文摘

角膜基质纤维化myofibroblasts和异常细胞外基质(ECM)通常是不恰当的伤口愈合的结果。本研究测试的假设过氧物酶体的配体激活proliferator-activated受体(PPAR)δantifibrosis效应在角膜损伤的大鼠模型。成人Sprague-Dawley老鼠进行了双边phototherapeutic角膜切除术(PTK)。眼睛被随机分为四组:PBS GW501516(选择性的PPAR激动剂δ),GSK3787 (PPAR的选择性拮抗剂δ),或者GW501516结合GSK3787。代理是结膜下注射每周两次,直到牺牲。角膜伤口愈合的细胞方面进行评估与体内共焦成像和尸检组织学。myofibroblast标记(α平滑肌肉肌动蛋白)和ECM生产(纤连蛋白、胶原蛋白和胶原蛋白I型)通过免疫组织化学方法检测和rt - pcr。在伤口愈合的早期阶段,GW501516抑制reepithelialization,促进了血管生成。在伤口愈合的重构阶段,GW501516减毒的激活和增生,可见,这可能是由GSK3787逆转。从可见到myofibroblasts GW501516降低分化转移,ECM合成和角膜阴霾。这些结果说明角膜纤维化和建议PPAR GW501516控制δ可能成为治疗角膜疤痕治疗目标。

1。介绍

角膜疾病是致盲的主要原因之一,在大多数发展中国家1]。角膜创伤,包括表面的上皮细胞的渗透,肾小球膜和基质的前部会导致组织修复,这通常是角膜纤维化的发病(2]。在伤口愈合的过程中,上皮细胞,可见,和炎症细胞释放多种细胞因子刺激上皮再生,激活,可见,招募免疫细胞,和存款细胞外基质(ECM) (3]。通常情况下,激活,可见迁移、增殖和分化为成纤维细胞和α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)阳性myofibroblasts [4]。ECM成分和组织的变化,表现为III型胶原和蛋白聚糖硫酸角质素低组件(5),以及不透明myofibroblasts [4),导致角膜混浊。成功的治疗角膜瘢痕是缺乏。常用的类固醇和丝裂霉素C (MMC)与严重的副作用(6,7)在角膜移植术后并发症的挑战和有限的优质来源。因此,一种新的治疗,既有效又安全的需要作进一步的探讨。

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)是配体依赖性转录因子核受体超家族的成员,包括三个PPAR同形像:PPARα,PPARβ/δ(称为PPARδ在此),PPARγ。绑定的配体诱导PPARs与视黄素X受体二聚化(RXR),然后绑定到特定PPAR-responsive元素(ppr)调节目标基因的表达。PPARδ也可能抑制靶基因的转录通过直接互动与其他转录因子(8]。

PPARs参与的生物学过程,包括脂质代谢、胰岛素敏感性、炎症和细胞增殖和/或分化(9,10]。虽然PPARγ广泛被研究其抗炎和antifibrosis活动在肝脏11)、肾(12)、肺(13,14),和眼睛15),PPAR的潜在功能角色δ近年来出现了只。广泛的工作由独立实验室表明PPARδ抑制细胞增殖在角化细胞16),血管平滑肌细胞(VSMC) [17),肺成纤维细胞(18),和心脏成纤维细胞19,20.]。曝光PPAR的心脏成纤维细胞δ受体激动剂或adenoviral PPAR的过度δ显著降低了αsma的水平,这表明降低心脏myofibroblasts从心脏成纤维细胞分化转移。胶原蛋白合成后也减少了PPAR的激活δ在血管平滑肌细胞(17和心脏成纤维细胞19,20.]。体内,PPARδ受体激动剂治疗可防止肝纤维化(通过减少炎症21]。总的来说,这些发现表明,PPARδ激活可能减弱角膜纤维化。本研究的目的是调查PPAR的角色δ在角膜伤口愈合后激光烧蚀和确定antifibrosis GW501516的影响。

