文摘

15-Deoxy -前列腺素J₂(15 d-pgj₂)和苯丙酸诺龙是涉及的控制细胞凋亡,细胞增殖和炎症细胞。我们检查了15 d-pgj的机制₂调节的转录activin-induced激活素受体(ActR)和Smads HepG2细胞和核转录因子的参与κB (NF -κB)和增殖蛋白激酶(MAPK)通路在这个监管。苯丙酸诺龙(25 ng / mL)抑制HepG2细胞增殖,而15 d-pgj₂(2μ米和5μ米)没有影响。激活素A和15 d-pgj₂显示不同的监管影响ActR Smad表达式,NF -κB p65活动和MEK / ERK的磷酸化,而他们都降低il - 6生产和增加引发生产。当co-stimulated 15 d-pgj₂苯丙酸诺龙、15 d-pgj₂抑制了activin-induced ActR和Smad表达式,并减少activin-induced il - 6生产。然而,它增加activin-induced引发生产。此外,15 d-pgj₂抑制activin-induced NF -κB p65活动和activin-induced MEK / ERK的磷酸化。这些结果表明,15 d-pgj₂抑制activin-induced ActR Smad表达,下调il - 6生产,让引发生产通过抑制NF -κB和HepG2细胞MAPK信号通路。监管ActR Smad转录表达和细胞因子的生产涉及NF -κB和MAPK通路与15 d-pgj通过交互₂/苯丙酸诺龙/ Smad信号。

1。介绍

苯丙酸诺龙是抑制素的形成或为β子单元(β一个β一个,βBβB,或β一个βB) (1]。苯丙酸诺龙的生物活性是由受体复合物,由两个不同的苯丙酸诺龙丝氨酸/苏氨酸激酶受体(ActR)、I型(ActR I)和II型(ActR II) (2]。Smad2 Smad3蛋白质磷酸化,激活特定的I型丝氨酸/苏氨酸激酶受体。形成二聚的复合物导致磷酸化Smad2和Smad3和Smad4后续复杂的形成,调节activin-responsive基因(3,4]。Smad7抑制剂作用的转化生长因子-β(TGF -β)家庭信号,包括激活素信号(5,6]。Activin-responsive基因已经被卷入体内平衡的控制,发展、增殖、凋亡、分化、和炎症细胞在不同系统(2]。

15-Deoxy-Δ^12日,14日前列腺素J₂(15 d-pgj₂)是一种前列腺素D的导数₂和过氧物酶体是一种天然配体proliferator-activated receptor-gamma (PPARγ),这是一个转录核受体(7,8]。15 d-pgj₂有一个广泛的生物效应包括细胞凋亡、细胞增殖、炎症和诱导抗氧化酶的表达(9]。最近的研究表明,PPARγ受体激动剂防止TGF -β1 / Smad3信号在人类肝星状细胞(10]。15 d-pgj₂抑制TGF -的表达β全身结缔组织生长因子通过抑制Smad2磷酸化,PPAR的独立;15 d-pgj₂也可能通过一个PPAR-dependent机制在人类肝癌细胞。此外,15 d-pgj₂可能阻止肝纤维化所诱发的环境毒素(11]。报告TGF -的影响β信号在NF -κ癌细胞B活动是相互矛盾的。TGF -β据报道减少NF -κB在唾液腺细胞激活和乳腺癌细胞通过一个机制,包括增加我的表情κB -α(12,13]。TGF -β治疗也已被证明能够在NF -没有影响κB在外阴癌的细胞激活(14]。15 d-pgj₂介导的老年病interleukin-8(引发)是次要的增殖作用的激活蛋白激酶(MAPK)信号通路的抑制NF -κB信号通路(15]。然而,PPAR的影响γ在HepG2细胞激活素信号尚未确定。我们检查了15 d-pgj的机制₂调节的转录activin-induced HepG2细胞激活素受体和Smads和NF -κB和MAPK通路参与本条例。

2。材料和方法

2.1。材料

重组人类苯丙酸诺龙购买从研发系统(明尼阿波利斯,美国)和15-Deoxy-Δ^12日,14日前列腺素J₂从开曼群岛获得化学(美国安阿伯市MI)。

2.2。细胞培养

人类肝癌细胞株HepG2得到来自美国类型文化集合(罗克维尔市,医学博士,美国)。在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞,含10%胎牛血清(美国纽约Gibco-BRL,大岛)和抗生素,在37°C在湿润的气氛中包含5%的股份有限公司₂和95%的空气。

