文摘

过氧物酶体扩散国的激活激活receptor-gamma (PPAR)γ提出了作为治疗神经退行性疾病的神经保护策略。在这项研究中,我们检查如果LSN862 (LSN),小说non-thiazoledinedione部分PPAR -γ受体激动剂,神经保护小鼠模型的帕金森病(PD)和评估可能的作用机制。LSN(3、10个或30毫克/公斤)或车辆是口头管理日常C57BL / 6和抗氧化剂反应element-human胎盘碱性磷酸酶(ARE-hPAP)记者老鼠1-methyl-4-phenyl-1前3天,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP;30毫克/公斤,i.p。×5天)或PBS管理。LSN引起多巴胺黑质纹状体神经支配,没有保护存在剂量依赖的相关性与注射抑制MPTP药物代谢或激活Nrf2-ARE,尽管NQO1和SOD2 mRNA的变化被观察到。MAC-1和GFAP阳性细胞的差别显著存在剂量依赖的相关性对这些基因的小鼠注射在MPTP药物+ LSN-treated mRNA表达的差别以及重要的对这些这些炎症标记物的水平。MPTP-induced增加PPAR -γ和PGC1α表达式被LSN剂量改善。我们的研究结果表明,口服的LSN神经保护反对MPTP-induced神经退化,这效果的差别与对这些神经炎症,降低氧化应激,调制PPAR -γ和PGC1α表达式。这些结果表明LSN可以替代候选人non-thiazoledinedione部分PPAR -γ神经保护治疗PD的兴奋剂。

1。介绍

神经炎症中扮演着重要角色在nigral多巴胺(DA)细胞损失在帕金森病(PD);(1])。小胶质细胞作为居民免疫细胞的神经系统,在正常情况下,他们大脑的监测环境处于休息状态。然而,在应对创伤或侮辱,小胶质细胞被激活,展示吞噬形态和upregulation CD1和细胞粘附分子,如MAC-1 (CD11b)和CD54 [1]。当激活一个长期的时间,小胶质细胞释放一连串的促炎细胞因子如TNF -α,il - 1β,而il - 6可能导致线粒体功能障碍和细胞死亡1]。活化的小胶质细胞存在高密度的PD患者的黑质2,3]。Nigral DA神经元似乎特别容易受到炎症由于许多因素包括谷胱甘肽水平降低(降低抗氧化能力4],减少氧化还原活性[5),高密度neuromelanin [6,高铁浓度(7])。小胶质细胞在炎症的首席调解员在大脑中,星形神经胶质是炎症反应的一部分。Astrogliosis观测环境的侮辱和伤害后,它的特点是upregulation胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)。注射1-Methyl-4-phenyl-1 2 3, 6-tetrahydropyridine (MPTP药物)治疗小鼠PD患者存在活性小胶质细胞和astrogliosis黑系统(8,9]。

过氧物酶体扩散者激活receptor-gamma (PPAR -γ)三种PPAR亚型。PPAR -γ配体依赖和独立的方式调节基因表达(10),之前已经报道过减弱促炎基因而减少胶质增生(11,12]。PPAR -γcoactivator-1α(PGC1α),该函数作为线粒体能量代谢的主传感器,似乎也有抗炎和抗氧化性能13,14]。受体激动剂PPAR -γ(如罗格列酮(文迪雅)和吡格列酮(Actos),成为潜在的治疗PD,他们似乎调节这些途径。罗格列酮政府老鼠注射治疗MPTP药物的肾清除率抑制剂丙磺舒诱导神经保护TH-ir nigral神经元,抑制电动机和嗅觉障碍,减少神经炎症标记(15]。同样,吡格列酮剂量MPTP-treated保护DA nigral诱发小鼠神经细胞,激活小胶质细胞减少,减氮oxide-mediated毒性(16,17]。吡格列酮的政府在帕金森非人灵长类动物运动功能恢复,防止黑多巴胺能细胞的损失,和调节神经炎症18]。除了抗炎,吡格列酮注射据报道引起神经保护效应对MPTP药物通过抑制缺氧(19和影响抗氧化途径20.]。

虽然罗格列酮和吡格列酮有前途的治疗候选人,他们可能为慢性政府易感人群存在缺点,如有害心血管效应(21- - - - - -23]。罗格列酮相比,吡格列酮似乎存在一个低风险(21,24),但它将是可取的替代PPAR -γ受体激动剂缺乏这些并发症。