2。材料和方法

2.1。动物和手术

男性成人Sprague-Dawley老鼠(240 - 260 g)下午指定的条件下提高分辨率的使用动物研究。道德的实验进行了天津医科大学动物伦理委员会的批准。

详细分析,精确的伤口(直径4.5毫米,70μ米深度)创建了一个准分子激光消融协议。动物与腹腔内注射10%水合氯醛麻醉剂量为0.3毫升/ 100克体重。一滴0.5%盐酸proparacaine (Alcon-Couvreur, Puurs,比利时)局部使用之前眼睛手术。老鼠受到双边定期phototherapeutic角膜切除术(PTK)通过完整的上皮细胞。执行transepithelial PTK集中在学生与临床193海里准分子激光(Star2 Visx公司,圣克拉拉,CA)由同一医生。

2.2。药物治疗

112眼睛被随机分为四组,每个组成的28个眼睛:(1)laser-ablated眼角膜处理3μL PBS的控制,(2)laser-ablated眼角膜处理3μL GW501516(圣克鲁斯、钙、美国)的浓度为1毫米,(3)laser-ablated眼角膜处理3μL GSK3787(圣克鲁斯、钙、美国)的浓度为1毫米,和(4)laser-ablated眼角膜处理3μL GW501516和GSK3787 1毫米的浓度。液体被强后立刻应用结膜下,每周两次,直到老鼠牺牲。其他手术后的治疗包括局部0.5%左氧氟沙星滴眼液(Santen,大阪,日本)一天四次和氧氟沙星眼药膏晚上(Santen,大阪,日本)。局部抗生素管理了一个星期。非甾体类抗炎药和类固醇。

2.3。眼表面评价和临床结果分析

裂隙灯活组织镜检查,老鼠麻醉如上所述。一个蒙面的观察者评价眼部表面。

领域的角膜上皮缺陷检测与荧光素染色(PBS)无菌溶液荧光素0.1% 0 h, 12 h, 24小时、48小时、72 h, 7天后伤口的一代。所有结果记录与裂隙灯生物显微镜(SL-7F Topcon,东京,日本)配备了数码相机。上皮缺陷的区域所示照片然后用图像分析软件测量Image-Pro另外,剩下的角膜上皮缺损面积(%)计算是基于最初的角膜上皮缺损面积(剩余(角膜上皮缺损区/初始角膜上皮缺损区)×100)评估缺陷(22]。

角膜透明度的水平分级与裂隙灯活组织镜检查一个,两个,三个,四个星期后PTK根据评分标准设定的钟(1990)(23]。角膜透明度是分级如下:年级0,完全清楚角膜没有透明度明显在任何微观裂隙灯检查方法;0.5级,跟踪或微弱的角膜阴霾看到只有间接的,广泛的切向照明;1级,阴霾的最小密度不易直接观察和扩散;二年级,轻微的阴霾容易看到直接焦点缝照明;三年级,温和的不透明部分遮盖虹膜的细节;和4级,严重的不透明度,完全遮住了眼内结构的细节。

角膜新生血管(CNV)的度量化与裂隙灯活组织镜检查瞳孔放大后被拍照的角膜tropicamide 0.5%和0.5%苯肾上腺素混合滴眼液(Santen,大阪,日本)。船的楔形地区增长被计算在照片使用Image-Pro +使用以下公式:,在那里是该地区,缘的时钟数小时参与,最长的长度是异色边缘到前角膜新生血管性椎弓根,然后呢角膜的半径(24]。CNV的度比较组中使用的比例CNV区整个角膜区。

2.4。体内分析角膜角膜共焦显微镜阴霾

老鼠麻醉如上所述的共焦显微镜体内使用海德堡视网膜层析x射线摄影机三世与罗斯托克角膜模块(HRTIII-RCM,海德堡工程公司,德国)根据制造商的指示。短暂,一滴0.2%卡波姆凝胶(博士伦哈德曼博士Chem-Pharm,柏林,德国)被放置在物镜提供沉浸和防止物镜之间的直接接触和角膜表面。向心性是通过使用中央瞳孔区再现性最大化。随后,一系列的图像采集和连续覆盖整个基质厚度设在扫描整个角膜基质在1μm的增量从角膜上皮的基底层开始和结束在角膜内皮。

每个平面的平均像素强度测量使用Image-Pro +(日本Roper、东京、日本)。depth-intensity概要文件从生成扫描通过绘制每个平面的平均像素强度作为角膜深度的函数(如前所述)(25]。总像素强度的测量曲线下的面积计算利息。平均每微米然后测量是基于像素强度总像素强度除以感兴趣的基质的厚度,测量的轴向距离。

