意这一修改。然而,这是一种新型的PPAR的修改γ蛋白质,因此多功能天车的综合分析可以应用于在PPAR找到未知天车γ蛋白质和其他蛋白质包括核受体。

随着识别磷酸化、泛素化和甲基化,PPARγ已知蛋白质也经历了几天车,在其他地区(如磷酸化25,26],SUMOylations [12),O-GlcNAcylations [27),和泛素化28,29日),尽管这些多功能天车并不确定在本研究中。一般来说,作为质量光谱分析可以有效地检测相对高度集中或电离肽(15,17),可以推测,有许多比已确定在PPAR天车γ蛋白质。因为净化PPARγ蛋白质可能是混合物的各种修改,我们推测,进一步净化筛选了蛋白质的等电点分离纯化PPAR等γ与PTM-recognizing抗体蛋白质或浓缩的具体修改,我们可以延长鉴定肽的变化,从而发现更多的PPAR天车γ蛋白质。这些多功能天车控制PPAR新的候选药物的目标γ活动。

5。结论

我们已经确定了几个修改包括磷酸化丝氨酸PPAR的112年和81年γ2和PPARγ1、分别和PPAR苏氨酸甲基化γ2使用我们之前建立了多功能天车分析系统。这种方法可以应用于在PPAR找到未知天车γ蛋白质和其他蛋白质包括核受体。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢女士提供的技术援助祺Izumikawa(东京大学)。这项工作是支持部分通过从教育部重点领域,文化,体育,科学和技术(Atsushi Yokoyama)。