LSN862 (LSN;礼来制药厂有限公司)是一种新型non-thiazolidinedione部分PPAR -γ受体激动剂。它很容易吸收后口服剂量,像其他PPAR -γ受体激动剂,具有高度的亲和力PPAR -γ低,但意义重大,亲和力PPAR -α(见[25]LSN绑定描述)。有趣的是,PPAR -α激活与神经保护有关帕金森病小鼠模型(例如,26])。在这里,我们报告我们的评估的LSN注射神经保护化合物在MPTP药物PD小鼠模型及其可能的作用机制。

2。材料和方法

2.1。动物和程序

雄性C57BL / 6小鼠(8 - 10周的年龄,20 - 25 g)获得从杰克逊实验室(缅因州巴尔港)。抗氧化反应element-human胎盘碱性磷酸酶(ARE-hPAP)记者老鼠(8 - 10周的年龄,20 - 25克)创建使用NAD (P) H:醌氧化还原酶(NQO1)启动子上游的构造(hPAP记者27]。动物被安置在室温下12小时光暗周期,获得食物和水随意。都是努力减少实验用动物的数量,缓解他们的痛苦。本研究进行了严格按照指南中建议的实验动物保健和使用美国国立卫生研究院。所有协议都是批准的机构和动物保健委员会威斯康星大学麦迪逊分校。

老鼠服用MPTP-HCl在盐水(或盐水)subchronic范式(30毫克/公斤ip 5天)。开始注射三天前MPTP药物或PBS,剂量动物收到每日口服车辆(Neobee油;光谱化学)或3、10个或30毫克/公斤的LSN。LSN和车辆剂量注射之前做8小时MPTP药物和PBS。每天测试神经保护功效,治疗C57BL / 6小鼠注射最后MPTP药物管理,持续了21天后,测试激活,ARE-hPAP老鼠牺牲了上届政府后七天。小鼠注射效果的LSN MPTP药物代谢进行了评估安乐死15分钟或90分钟后注射剂量的MPTP药物(天30毫克/公斤,LSN i.p)和八小时后(30毫克/公斤)或安慰剂治疗。信使rna表达的时间评估是评估在小鼠安乐死24小时,72小时,或过去的注射剂量的MPTP药物后21天,上次治疗后24小时的LSN(30毫克/公斤)或安慰剂。在每个实验中,小鼠被有限公司₂吸入。

免疫组织化学实验,动物与冰冷的生理盐水灌注transcardially其次是4%多聚甲醛(PFA);他们的大脑被提取,postfixated PFA的24小时4%,然后转移到分级蔗糖。大脑被削减的滑动切片机40μ米部分,储存在−20°C冷冻保护剂溶液直到染色。

生化和RT-qPCR分析灌注动物transcardially冰冷的生理盐水;大脑提取后,腹侧中脑和纹状体是手工切割和存储在−80°C到处理。

2.2。药代动力学分析LSN862

确定系统和大脑接触LSN862 C57BL / 6小鼠口服接种LSN862 5毫克/公斤。剂量悬架准备汽车组成的1% CMC, 0.5% SLS,聚维酮0.085%,0.05%道康宁消泡剂1510年的纯净水。口服后,全血和脑样本收集的测量等离子体浓度和大脑从3老鼠每计算为0.25,0.5,1、2、4、8、12、24、48小时postdose。等离子体是通过离心后全血和脑样本收集的整个身体与大约10毫升生理盐水灌注。样本储存在大约−70°C,直到被分析使用分析LC / MS / MS法。

2.3。免疫组织化学

日冕的大脑部分被用于免疫组织化学染色(如前所述18,28]。短暂,内源性过氧化物酶活性被0.1米高碘酸钠20分钟的孵化。后分钟洗在PBS + 0.05% Triton-X(稀释媒体),背景染色被与一个小时孵化三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐(TBS)解决方案包含3%正常血清,2%牛血清白蛋白,0.05% Triton x - 100。主要抗体的部分被孵化24小时在室温下,培养在生物素化的二次抗体1小时(1:200;向量的实验室,伯林盖姆,CA,美国)。后分钟洗稀释媒体,部分被放置在亲和素生物素(ABC,“精英”装备,矢量实验室)的基质75分钟。部分被洗的0.1米咪唑醋酸缓冲/ 1.0米,pH值7.4,然后反应在chromagen溶液含有0.05% 3、3′H -diaminobenzidine和0.05%₂O₂。抗体使用包括酪氨酸羟化酶(TH 1: 1000;美国微孔,Billerica的),鼠标抗体cd11b (MAC-1;1:1000;AbD Serotec,牛津大学,英国)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP);1:1000;DakoCytomation斯特鲁普、丹麦)。相邻的部分也被染色和尼氏小nigral神经元的一般形态进一步评估和量化。