2.5。组织固定,切片,苏木精和伊红染色(H & E)

手术后4周,老鼠被牺牲了,眼睛被阐明。获得的眼球固定在10%中性缓冲福尔马林和嵌入在石蜡。中央角膜部分(5μ米厚)是减少眼睛的光轴平行使用自动旋转切片机(徕卡RM 2255年徕卡微系统,曼海姆,德国)和安装在幻灯片(Citotest实验室的器具制造有限公司江苏、中国)。标准吉尔II H & E染色。的数量,可见是手动计算在随机选择5个不重叠的领域(×400)中央角膜显微镜下(奥林巴斯BX50,奥林巴斯、东京、日本)和数码相机(如前所述)(26]。所有H & E染色进行至少三次,以确保结果是一致的。

2.6。组织固定、切片和Immunofluorescent染色

老鼠牺牲了2、3、4周后手术。眼睛被阐明,嵌入在10月液体化合物(美国樱花Finetek托兰斯,CA)。存储在液态氮冷冻组织块直到切片。中央角膜部分(5μ米厚的)眼睛被削减的低温恒温器(徕卡1850厘米,徕卡微系统公司,德国)。部分被放在显微镜载玻片,冻结在−80°C到染色了。在使用时,幻灯片回到室温,风干,沉浸在无水甲醇−20°C 2分钟。幻灯片在PBST然后洗,permeabilized triton-X100 10分钟,0.1%和阻塞2% BSA 30分钟。部分被孵化主要抗体在一夜之间在4°C。主要是山羊peptide-affinity纯化抗体的抗体αsma(1: 100稀释;美国Abgent),鼠标对Col3a1单克隆抗体(1:100稀释;圣克鲁斯、钙、美国),和鼠标与纤连蛋白单克隆抗体(1:100稀释;美国圣克鲁斯,CA)。PBST洗涤后,部分是孵化FITC-labeled兔抗体免疫球蛋白(H + L)(1: 200稀释;美国Earthox)或TRITC-labeled兔子anti-mouse免疫球蛋白(H + L)(1: 200稀释;美国Earthox)在室温下为90分钟。部分被复染色与DAPI(向量实验室Inc .,伯林盖姆、钙、美国)15分钟,安装在缓冲甘油PBST洗涤后(PH = 9.0)。CD11b,部分没有permeabilized和PBS代替PBST。鼠单克隆抗体CD11b (2μ克/μL;美国Abcam)被用作主要的抗体,和TRITC-labeled兔子anti-mouse免疫球蛋白(H + L)(1: 200稀释;美国Earthox)被用作二次抗体。被认为和拍摄的部分使用一个倒置显微镜(eclipse Ti-U尼康倒置显微镜,尼康显微镜,东京,日本)配备了尼康数码相机和NIS-Elements Br显微镜成像软件。所有immunofluorescent染色进行至少三次,以确保结果是一致的。

2.7。rt - pcr

老鼠被杀死手术后4周。眼睛是无核的,角膜和角膜剪刀削减从异色边缘。总RNA提取整个角膜使用试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)评估水平的纤连蛋白,胶原蛋白I型胶原蛋白类型III和αsma。RNA只是从角膜基质中提取,而不是整个角膜评估Ki67抗原的水平。使用标准方法生成的互补。实时PCR反应进行一个96 -实时PCR仪(美国埃普多夫Mastercycler ep realplex)与SYBR预混料Taq交货(豆类、志贺、日本)根据制造商的协议。引物序列如下:GAPDH:向前,5′-CTCCCATTCTTCCACCTTTG-3′,相反,5′-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3′;纤连蛋白:向前,5′-CACTGGCCACACCTACAACC-3′,相反,5′-CTGGAATCATCTCTGTCAGC-3′;胶原蛋白I型:向前,5′-TTGGGGCAAGACAGTCATCG-3′,相反,5′-TGTCCATTCCGAATTCCTGG-3′;胶原蛋白类型III:向前,5′-ATCAAACACGCAAGGCCATG-3′,相反,5′-AAGCAAACAGGGCCAATGTC-3′;Ki67抗原:向前,5′-TGGAGATCCAGATGTTAGGC-3′,相反,5′-TTGCATCTTTCTTGGCCCC-3′;αsma:向前,5′-ATATTCTGTCTGGATCGGCG-3′,相反,5′-AGCATTTGCGGTGGACAATG-3′。实验进行了一式三份,至少重复三次。结果被表示为褶皱为每个基因差异表达比GAPDH使用2^−ΔΔCt方法。

