文摘

证据显示前列腺素(PG) E2的不利影响糖尿病肾病(DN) STZ-induced 1型糖尿病,但它的作用在DN的2型糖尿病的发展仍不确定。本研究探讨PGE2的规定进行合成途径和过氧物酶体之间的交互proliferator-activated受体(PPAR)γ和PGE2合成在db / db小鼠的肾脏。引人注目的是,尿PGE2在db / db显著升高小鼠平行cox - 2蛋白表达的增加和mPGES-1。相比之下,蛋白质表达COX-1 mPGES-2, cpg, 15-hydroxyprostaglandin脱氢酶(15-PGDH)没有改变。罗格列酮(Rosi)治疗1周后,尿PGE2,但不是其他前列腺素类,同时降低了57%的显著减少mPGES-1蛋白质和EP4 mRNA表达。通过免疫组织化学,mPGES-1显著诱导肾小球的db / db老鼠,由Rosi几乎完全废除。本着减少肾小球mPGES-1,肾小球损伤评分显示Rosi治疗1周后改善的趋势。总的来说,目前的研究表明PPAR的抑制作用γ激活肾mPGES-1 / PGE2 / EP4通路在2型糖尿病和建议mPGES-1可能作为治疗目标治疗2型糖尿病危害DN。

1。介绍

肾前列腺素在糖尿病肾脏的异常被认为是一个重要因素在调停肾小球损伤,肾小管间质纤维化和流体不平衡(1- - - - - -4]。五个前列腺素类中PGE2、PGD2 PGI2 PGF2α,凝血恶烷(TX) A2, PGI2、TXA2调节肾血流动力学的重要参与者5- - - - - -7];PGE2作为肾小球完整性的重要调节器,党卫军血流动力学,和管状液体再吸收8- - - - - -10),而PGD2和PGF2α肾的研究较少,其功能是知之甚少。

肾PGE2受体(EP1-EP4)表达谱改变在1型糖尿病小鼠11]。牧野等人证明EP1-selective拮抗剂预防肾病的进展在链脲霉素(STZ)糖尿病大鼠(12]。最近,穆罕默德等人报道,EP4兴奋剂加剧STZ-induced 1型糖尿病小鼠肾损伤(13]。这些报告强烈建议PGE2的有害作用通过EP1 STZ-induced 1型糖尿病的肾脏和/或EP4受体。但是,没有之前的研究检查铂族元素合成酶的作用在2型糖尿病的肾损伤。在诊所,2型糖尿病是常见的比1型糖尿病和2型糖尿病的肾损伤具有更复杂的比1型糖尿病的发病机理。2型糖尿病的动物研究,瘦素受体变异db / db老鼠广泛应用(14,15]。我们最近出版了诱导肾cox - 2和PGE2的db / db老鼠(16),但整个肾脏的前列腺素,特别是PGE2-related合成酶,仍不确定小鼠模型。

PPARγ受体激动剂罗格列酮和piglitazone等是非常有效的药物治疗的2型糖尿病。除了他们的胰岛素敏化效果,PPARγ受体激动剂还保护器官免受各种伤害通过抗炎、抗氧化压力,antiapoptosis [17,18]。尽管大量证据证明了PPAR的有益作用γ激活在糖尿病肾损伤(19- - - - - -22),PPAR的角色γ肾的调节前列腺素在糖尿病肾脏仍是未知的。在目前的研究中,我们调查(1)肾cox - 2的规定/ mPGES-1 / PGE2 / EP通路在肥胖型糖尿病db / db老鼠和(2)PPAR的效果γ受体激动剂Rosi在这样的监管。

2。方法

2.1。动物和治疗

肥胖型糖尿病 (db / db B6.BKS (D) -leprdb / J), (db / m、精益控制)和C57 / BL6雄性老鼠从Jacson购买实验室(巴尔港,我)。在所有的研究中,七至八个月大的雄性老鼠。小鼠被分为三组:db / m控制(倾斜, ),没有Rosi db / db (db / db, ),和db / db Rosi (db / db + Rosi, )。被Rosi db / db老鼠果冻饮食(80毫克/公斤食物)1周如前所述[23]。db / m控制和db / db控制老鼠能有相同的饮食没有Rosi果冻。马来酸Rosi(猫没有。BRL49653C)是由葛兰素史克(英国哈洛)。所有老鼠都维持在一个12:12-h光暗周期(灯在上午6点和灯下午6点)。所有协议采用小鼠进行按照原则和指导犹他大学的制度动物保健和使用委员会。