2.4。光密度量化

TH的光学密度(OD)免疫反应(ir)纤维在四个等距的日冕部分量化在腹侧,内侧,背侧纹状体的部分用NIH ImageJ软件。大脑图像捕获4000年尼康超级Coolscan ED电影和幻灯片扫描仪。ImageJ校准使用平板电脑的一步,灰度值转换为OD单位使用Rodbard函数,并为每一个感兴趣的领域的平均OD被记录。

免疫反应性MAC-1和GFAP量化在四个等距的日冕部分的黑质。大脑图像捕获使用尼康E800显微镜配有相机和评估使用J NIH图像软件。图像被转换为一个8位灰度和校准使用平板电脑。上面的面积阈值确定使用ImageJ的三角函数,减去背景,和上面的面积阈值被记录。

2.5。Stereological细胞计数

TH-ir总数和尼氏小染色神经元的左翼和右翼物质nigrae计算使用无偏stereological细胞计数方法(29日- - - - - -32]。从每个主题包含四个等距的部分黑质被用于分析。的光学解剖器系统由计算机辅助图像分析系统包括蔡司Axioplan 2光学成像显微镜(卡尔蔡司,Inc .) hard-coupled MAC5000高精度计算机控制- - - - - -- - - - - -机动阶段和MicroFire CX9000相机(美国达光电、Goleta CA)。神经元计数进行使用立体声调查员Version 7.5(美国VT MicroBrightField,威利斯顿)。列出的黑质是在低放大倍数(2.5 x)。TH-ir总数和尼氏小积极nigral神经元计数框架内是计算使用100 x油浸的目标。定义的黑质限制尾mammillary身体吻侧边缘,大脑脚的罕见和外侧,和第三颅神经内侧延伸出来。是使用的网格大小μm,μ60 m和计算帧大小μm×60μ在20米。神经元只数μ米高度的组织,保护高度2μ顶部和剩余μ每个部分的底部。

2.6。高效液相色谱分析

纹状体的多巴胺(DA)和DA代谢物水平,DOPAC, HVA测量使用高效液相色谱电化学检测(HPLC / ECD)。样本的重量,均质在冰冷的高氯酸(0.3米),和离心机,200μL整除的样本进行了分析使用电量电化学检测器(Choulochem三世;ESA,切姆斯福德,妈,美国)。保卫细胞是设置为250 mV。电极1和2被调整−250 mV和+ 270 mV,分别。色谱分离是一个列上执行,250毫米×4.6毫米,在室温下运行(美国贝克曼,印第安纳波利斯)。75毫米的流动相由磷酸二氢钠,1.7毫米1-octanesulfonic酸,100μ三乙胺的L / L, 25岁μ米的EDTA, 10%乙腈,并调整到3.0磷酸。这些解决方案是在高效液相色谱级水,准备0.22过滤μm膜在真空下,注入0.6毫升/分钟的速度,生产68酒吧的背景压力。二百微升整除注入了自我注射器与冷却模块设置在4°C。DA的含量、DOPAC HVA在实验样品测定用标准曲线由注射已知的每个物质的浓度。