2.8。统计数据

所有测量数据都表示为均值±SD除了数据描述CNV,表示为手段。一个学生的以及被用来比较两组,而一个方差分析(方差分析)是用于多个比较上皮缺损区域,反射率的相对强度,信使rna水平,可见计数。非参数Mann-Whitney和克鲁斯卡尔-沃利斯测试被用于角膜阴霾和CNV的比较。所有使用SPSS统计分析(v15.0)。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。激活PPARδ抑制角膜上皮愈合伤口

PPAR的影响δ在角膜上皮愈合评估通过测量上皮缺损区域。领域的上皮缺陷产生的激光烧蚀后立即手术没有差别。如图1GW501516集团显示显著延迟reepithelialization在24和48 h手术后(所有其他组在同一时间点)。这组继续显示角膜上皮点状的或线性缺陷在消融后72 h,它完全愈合手术后7天。

3.2。激活PPARδ促进角膜血管新生

PPAR的影响δ在角膜血管新生研究通过测量CNV的面积。手术后一周,CNV在GW501516-treated眼角膜最严重,出现大量的外围血管(图2 (b))。两周后手术,CNV在所有组明显减少,一些血管达到中央角膜。随后,只有几个小血管观察血管继续消失。统计,CNV GW501516组最高,在手术后1 - 2周内显著差异(所有其他组在同一时间点)(数据2 (e)和2 (f))。CNV是低3和4周后手术,并没有发现差异。

3.3。PPAR的影响δ在角膜透明度

中央角膜角膜透明度评估是基于阴霾得分。手术后一周,大部分的角膜和角膜水肿。手术后角膜的阴霾变得明显的两周。在某些眼角膜,血管达到中央角膜,角膜透明度下降。手术后4周,阴霾分数在PBS组,GW501516组GSK3787组3787年GW501516结合葛兰素史克集团。霾分数是GW501516组低于GSK3787集团();然而,GW501516组没有显著不同于PBS组()(图3)。

3.4。PPAR的影响δ的激活和增生,可见

使用共焦显微镜观察细胞形态和ECM体内荷尔蒙替代疗法三世。的相对强度的反射率laser-ablated区被测量基于平均像素强度前基质的微米。前基质被定义为从epithelial-stromal基质界面的深度30微米,这是激光治疗后大约三分之一的基质厚度。手术后4周,可见GW501516组(图4 (b))是静止,ECM的反射率较低。此外,可见GSK3787组(图4 (c))活跃,ECM的反射率高。相应地,前基质的反射率的相对强度GW501516组最低,这差别十分明显(所有其他laser-ablated组),这表明,角膜透明度是进步最快GW501516组(图4 (e))。

角膜伤口愈合的细胞方面评估了H & E染色和immunofluorescent染色。手术后4周,上皮在所有组分层。炎症和内皮细胞的中央角膜基质中,并未观察到任何团体基于H & E染色(图5(一个))。CD11b immunofluorescent染色为阴性组(图5 (b)),表明中性粒细胞和巨噬细胞的缺失。基于上述研究结果,可见的数量和mRNA水平Ki67抗原检查阐明PPAR的影响δ在可见的细胞增殖。GW501516组的平均数量,可见明显低于在PBS和GSK3787组(两种)(图5 (c))。Ki67抗原的mRNA水平是最低的GW501516集团(所有其他组)(图5 (d))。

3.5。PPAR的影响δ的分化转移,可见到Myofibroblasts和ECM的合成

Myofibroblasts表达αsma,分泌物增加纤连蛋白和胶原蛋白myofibroblast分化的关键特征。的水平αsma、纤连蛋白和III型胶原蛋白被immunofluorescent染色检查,和的mRNA水平αsma、纤连蛋白、胶原类型III和胶原蛋白类型我通过rt - pcr检测。