2.3。MTT试验

细胞增殖测定CellTiter 96水一个解决方案(WI Promega,麦迪逊,美国)。细胞被播种在1×10⁴细胞/在96孔板,然后用激活素A和孵化15 d-pgj₂72 h。使用比色测定细胞生存能力是由与项目经理/ MTS的解决方案。吸光度测量在492 nm和背景减法进行了650海里。

2.4。RNA提取和实时PCR分析

从培养细胞总RNA分离使用RNA-Bee解决方案工具包(美国Tel-Test Friendswood, TX)。第一次执行链cDNA合成1μ克总RNA转录cDNA用反转录系统随机五个一(Promega)根据制造商的协议。引物序列和产品尺寸如下:ActR IA向前5′-GATGAGAAGTCATGGTTCAGG-3′,反向5′-TATGTTTGGCCTTTGTTGATC-3′, 651个基点;ActR IB向前5′-CTGGCTGTCCGTCATGATGCA-3′,反向5′-CAATTCGCTCTCAGAGTCTCC-3′, 683个基点;向前ActR花絮5′-ACCAGTGTTGATGTGGATCTT-3′,反向5′-TACAGGTCCATCTGCAGCAGT-3′, 456个基点;IIB ActR向前5′-TTCTGCTGCTGTGAAGGCAAC-3′,反向5′-GAGGTCGCTCCTCAGCAATAC-3′, 699个基点;Smad2向前5′-TAGGTGGGGAAGTTTTTGCT-3′,反向5′-TTTTCATGGGACTTGATTGG-3′, 411个基点;Smad3向前5′-GGGCTCCCTCATGTCATCTA-3′,反向5′-GGCTCGCAGTAGGTAACTGG-3′, 443个基点;Smad4向前5′-CCCAGGATCAGTAGGTGGAA-3′,反向5′-CCATGCCTGACAAGTTCTGA-3′, 452个基点;Smad7向前5′-TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC-3′,反向5′-TTGTTGTCCGAATTGAGCTG-3′, 447个基点;β肌动蛋白向前5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3′,反向5′-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3′, 305个基点。实时PCR进行Chromo4探测器实时系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国)SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad)。pcr进行2µL cDNA 20µL反应混合物,由10µL SsoFast EvaGreen Supermix, 2μL的引物,和6µL PCR年级水。反应进行的变性步骤在95°C 30年代紧随其后的是45 95°C的周期5 s和55°C到62°C 12。激活素受体或Smad的交叉点β肌动蛋白是通过使用公式计算2 (^{−(目标基因β肌动蛋白)}),和相对量量化。

2.5。il - 6和引发酶联免疫吸附试验

il - 6的浓度和引发收获细胞培养上清液测定酶联免疫吸附试验(ELISA)根据制造商的指示(研发系统)。

2.6。NF -κB p65活动分析

在每个时间点,细胞培养基被除去,被刮进2毫升的冷磷酸盐(PBS)和磷酸酶抑制剂。细胞悬液离心(500 rpm在4°C)为5分钟。细胞颗粒细胞溶解在25µL完成裂解缓冲(活动主题,卡尔斯巴德、钙、美国)30分钟在冰摇摆平台上设置在150 rpm。提取是离心机(14000转10分钟4°C)和上层清液用于活动后化验设备协议。核中提取的蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质化验(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。NF - ELISAκB p65活动执行根据制造商的指示(活动主题)。

2.7。免疫印迹分析

细胞被镀在2×10⁶细胞在100毫米组织培养皿。第二天,他们对待药物浓度的方式。治疗后,这些细胞被洗冷PBS和细胞溶解组织培养皿中通过裂解缓冲(20毫米Tris-HCl (pH值7.5),150毫米氯化钠,1毫米Na₂卫1毫米EGTA EDTA, 1%, 2.5毫米焦磷酸钠,1毫米β甘油磷酸盐,1毫米Na₃签证官₄,1μg / mL亮抑酶肽),其中包含1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物。蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质分析。蛋白质(30μg)分馏进行sds - page凝胶电泳和转移通过执行12%到硝化纤维膜。膜被封锁的5%脱脂奶粉1 h与anti-ERK1在室温和孵化,antiphospho-ERK1/2(刺202),anti-MEK-1/2, antiphospho-MEK-1/2 (Ser 218 / Ser 222),或β肌动蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)在1:250稀释Tris-buffered盐水含有0.05% tween-20 (TBS-T) 1 h。然后,洗后用TBS-T 1 h,细胞膜与辣根peroxidase-conjugated二级抗体反应被稀释1:在室温下2500 withTBS-T 1小时。洗膜后TBS-T 1 h,蛋白质被发现通过使用ECL化学发光工具包(圣克鲁斯生物技术)。蛋白表达进行了分析通过使用化学发光成像系统(Davinch-Chemi,首尔,韩国)。蛋白质带密度被采用量化图像解决方案的新一波模块项目(IMT i-Solution, Inc .,温哥华BC,加拿大)。