2.7。免疫印迹分析

纹状体TH蛋白质水平量化通过免疫印迹分析(33]。纹状体蛋白质提取物ARE-hPAP老鼠在冰冷的均质溶解缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4;150毫米氯化钠;1毫米EDTA)和补充了一个完整的迷你,EDTA-free蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板(罗氏应用科学、基底、瑞士)。上层清液在离心收集并存储在−80°C到分析。蛋白质浓度测定采用BCA分析工具包(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。20到30μ每道克蛋白质被加载到10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide电泳凝胶和转移到PVDF膜(美国微孔,Billerica的)。PVDF膜被封锁5% BSA Tris-buffered盐水渐变20 (TBST)在室温1小时然后孵化主要抗体(兔多克隆anti-TH;Chemicon Billerica,马;1:2000年,鼠单克隆anti-beta-actin(马剑桥Abcam 1: 5000年,美国)一夜之间在4°C。PVDF膜然后洗3×TBST紧随其后的是室温1小时孵化在TBST 1: 10000稀释辣根过氧化物酶标记anti-rabbit或anti-mouse(美国新泽西州Amersham,皮斯卡塔韦)。在TBST洗涤之后,乐队是可视化使用增强化学发光(超级信号西方“微小”;美国皮尔斯,罗克福德,IL)和信号暴露Hyperfilm(美国新泽西州Amersham,皮斯卡塔韦)。凝胶乐队量化使用ImageJ beta-actin (NIH)和规范化。

2.8。缺氧活性和MPP⁺检测化验

注射的潜在调制MPTP药物代谢的LSN被量化评估在纹状体组织缺氧和MPP的活动⁺水平(34]。对于缺氧活动,组织处理使用Amplex红单胺氧化酶酶免疫分析法工具包(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的说明一个96孔板和测量荧光板读者(分子器件、光谱马克斯平方米,桑尼维尔,美国)。MPP的⁺化验,striata均质在9卷5%三氯乙酸。五十μL(均质组织注入HPLC-UV探测器(模型没有。168年贝克曼)和反向阶段C18柱(毫米)用流动相组成的9 KH卷50毫米₂阿宝₄和1体积乙腈,pH值调整到3.2。流量被设定为1.8毫升/分钟使用溶剂输送泵。所有设备都连接到一台电脑,和样品被检测运行和数据分析软件(贝克曼、新、系统黄金,印第安纳波利斯,美国)。

2.9。hPAP活动分析

ARE-Nrf2通路的激活以ARE-hPAP记者老鼠量化的碱性磷酸酶活性(如前所述)(27]。简而言之,纹状体和黑质蛋白提取细胞溶解为西方墨点法描述。10μL细胞溶解组织了40μL (MgCl TMN(50毫米三,5毫米₂和100毫米氯化钠)有4%的家伙。灭活内生磷酸酶活动,样本加热到65°C 0.2二乙醇胺(DEA)缓冲20 - 30分钟。热失活后,CSPD和翡翠(美国应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)被用作发光底物和增强剂,分别。贝特一个猎户微型板块光度计是用来测量样品在96孔板。值是纠正ARE-hPAP消极的老鼠和规范化的蛋白质浓度。

2.10。实时聚合酶链反应

纹状体多巴胺能和nigral mRNA表达,炎症,抗氧化和其他基因引物的兴趣(见补充表1中列出的细节在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/582809)使用实时定量PCR (RT-qPCR)进行评估。总RNA提取与试剂盒根据制造商的指示(英杰公司公司)和处理RNeasy MinElute清理(试剂盒、Venlo、荷兰)。使用RNA RNA质量和浓度测量与安捷伦2100 6000纳米芯片和分析生物分析仪(美国安捷伦科技,培养)或量化Nanodrop nd - 1000分光光度计(美国数控热科学、威尔明顿)和质量评估与Bio-Rad Experion自动电泳系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。一个μg的RNA (RIN或RQI > 7.7)是reverse-transcribed cDNA使用逆转录系统(Promega,麦迪逊,WI)根据制造商的指示。定量PCR的cDNA进行光周期计480实时PCR(罗氏应用科学、巴塞尔、瑞士)或StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统公司,卡尔斯巴德,加州)SYBR绿色主人混合根据制造商的指示。所有PCR产品量化相对标准曲线。放大的效率被限制在1.8和2.2之间的误差< 0.2。为了确保准确性和精确校准,beta-actin作为内部控制。没有发现显著差异在beta-actin治疗组。

2.11。统计分析

所有的数据被收集和分析调查人员盲目治疗组。对于每一个实验,动物被随机分配到治疗组。方差分析之后,LSD事后成对比较或独立测试是用来评估团体之间的区别。双向方差分析与反复的措施被用来评估RT-qPCR组之间的数据随着时间的推移,其次是LSD事后成对比较。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义的分析。数据意味着±SEM。所有统计数据使用SPSS 18.0版软件进行(美国纽约IBM, Sommers)。