2.2。免疫印迹

整个肾脏细胞溶解和蛋白质浓度是由Coomassie试剂。蛋白质(60μg)从整个肾脏溶菌产物变性在煮10分钟,由SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离,转移到硝化纤维膜。这些墨迹被封锁在一夜之间有5%的脱脂奶粉在Tris-buffered盐水(TBS),其次是孵化1 h和兔子anti-COX-1(开曼的化学物质,猫没有。160108),anti-COX-2(开曼的化学物质,猫没有。160106),anti-mPGES-1(开曼的化学物质,猫没有。160140),anti-mPGES-2(开曼的化学物质,猫没有。160145),anti-cPGES(开曼的化学物质,猫没有。160150),anti-15-PGDH(开曼的化学物质,猫没有。160615),anti-PPARγ(圣克鲁斯,猫没有。sc - 7273)和反β肌动蛋白(西格玛奥德里奇,猫没有。A1978)的稀释1:1000。与TBS洗后,墨迹孵化了一种山羊anti-horseradish peroxidase-conjugated二级抗体与发射极耦合逻辑(1:1000稀释)和可视化工具包(美国新泽西州Amersham,皮斯卡塔韦)。

2.3。免疫组织化学和组织学

肾脏的m和db / db / db老鼠与4%多聚甲醛固定石蜡和嵌入。肾脏部分4μ米厚度准备染色。mPGES-1的免疫组织化学表现使用EnVison TM迷你包(Doko Carpinteria, CA)根据制造商的指示。mPGES-1抗体从开曼群岛购买化学(猫没有。160140)和被应用于免疫组织化学染色1:200稀释。mPGES-1特定阻断肽(开曼的化学物质,猫没有。360140)是用来测试mPGES-1抗体的特异性信号。

组织学评价由高碘酸希夫(PAS)染色。肾小球硬化的半定量的得分不是彩色幻灯片使用五程度方法执行先前描述(16,24]:0,正常的肾小球;1、硬化< 25%;2、硬化25至50%;3、硬化在50 - 75%之间;4,表面硬化> 75%的肾小球。半定量的系膜区测量通过使用计算机软件形象J (NIH,马里兰州贝塞斯达)。

2.4。中存在

总RNA进行了隔离和逆转录如前所述[25]。寡核苷酸的设计使用Primer3软件(可用http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)。引物的序列如下:EP1 5′-cagtgaagtgcgggtggag-3′(意义)和5′-tattggggagcctgggtgt-3′(反义)NM_013641;EP4 5′-cttactcatcgccacctct-3′(意义)和5′-tggggttcacagaagcaatc-3′(反义)NM_008965;GAPDH 5′-gtcttcactaccatggagaagg-3′(意义)和5′-tcatggatgaccttggccag-3′M32599(反义)。放大了使用SYBR绿色主人混合(应用生物系统公司、沃灵顿、英国)和棱镜7500实时PCR检测系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。循环条件为10分钟95°C,紧随其后的是40 95°C的重复15秒,1分钟和60°C。融化曲线是由δCT检查结果进行分析的方法。GAPDH基因被用作参考。

2.5。酶免疫分析法

尿液样本在10000转离心5分钟。PGE2的含量(开曼的化学物质,猫没有。514010),PGD2(开曼的化学物质,猫没有。512031),6-keto-PGF1α(开曼的化学物质,猫没有。515211),和TXB2(开曼的化学物质,猫没有。519031)酶免疫分析法测定根据制造商的指示。PGE2测定,灵敏度或最小检出限为7.8 pg / mL;intra-assay简历和interassay CV 12.4% 4.2%。PGD2测定,灵敏度或最小检出限为19.5 pg / mL;intraassay简历和interassay CV 6.1% 11%。TXB2测定,灵敏度或最小检出限为7.8 pg / mL;intra-assay简历和interassay CV 26.6% 16.3%。为6-keto PGF1α测定,灵敏度或最小检出限为1.6 pg / mL;intra-assay简历和interassay CV 18.1% 6.7%。

2.6。统计分析

所有值都呈现意味着±SE。使用方差分析进行统计分析。差异被认为是重要的时候 。

3所示。结果

3.1。Rosi治疗效果在db / db老鼠尿前列腺素类输出

在db / db老鼠尿PGE2的输出与年龄匹配的瘦老鼠相比显著升高(图1(一)),这样的增加显著钝化Rosi治疗(图1(一))。此外,基线血糖水平在这个肥胖型糖尿病db / db鼠标应变高于精益控件(db / db: mg / dL和精益: mg / dL, )。一周Rosi完全规范化治疗血糖( mg / dL)。尿PGD2(图1 (b)),TXB2(稳定代谢物TXA2)(图1 (c)),6-keto-PGF1α(稳定代谢物PGI2)(图1 (d)在db / db)都显著增加小鼠,由Rosi影响管理。1周后尿量没有影响Rosi疗法(图1 (e))。