α-SMA-positive在完好无损的角膜基质细胞缺席基于immunofluorescent染色。激光治疗两周后,α-SMA-positive细胞中观察到前和midstroma组(图6(一))。没有发现显著差异。激光治疗3和4周后,α-SMA-positive基质细胞很少观察到后基质。激光治疗后4周,GW501516的mRNA水平显著降低αsma比所有其他组(所有其他组)(图6 (d))。

在完好无损的角膜,immunofluorescent纤连蛋白染色是在基底膜明显,基质和角膜后弹力层。激光治疗后4周,纤连蛋白表达的主要是前中央角膜基质在所有组。沿着laser-injured表达式是不同的和一致的网站。我们观察到纤连蛋白表达降低GW501516组比PBS和GSK3787组(图6 (b))。纤连蛋白的mRNA水平(图6 (d))是最低的GW501516集团(相比其他组)。胶原蛋白类型III中没有检测到完好无损的角膜。激光治疗后4周,III型胶原的表达是GW501516组低于PBS和GSK3787组(图6 (c))。III型胶原(图的mRNA水平6 (d))是最低的GW501516集团(相比其他组)。同样,胶原蛋白类型的mRNA水平我是最低的GW501516集团(相比其他组)。

4所示。讨论

目前的研究集中在小说的PPAR的角色δ在激光烧蚀后角膜伤口愈合。GW501516发现抑制角膜伤口的reepithelialization涉及前基质。PPAR的配体激活δ是proangiogenic受伤角膜,探索。我们证明了PPARδ减毒角膜伤口愈合的透明度在重构阶段。角膜共焦显微镜是利用PPAR首次展示δ抑制角膜细胞激活体内。此外,研究支持,PPAR的激活δ减毒扩散和转换,可见的ECM的合成。这些发现与之前的研究相一致的PPARδ报告的antifibrosis对几种不同类型的细胞和组织的影响(13,17- - - - - -21,27]。

在这项研究中,我们表明,GW501516推迟了reepithelialization的眼角膜前基质PPAR受伤δ端依赖的方式。PPARδ据报道减毒的扩散角化细胞在皮肤16]。在角膜,PPAR的角色δ在伤口愈合上皮Yoshikuni第一次证明了,谁表明,它促进了reepithelialization过程通过凋亡效应(22]。Yoshikuni的研究中,局部的政府GW501516加速机械去除角膜上皮愈合伤口的兔子和一个完整的前体内基质和角膜上皮伤口关闭由人类角膜上皮细胞体外。我们的研究结果,获得了不同的模型,反驳Yoshikuni的研究。在动物模型与一个更大的伤口大小(直径4.5毫米和3.0毫米)生成的用激光,上皮细胞受到不同的微环境的Yoshikuni的研究。此外,破坏前基质复杂reepithelialization过程因为epithelial-mesenchymal交互。类似的应用MMC激光治疗后(7),GW501516延迟reepithelialization不增加角膜阴霾从长远来看,这表明PPAR的激活δ抑制,可见的激活。进一步的研究需要阐明PPAR的效果δ在不同的条件下对角膜上皮细胞。

近年来,许多研究已经证实,此前静止,可见的激活和代myofibroblasts负责ECM沉积(2,3]。后损伤角膜基质,可见经历一系列的形态和功能变化28]。简而言之,可见位于伤口床进行损伤后细胞凋亡小时(29日),导致一个非细胞伤口床。邻,可见被激活,开始增殖,迁移到受损区域。当他们达到伤口床,修复与梭状形状的表型,多个核仁,缺乏胞质颗粒,像典型的成纤维细胞。随着伤口愈合的发展,修复成纤维细胞可以myofibroblasts转化的一个子集。的α-SMA-positive myofibroblasts通常需要在一个星状形状,比成纤维细胞。因此,细胞形态可以用来区分细胞表型。在我们的研究中,不同的细胞形态学观察到体内共焦显微镜在所有组手术后4周表明,PPAR的配体激活δ抑制,可见的激活。角膜共焦图像的定量、角膜细胞计数和Ki67抗原mRNA水平表明GW501516减少,可见的扩散,这是符合PPAR的抑制效应δ在可见的激活。准分子激光消融被称为诱导的角膜伤口的最佳方式与定义的形状,大小,和深度产生一群myofibroblasts牙龈基质的老鼠,兔子,和人类30.]。在我们的研究中,乐队的myofibroblasts通过immunofluorescent染色证实手术后两周αsma。手术后4周,mRNA水平越低αsma隐含减少myofibroblasts分化,虽然α-SMA-positive细胞很少发现。与这些变化一致,减少ECM合成胶原蛋白和其他组件也表示myofibroblasts和可见的细胞功能。所有这些数据支持了PPAR antifibrosis GW501516的影响δ端依赖的方式。霾分数没有统计GW501516组和PBS组之间的差异。这种差异可能是由于缺乏谦虚的antifibrosis PPAR的效果δ和样本量不足探测小的差异。