3所示。结果

3.1。LSN862容易穿过血脑屏障

5毫克/公斤后剂量的LSN862在老鼠中,血浆和脑的浓度峰值LSN862发生1小时后剂量。最大的观察到等离子体和脑浓度()13223年和382年ng / mL,分别。这些数据表明系统性暴露LSN862复合穿过血脑屏障。

3.2。多巴胺黑质纹状体神经支配LSN862保存

定性评价TH免疫组织化学显示21天post-MPTP亏损的多巴胺能细胞阳性纤维和nigral MPTP-treated老鼠PBS对照组相比似乎改善LSN(图1(一))。光密度(OD)量化TH免疫反应性的(ir)纹状体纤维证实显著减少MPTP-treated老鼠(图1 (b)),一个重要的保护动物治疗30毫克/公斤的LSN。Stereological TH-ir nigral细胞计数老鼠注射治疗车+ MPTP药物或LSN 3、10和30毫克/公斤注射+ MPTP药物相比显示,TH-ir神经元显著减少车辆+ PBS。对比注射30毫克/公斤LSN + MPTP药物与载体+ MPTP-treated动物证明保护TH-ir nigral神经元的LSN组(图1 (c))。重大的发现nigral注射细胞损失MPTP药物和保存30毫克/公斤的LSN经量化Nissl-stained nigral部分(图2)。

高效液相色谱分析,儿茶酚胺水平在纹状体组织证明MPTP-induced损耗达汽车+ MPTP-treated老鼠相比,PBS控制(图3(一个)),这是保护治疗30毫克/公斤的LSN。MPTP显著降低了纹状体DOPAC(图3 (b))和HVA(图3 (c)车辆)水平+ MPTP-treated老鼠相比,汽车+ PBS控制,但这些代谢物LSN没有显著影响。

3.3。注射LSN862并不影响MPTP药物代谢

我们确认后30毫克/公斤的LSN神经,我们使用这个剂量评估如果LSN效应是由于注射抑制MPTP药物代谢subchronic范式。MPP的高效液相色谱分析⁺水平在纹状体组织获得15或90分钟后(5)注射注射MPTP药物和8小时后的最后(8日)口服LSN车辆和LSN-treated组之间没有显著差异(表1)。同样,缺氧免疫测定纹状体的缺氧没有显示显著差异活动LSN治疗后相比,车辆。

3.4。LSN862影响MPTP-Induced纹状体和Nigral NQO1和Nigral SOD2 mRNA

调制来确定LSN效果相关的氧化应激反应,我们首先评估Nrf2-ARE通路在ARE-hPAP记者老鼠注射治疗MPTP药物或PBS和车辆或30毫克/公斤的LSN。的纹状体TH免疫印迹蛋白质含量(补充图1 (a))显示减少注射在TH MPTP药物样品与改善的PBS LSN剂量相比,这证实了光密度分析相对β肌动蛋白(补充图1 (b))。纹状体含有儿茶酚胺的高效液相色谱法的评估也显示出重大损失的纹状体中儿茶酚胺ARE-hPAP MPTP-treated老鼠PBS控制相比,这是预防与LSN剂量(补充图1 (c) - (1 e))。hPAP水平评估这些老鼠显示MPTP-induced显著降低纹状体(补充图2 (a))和增加nigral hPAP(补充图2 (b)),但是这些改变并不影响LSN治疗。

评估如果LSN被抗氧化剂介导的神经保护效应响应在转录水平,我们评估了纹状体和nigral mRNA的表达抗氧化剂标记(补充表2和3)。NAD (P) H:醌氧化还原酶1 (NQO1)纹状体和nigral mRNA表达显著调节24小时post-MPTP盐水控制相比,只有纹状体水平被30毫克/公斤的LSN减毒。没有观察到显著差异72小时或21天。MPTP诱导显著增加在其他内源性基因受Nrf2-ARE通路,包括谷氨酸cysteine-ligase、催化亚基(GCLC),谷氨酸cysteine-ligase,和修改器单元(GCLM);然而,LSN治疗并不影响他们(补充表2和图3)。

Nigral但不纹状体超氧化物dismutase-2 (SOD2) mRNA水平检测在24 - 72小时,达到21天post-MPTP时组间显著差异(图中被发现4 (b)补充表2和3)。在那个时间点,MPTP-treated呈现显著增加小鼠mRNA表达盐控制相比,哪一个LSN减毒。