(一)
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(b)
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图1
Rosi治疗对前列腺素类的泌尿系统输出的影响和尿液体积在db / db老鼠。(一)尿PGE2输出。(b)尿PGD2输出。(c)尿TXB2输出。(d)尿6-keto-PGF1α输出。(e)尿量。 在每一个组。数据意味着±SE。
3.2。Rosi对蛋白质表达的影响前列腺素E合成酶在db / db老鼠

通过免疫印迹,肾mPGES-1蛋白明显升高在db / db小鼠4倍以上,这种感应非常迟钝,Rosi(数字2(一个)和2 (b))。通过免疫组织化学,mPGES-1蛋白质显著诱导肾小球,由Rosi治疗(数据完全废除3(一个)和3 (b))。然而,蛋白质的表达COX-1 mPGES-2, cpg, 15-PGDH(数字4(一)和4 (b))没有改变瘦素受体突变或Rosi治疗。cox - 2蛋白表达明显高于肾的db / db老鼠相比,瘦老鼠。然而,这种感应的cox - 2蛋白不是Rosi减毒的治疗数据2(一个)和2 (b))。

(一)
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图2
Rosi治疗对蛋白质表达的影响mPGES-1, COX-1, cox - 2在db / db小鼠的肾脏。(一)西方滴mPGES-1 COX-1, cox - 2, 肌动蛋白。(b)微西方的屁股。 在每一个组。数据意味着±SE。
(一)
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(b)
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图3
Rosi治疗效果在db / db小鼠肾小球mPGES-1表达式。(一)Immunohistochemstry mPGES-1。(b)的量化mPGES-1阳性细胞在肾小球。 在每一个组。数据意味着±SE。
(一)
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图4
Rosi治疗对蛋白质表达的影响mPGES-2, cpg, 15-PGDH db / db小鼠的肾脏。(一)西方滴mPGES-2、cpg 15-PGDH, 肌动蛋白。(b)微西方的屁股。 在每一个组。数据意味着±SE。
3.3。效应的Rosi mRNA的表达EP1和EP4 db / db小鼠的肾脏

Rosi治疗导致的差别明显对这些EP4 mRNA表达(图5 (b))符合显著减少尿PGE2和肾mPGES-1蛋白质。然而,EP1 mRNA不会受到瘦素受体突变或Rosi治疗(图5(一个))。

(一)
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(b)
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图5
表达式EP1和EP4 mRNA在db / db Rosi后小鼠肾脏治疗。(一)EP1的存在。(b) EP4的存在。 在每一个组。数据意味着±SE。
3.4。Rosi对PPAR的蛋白表达的影响γ在db / db小鼠的肾脏

通过免疫印迹,肾PPARγ蛋白质高出2.6倍db / db的老鼠相比,精益控制和Rosi治疗进一步增加了其表达式(数字6(一)和6 (b))。

(一)
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(b)
(b)
图6
蛋白表达的PPARγ在db / db Rosi治疗后小鼠的肾脏。(一)西方PPAR的污点γ和 肌动蛋白。(b)微西方的屁股。 为每个组= 4 - 5。数据意味着±SE。
3.5。Rosi治疗效果在db / db小鼠肾小球损伤

PAS染色,我们发现,系膜基质积聚在db / db老鼠明显增加。Rosi治疗1周导致趋势改善肾小球损伤( )(数据7(一)和7 (b))。

(一)
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(b)
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图7
PAS染色评估肾小球损伤的db / db Rosi治疗后小鼠。(一)PAS染色。(b)肾小球损伤分数。 为每个组。数据意味着±SE。

4所示。讨论

2型糖尿病的流行肥胖在全球范围内的迅速增加(26]。对于2型糖尿病患者,DN是一种常见和严重的并发症导致肾衰竭和死亡(19]。尽管广泛研究DN已经在过去的几十年里,这种疾病的发病机理仍然知之甚少。在动物研究中,瘦素受体变异db / db鼠标是一个广泛使用的糖尿病模型显示高血糖、高血脂、肥胖、及脱敏的胰岛素信号通路。db / db小鼠的肾损伤是良好的和潜在的致病因素可能包括高血糖、血脂紊乱、炎症和血液动力学障碍(27,28]。

它已经表明,肾PGE2水平升高STZ 1型糖尿病的动物。最近,证据证明PGE2的有害作用通过EP1 DN的发展1型糖尿病和/或EP4受体(12,13]。然而,无论肾PGE2在db / db老鼠在糖尿病肾损伤中发挥作用仍然是未知的。考虑到更复杂的代谢紊乱在db / db老鼠,潜在的机制导致肾损伤的小鼠模型可能大大不同于STZ-diabetic老鼠。因此,值得检查肾PGE2的规定及其合成途径在db / db老鼠。