在我们的研究中,我们证明了PPAR的激活δ抑制增殖和分化转移,可见和ECM的合成有关。这些发现符合PPAR的报告δ从心脏成纤维细胞19,20.和动脉平滑肌细胞17]。数项研究证实,PPAR的抗效应δ相关联的upregulation PPAR-responsive细胞周期抑制G0S2基因,而PPARδ减少了fibroblast-to-myofibroblast分化转移可能通过增加的PTEN表达水平(17,19]。我们的体外实验研究PPAR的影响δ在迁移、增殖和细胞周期调控基因表达在TGFβ1-stimulated可见。体内,antifibrosis PPAR的效果δ可能涉及其他机制,包括抗炎效果。事实上,PPARδ已经知道扮演一个角色在炎症控制(31日]。合成的高亲和性PPAR GW0742δ受体激动剂,据说停止博来霉素引起的炎症和凋亡过程(27]。在这项研究中,我们使用准分子激光消融角膜伤口。激光治疗后免疫反应往往是最明显的前三天内,和大多数的研究集中在激光治疗后一个星期内的时间。在我们的研究中,immunofluorescent染色在四个星期没有识别CD11b-positive细胞,表明缺乏免疫反应。然而,调查的可能贡献GW501516抑制免疫细胞在早期的时间点仍是很重要的,因为早期免疫反应是伤口愈合过程不可分割的一部分。同样,GW501516对细胞凋亡的影响应该调查因为myofibroblasts被认为通过凋亡消失在伤口愈合的后期阶段。

我们所知,我们的研究是第一个涉及PPARδ在角膜伤口愈合的促进血管生成。尽管PPAR的效果δ在血管生成尚不清楚,相当的证据支持其proangiogenic特性。研究表明,PPAR的激活δ增加内皮细胞增殖和功能在体外和体内32,33]。在另一项研究中,GW0742导致显著增加管细胞和细胞龛之间和剂量反应关系的形成,表明PPARδ可能通过prodifferentiation调节血管生成/成熟机制(34]。尽管多PPAR的争论δ促进血管生成,PPARδ被广泛接受的是proangiogenic,同意我们的结果。在角膜血管新生是不可取的因为新成立的血管导致不仅角膜透明度的损失,而且免疫角膜的特权的丧失。相关的血管生成可能改变角膜伤口愈合过程和可能的免疫反应。总的来说,PPAR的机制δ促进血管生成需要阐明避免不利的副作用。

综上所述,我们的数据表明,GW501516延迟角膜reepithelialization, CNV,减毒角膜纤维化,当激光消融后立即管理。的不良反应主要是在早期阶段,我们假设开始GW501516在稍后的时间点可能会避免有害的早期治疗效果,同时保持了有益的后遗症。它可能是一个有用的策略开始治疗后第三天到第七天伤口的一代,我们将检查它在未来的研究。

5。结论

我们第一次报道,PPAR的配体激活δ抑制的激活和增生,可见。从可见分化转移到myofibroblasts和ECM合成也减少了。因此,PPARδ强有力的antifibrosis影响角膜伤口愈合,但目标应该是精心挑选的,因为它延迟角膜reepithelialization也促进CNV。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

云顾和李宣同样导致了这项研究。

确认

作者感谢金庸林博士,Yuchuang Wang博士和健民高技术援助。本研究支持由中国国家自然科学基金(81170828和81170828),天津科学市级科技基金会(11 jcybjc27200),和返回的科学研究基金会学者,中国教育部(没有。693)。

补充材料