3.5。LSN862减毒MPTP-Induced神经炎症

炎症标记物的免疫染色黑质21天post-MPTP显示MAC-1-ir典型的活性小胶质细胞(图5(一个))以及GFAP-ir astrogliosis(图6(一))。多个OD量化比较分析显示,治疗LSN引起存在剂量依赖的相关性显著减少nigral MAC-1-ir动物处理3,注射10日或30毫克/公斤+ MPTP药物相比,汽车+ MPTP-treated动物(图5 (b))。Nigral GFAP-ir也显著减少了30毫克/公斤LSN注射相比,汽车+ MPTP药物(图6 (b))。

纹状体和nigral MAC-1和GFAP mRNA表达被24小时明显MPTP-treated老鼠相比,盐控制和被LSN显著降低。在72小时,MAC-1 nigral水平(但不是纹状体)也显著减少了LSN(图4 (c)),而GFAP纹状体和nigral(图4 (d)LSN)水平均显著降低。21天post-MPTP、纹状体和nigral MAC-1和GFAP mRNA水平降低到接近基底的水平,并没有治疗效果观察(补充表2和图3)。

NADPH的mRNA表达促炎酶亚基gp91phox和p67phox也受到LSN虽然遵循不同的模式(补充表2和3)。显著改变gp91phox纹状体和nigral(图4(一)水平只有发现24小时post-MPTP,当他们与PBS控制相比,达到顶峰,LSN upregulation阻止。纹状体p67phox mRNA水平显著升高21天post-MPTP,减毒的LSN治疗(补充表2)。在黑质内,MPTP-induced增加显著减毒的LSN治疗24和72小时(补充表3)。

3.6。影响PPAR -γ在选择蛋白激酶LSN862剂量

蛋白激酶AMPK和MAPK PGC1诱导激活α,因此,PPAR -γ。纹状体AMPK mRNA提出治疗组之间的差异随着时间的推移(补充表2)。在24小时MPTP-injected小鼠健壮的增加表达减毒的LSN。有趣的是,纹状体AMPK表达也增加在24小时管理LSN PBS-injected老鼠。虽然没有AMPK表达式被发现在72小时差异vehicle-treated老鼠注射了MPTP药物或PBS, LSN增加纹状体AMPK表达MPTP-injected老鼠。21天,治疗组之间没有差异。纹状体MAPK mRNA表达显著增加在saline-injected小鼠接种24小时LSN与vehicle-treated控制。72小时,水平相当于车辆+ PBS控制。黑质,AMPK和MAPK mRNA表达显示无显著变化加班或治疗(补充表3)。

3.7。PPAR -γ和PGC1αMPTP-Induced变化受到LSN862剂量的影响

PPAR -γ(图4 (e))和PGC1α(图4 (f)纹状体)mRNA只观察到的变化,不是在黑质(补充表2和3)。在24小时,PPAR -γmRNA显著调节MPTP-treated老鼠与盐水控制和减少LSN。72小时,水平减少MPTP-injected老鼠和类似PBS控制虽然在PBS-injected发现显著增加小鼠LSN与车辆管理+ PBS控制。纹状体PPAR -γ老鼠注射mRNA在高架MPTP药物治疗LSN但没有明显不同的小鼠注射相比MPTP药物治疗与PBS。在21天post-MPTP,纹状体中没有观察到治疗组之间的差异表达。PGC1αmRNA水平达到24小时MPTP-treated老鼠和盐水控制,LSN减毒。在72小时,PGC1下降的趋势α水平MPTP-treated动物与车辆+接受pbs控件没有达到统计学意义。21天post-MPTP PGC1α表达减少,没有观察到治疗组之间的差异。

4所示。讨论

我们的结果文档三个主要的新发现。首先,口服后小说non-thiazolidinedione部分PPAR -γ注射兴奋剂LSN诱导神经保护存在剂量依赖的相关性对MPTP药物在小鼠黑变性。第二,LSN-induced神经保护的差别与早期对这些胶质反应和氧化应激反应。第三,增加PPAR -γ和PGC1α注射后mRNA表达MPTP药物被LSN改善治疗。