2.8。统计分析

实验重复三个独立样本,该值表示为均值±SEM。所有的比较分析了利用非参数克鲁斯卡尔-沃利斯单向方差分析测试。的值*被认为显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。苯丙酸诺龙和15 d-pgj的影响₂对HepG2细胞增殖

HepG2细胞激活素A或15 d-pgj对待₂。细胞增殖是由使用MTT试验。激活素抑制细胞增殖,而15 d-pgj₂没有效果。刺激的细胞激活素A和15 d-pgj₂增强HepG2细胞增殖与苯丙酸诺龙(图孤单的刺激1)。

3.2。15 d-pgj₂调节Activin-Induced HepG2细胞激活素受体和Smad mRNA表达

确定15 d-pgj的效果₂ActRs的表达和Smads HepG2细胞激活素的存在,HepG2细胞激活素A和15 d-pgj对待₂72 h。我们进行了实时PCR确定ActR和Smad mRNA的表达。苯丙酸诺龙ActR IA的表达增加,IB, IIB, Smad3,和Smad7 mRNA控制相比,而ActR花絮mRNA表达减少和Smad2和4 mRNA表达保持不变。15 d-pgj₂抑制ActR和Smad mRNA表达在2μ米和5μ米比控制。当细胞被刺激与15 d-pgj₂、苯丙酸诺龙、15 d-pgj₂镇压activin-induced ActR和Smad mRNA表达的增加,但增加ActR IA mRNA水平相比,苯丙酸诺龙单独刺激(数据2(一个)和2 (b))。

3.3。15 d-pgj₂下调Activin-Induced il - 6生产和让Activin-Induced引发生产HepG2细胞

HepG2细胞激活素A和15 d-pgj对待₂72 h,然后细胞培养上清液中il - 6和引发水平是衡量使用ELISA。激活素A和15 d-pgj₂抑制il - 6生产与控制。当细胞被刺激与15 d-pgj₂、苯丙酸诺龙、15 d-pgj₂相比减少activin-induced il - 6生产苯丙酸诺龙(图孤单的刺激3(一个))。激活素A和15 d-pgj₂增加引发生产与控制。当与15 d-pgj HepG2细胞被刺激₂、苯丙酸诺龙、15 d-pgj₂增强activin-induced引发生产相比,苯丙酸诺龙(图孤单的刺激3 (b))。il - 1β生产后没有观察到单个刺激或聚集有关(数据没有显示)。

3.4。15 d-pgj₂抑制Activin-Induced NF -κB p65活动HepG2细胞

HepG2细胞激活素A和15 d-pgj对待₂NF - 72 h,然后κB p65活动核分数用ELISA测定。苯丙酸诺龙NF -增加κB p65活动相比,控制,而15 d-pgj₂并不影响NF -κB p65活动。当细胞被刺激与15 d-pgj₂、苯丙酸诺龙、15 d-pgj₂抑制了activin-induced NF -κB p65活动相比,苯丙酸诺龙(图孤单的刺激4)。

3.5。15 d-pgj₂抑制Activin-Induced MEK / ERK激活HepG2细胞

HepG2细胞激活素A和15 d-pgj对待₂72 h。我们确定关键蛋白质的磷酸化水平变化在MEK / ERK通路进行免疫印迹分析评估和15 d-pgj激活素的影响₂在这个途径HepG2细胞。苯丙酸诺龙相比减少MEK或ERK激活控制,而15 d-pgj₂没有影响。当细胞被刺激与15 d-pgj₂、苯丙酸诺龙、15 d-pgj₂抑制activin-induced MEK和ERK激活激活素单独刺激(数据5(一个)和5 (b))。