在目前的研究中,我们发现了一个惊人的高度db / db尿PGE2的老鼠。与此同时,肾mPGES-1蛋白质也显著调节肾小球,这可能有助于增加肾产生PGE2在这些老鼠。相比之下,肾mPGES-1表达式没有改变在1型糖尿病小鼠模型由STZ诱导和系统性删除mPGES-1在肾PGE2感应没有发挥作用,糖尿病发病和STZ糖尿病肾损伤(数据没有显示)。这两个模型之间的差异mPGES-1监管可能由于不同的肾损伤发病机理。

不像mPGES-1, mPGES-2和cpg没有显著影响肾脏的db / db老鼠。COX-1 PGE2的上游和cox - 2酶合成酶提供PGH2产生PGE2的基质和其他前列腺素类。同意从Zucker老鼠发现29日),我们发现cox - 2,但不是COX-1,更高的db / db小鼠的肾脏。进一步阐明前列腺素E2退化的潜在影响肾产生PGE2,我们检查了15-PGDH,负责前列腺素降解酶,发现没有变化在db / db小鼠的肾脏。

PPARγ受体激动剂包括Rosi和piglitazone强有力的药物治疗2型糖尿病主要通过敏化胰岛素信号(19,30.- - - - - -32]。越来越多的证据证明PPAR的有益作用γ激活在保护糖尿病肾脏(19- - - - - -22]。同样,我们的结果也显示这一趋势改善肾小球损伤后短时间内Rosi疗法(7天)。然而,PPAR之间的交互γ在糖尿病肾脏和肾产生PGE2仍然不明。在目前的研究中,我们观察到,PPARγ受体激动剂Rosi强劲减毒肾mPGES-1感应db / db老鼠而不影响cox - 2的表达。这减少mPGES-1 Rosi治疗后蛋白表达可能占尿PGE2排泄减少。不变的cox - 2高表达可能有助于保持高尿PGE2水平Rosi-treated db / db小鼠对比精益控制。机制有关Rosi mPGES-1 / PGE2的差别影响对这些通路可能是复杂的。首先,这种效应可能与Rosi的血糖控制。先前的报道,Rosi显著降低了血糖水平在db / db老鼠23,33- - - - - -35]。我们的结果还表明,一个温和的在这个肥胖型糖尿病高血糖db / db鼠标应变几乎是归一化后1周Rosi疗法。虽然这降糖药效果的差别必须考虑对这些肾mPGES-1 / PGE2 /途径,另一项研究从我们组强烈不同意这种可能性。在这研究中,肾mPGES-1表达式不是STZ-diabetic鼠标和mPGES-1监管的缺失并不影响肾PGE2感应在6周的糖尿病。其次,众所周知,cox - 2 / mPGES-1 PGE2信号诱导各种炎症刺激。此外,增强肾脏炎症反应的db / db老鼠证实了大量研究[16,36,37]。因此,炎症刺激肾作为候选人mPGES-1 / PGE2通路在db / db老鼠,和Rosi的抗炎特性可能会负责这个途径的抑制。第三,我们不能排除直接影响瘦素受体突变的肾mPGES-1 / PGE2感应和潜在的瘦素受体之间的相互作用和PPARγ在调制mPGES-1 / PGE2的途径。最后,尿流可能也需要考虑。PGE2发挥利尿作用,导致尿流的增加(38- - - - - -44]。在相反的位置,尿流可以刺激肾小管产生PGE2 [45]。然而,1周Rosi治疗并不影响尿液的体积在db / db的老鼠,这在很大程度上排除这种可能性。

它被报道,EP1和EP4受体参与STZ-diabetic小鼠肾小球损伤(12,13]。存在,Rosi治疗导致温和但显著减少EP4一成不变的EP1相反。此外,我们还研究了PGD2尿排泄,6-keto-PGF1α,和TXB2。与PGE2不同,没有人受到Rosi疗法。这些结果表明选择性Rosi肾前列腺素类生产的作用。

总之,采用db / db的老鼠,我们发现肾mPGES-1 / PGE2途径有效地诱导和这样一个感应被PPAR明显抑制γ受体激动剂Rosi。这些结果高度建议PPAR之间的交互γ和mPGES-1 / PGE2 / EP4通路在db / db小鼠的肾脏。的差别,对这些mPGES-1 PGE2 / EP4通路可能有助于PPAR的保护作用γ在2型糖尿病危害DN。进一步验证这一假说,封锁mPGES-1或EP4瘦素受体突变动物药理战略或基因破坏在未来将是非常重要的。

利益冲突

所有作者声明没有利益冲突,包括相关经济利益、活动、关系和从属关系。

确认

这项工作是支持的VA绩效审查(t .杨),美国国立卫生研究院批准号杨DK079162 (t)和一个科学家开发给予z贾(11 sdg7480006)。建立t·杨是一个侦探从美国心脏协会和研究职业科学家在退伍军人事务部的统计。