保存nigral TH-ir和尼氏小阳性细胞数量确认治疗LSN增强DA nigral神经元的生存,而不是诱导多巴胺能的upregulation表型(35]。我们选择一个subchronic注射的剂量模式MPTP药物诱发PD的特征模型,在其中nigral细胞死亡发生在旷日持久的主要方式与凋亡机制相比,坏死的神经元死亡观察急性剂量(35- - - - - -38]。三天的预处理的模式一个潜在的治疗药物的剂量,尽管它有限的临床意义,是一个接受给药方案的初始评价小说在啮齿动物(例如,[神经保护策略39,40])。虽然可以认为LSN延迟,而不是防止细胞死亡,这是不太可能在这里的动物在我们的研究中被牺牲掉了最后三周后注射注射MPTP药物,和MPTP-treated控制nigral,多巴胺能细胞损失。后续研究开始的LSN剂量注射后MPTP药物的挑战可能会进一步证实LSN的神经保护属性。

注射LSN似乎并没有引起神经保护影响MPTP药物的新陈代谢。颅内缺氧MPTP毒性取决于其转换到其代谢物MPP⁺(41]。我们发现MPP和缺氧的活动⁺LSN剂量水平保持不变。我们抽样的可能性存在无法捕获一个LSN效果。我们大脑收集样品在90分钟post-MPTP因为它已经证明,当时MPP点⁺生产达到高峰(34];抽样在15分钟的目的是评估,这是一个更早的一个时间点注射subchronic MPTP药物范式与日常LSN剂量诱导慢性缺氧抑制。也可以认为LSN诱导astroglial功能障碍,而注射了MPTP药物代谢(这些细胞缺氧的主要来源)注射因此减少MPTP药物毒性。然而,这似乎不太可能的组织学评估GFAP-ir以及GFAP mRNA水平的PBS + LSN-treated老鼠相比,PBS +车辆控制差异不显著。虽然奎因和他的同事们(19)报道,PPAR -γ受体激动剂吡格列酮调制的边际产量水平⁺缺氧,Schintu et al。15)没有发现证据表明罗格列酮引起这种效应相关的化合物。这些报告,除了我们的当前数据,建议注射调制的MPTP药物代谢PPAR -γ受体激动剂是一种compound-specific财产。

的瞬态和早期响应NQO1 mRNA纹状体注射nigral表达式MPTP药物和LSN建议Nrf2的部分招聘途径,虽然不是直接激活,因为我们的测试在ARE-hPAP记者hPAP老鼠没有LSN-induced明显变化。这不同于罗格列酮、吡格列酮,内生PPAR -γ受体激动剂15 d-pgj(2),诱导直接激活在肝和肝癌细胞培养和氧肺组织(20.,42,43少),表明LSN神经保护潜在的通过Nrf2途径相比,这些受体激动剂。其他抗氧化应激标记指出改变是线粒体的抗氧化SOD2。其nigral mRNA表达水平在21天post-MPTP达到顶峰,被LSN抑制,表明氧化应激可能是减少早期神经毒素的LSN挑战后,因此诱导减少SOD2响应超时。我们保守使用动物(这是证明了在小每组)可能限制了检测的变化由于注射对MPTP药物的个体差异性。进一步研究数字以及较高的实验关注直接氧化应激的措施将有助于维护的范围LSN对活性氧产量的影响。

早期的LSN对纹状体的影响和nigral mRNA的表达NADPH-oxidase子单元gp91phox p67phox建议减少氧化应激和神经炎症之间的联系。子单元都在氧化应激和间接措施增加一氧化氮合酶(间接宾语)生产、炎症酶与小胶质驱动ROS和没有产品8]。此外,nigral gp91phox mRNA已被证明是调节注射对MPTP药物,并抑制NADPH-oxidase复杂与减少炎症(9]。