4所示。讨论

最大反应是大约40%的控制价值观和没有进一步抑制扩散被认为苯丙酸诺龙后暴露(5-50 ng / mL) (16]。最近的一项研究显示,15 d-pgj₂不影响HepG2细胞增殖率在低浓度(17]。我们调查的影响激活素A和15 d-pgj₂HepG2细胞增殖。苯丙酸诺龙(25 ng / mL)抑制HepG2细胞增殖,而15 d-pgj₂(2μ米和5μ米)没有影响。我们的研究结果与之前的研究相一致,这表明,激活素抑制细胞增殖,而15 d-pgj₂没有效果。

我们发现激活素的表达水平增加大多数ActR和Smad记录控制相比,除了ActR花絮mRNA水平,减少,和Smad2和Smad4 mRNA水平保持不变。15 d-pgj₂刺激减少ActR和Smad mRNA的表达。然而,与15 d-pgj聚集有关₂和苯丙酸诺龙隐含activin-induced ActR HepG2细胞和Smad mRNA表达。这些结果表明,苯丙酸诺龙和15 d-pgj₂在转录水平有微分监管影响。15 d-pgj₂可能会导致通过PPAR Smad2易位γ/ TGF -β/ Smad2通路。的PPARγ受体激动剂15 d-pgj₂抑制了TGFβ全身结缔组织生长因子表达在人类主动脉平滑肌细胞(18]。在这项研究中,15 d-pgj₂抑制activin-induced ActR和Smad表达,这表明15 d-pgj₂配体激活素信号通路调节中发挥着重要作用。PPAR的影响γ在激活素信号没有被报道。因此,进一步的研究是必要的评估这个概念。

il - 6 concentration-responsive的方式刺激纤维蛋白原的HepG2的生产,而苯丙酸诺龙抑制il - 6介导活动(19]。15 d-pgj₂在调解中扮演着一个关键的角色引发老年病通过PPARγ激活或通过其他机制。PPARγ受体激动剂(15 d-pgj₂和troglitazone)抑制TGFβ1-induced趋化因子的表达在人类肾小管上皮细胞(20.]。15 d-pgj₂变弱的NF -κ通过PPAR B-mediated许多促炎基因转录激活γ端依赖和PPARγ独立的机制(21]。最重要的一个转录因子,调节引发的表达,NF -κB (22]。我们发现15 d-pgj激活素A和₂刺激相比降低il - 6生产和增强引发生产控制。苯丙酸诺龙NF -增加κB p65活动,而15 d-pgj₂并不影响NF -κB p65活动。然而,与15 d-pgj聚集有关₂苯丙酸诺龙衰减activin-induced il - 6生产,上调activin-induced引发生产,和抑制苯丙酸诺龙A-induced NF -κB p65活动和MAPK信号。综上所述,我们的研究结果表明,15 d-pgj₂下来,让activin-induced il - 6和引发的生产,分别通过抑制NF -κB信号通路。TGF -β通过Smad-related抑制趋化因子表达途径(23]。NF -κ抑制TGF - B已被证明β/ Smad通过Smad7的转录激活途径,这是一种抑制性Smad [24]。我们的研究结果同样表明,趋化因子表达HepG2细胞是由Smad和NF -介导的κB信号通路。15 d-pgj₂让引发表达式通过ERK1/2通路(15,15 d-pgj₂介导引发老年病有关NF -κB和MAPK信号通路。

5。结论

15 d-pgj₂抑制activin-induced ActR Smad表达,下调il - 6生产,并让引发生产,由于NF -κB抑制以及MAPK的负调节激活HepG2细胞。监管ActR Smad转录表达和细胞因子的生产涉及NF -κB和MAPK通路通过与15 d-pgj交互₂/苯丙酸诺龙/ Smad信号。然而,确切的机制参与这些监管途径仍有待阐明。

缩写

15 d-pgj2:	15-Deoxy-Δ12日,14日前列腺素J2
ActR:	激活素受体
NF -κB:	核因子-κB
MAPK:	增殖蛋白激酶
TGF -β:	转化生长因子-β
PPARγ:	过氧物酶体proliferator-activated受体γ
IL:	白介素。

确认

这项研究受到了生物产业技术开发计划,食品,农业、林业和渔业,大韩民国(批准号311059 - 4)和部分农村发展支持的政府,韩国(批准号PJ008475022012)。