LSN大脑炎症反应的影响发现早在24小时后注射注射MPTP药物。神经保护和减少炎症之间的关系观察与LSN计量与报告的其他PPAR -是一致的γ以及PPAR -α受体激动剂。罗格列酮政府MPTP-treated丙磺舒诱发小鼠解剖和功能神经保护而降低活性CD11b小胶质细胞(15,44]。吡格列酮剂量MPTP-treated老鼠也是神经保护和减少CD11b小胶质细胞,以及硝基酪氨酸(16,17),在帕金森病猴模型中,神经保护与降低CD68-ir小胶质细胞(18]。的抗炎活性PPAR -γ受体激动剂进一步证实在啮齿动物模型中颅内注射脂多糖诱导的神经炎症,其中吡格列酮剂量诱导显著减少nigral小胶质细胞(45]。PPAR -α受体激动剂palmitoylethanolamide(豌豆)也显示功能和神经解剖学的注射预防MPTP药物与降低伊诺有关硝基酪氨酸(26),这表明在我们的范式LSN激活PPAR -α可能是导致神经保护效应。虽然在我们的研究中MAC-1 nigral mRNA表达显示在21天post-MPTP治疗组之间没有差异,我们发现MAC-1减少蛋白质的免疫反应性。可能是这种差异可能与转译后的修改(46,47]。剂量依赖性的结果减少MAC-1 nigral反应和mRNA表达结合降低NADPH亚基gp91phox mRNA水平表明,LSN可能抑制进气阀打开,与先前的报道PPAR -一致γ和PPAR -α伊诺的调制16,26,48]。

标记的微注射后24小时MPTP药物和astrogliosis都是礼物。这不同于以前的报告在老鼠注射一种急性MPTP药物模型(8)描述增加nigral小胶质招聘前星形神经胶质。最有可能的是,我们subchronic模式隐藏了微分时间效应。注射的subchronic范式MPTP药物中毒也可能影响响应LSN治疗。当我们发现LSN astrogliosis,差别引起的早期对这些先前的研究与吡格列酮剂量注射急性MPTP药物模型中发现影响局限于黑质(17]。然而,在subchronic范式(16),显著减少在纹状体和nigral GFAP阳性细胞在吡格列酮+ MPTP-treated老鼠被报道。此外,在慢性给药模式+丙磺舒,罗格列酮减毒nigral,但不是纹状体,GFAP-ir细胞(15]。应该注意的是,在其他神经退化的模型如ALS,吡格列酮减毒astroglial响应(49类似于我们的研究结果与LSN。有趣的是,神经保护,PPAR -α受体激动剂豌豆也与减少nigral GFAP蛋白(26post-MPTP] 8天。这表明LSN影响星形胶质细胞可能与结合PPAR -γ和- - - - - -α活动。这可能是认为LSN astroglial生成障碍;然而,它不太可能没有发现差异在纹状体和nigral信使rna或GFAP-ir细胞之间的LSN +接受pbs老鼠和车辆+接受pbs控制。

纹状体,但不是nigral, PPAR -γ和PGC1α注射mRNA表达显著影响MPTP药物和LSN治疗。中枢神经系统的映射PPAR -γ啮齿动物的表情已确认其在纹状体和黑质50,51]。然而,半定量的分析描述了一个更健壮的纹状体与中脑相比,表明变化更可检测领域提供更加丰富的表情。此外,PPAR -α面前只有被证实在啮齿动物黑质(50,51]表明,也许这个通路的激活调制效果。应该注意的是,类似于PPAR -γ和PGC1α,AMPK和MAPK mRNA表达的变化只是观察到纹状体,可以解释为这些激酶与后者的激活和能量代谢52- - - - - -56]。

这一发现,纹状体PPAR -γ和PGC1αmRNA表达增加早期注射后MPTP药物和LSN减毒这mRNA表达21天post-MPTP PGC1提出质疑α成功的神经保护水平。在PD的大脑以及帕金条件基因敲除小鼠的大脑中(57]帕金互动衬底(巴黎;抑制PGC1 ZNF746)已被证明α和促进神经退化,这表明PGC1α需要多巴胺神经元的生存。PGC1α是刺激线粒体生物起源和呼吸的,ROS增加触发PGC1吗α归纳。MPTP抑制线粒体复杂我增加活性氧,进而增加PGC1α水平,看似PPAR -γ。在注射一种急性MPTP药物模型中,PPAR -γ信使rna表达post-MPTP 7天达到峰值,随后下降到接近基底的水平(58]。在慢性模型注射了MPTP药物和丙磺舒,PPAR -γ是调节3天post-MPTP [44]。此外,PGC1α零老鼠更容易MPTP-induced DA细胞死亡比野生型小鼠(59]。然而,持续的过度PGC1α在大鼠黑质多巴胺黑质纹状体功能、基因转移受损,当过表达在高水平,PGC1α诱导神经退化(60]。在我们的研究中LSN没有废除PGC1α注射对MPTP药物但避免高峰和促进其正常化加班,可能通过刺激SOD2等主要ROS-detoxifying酶。这些数据表明,nigral细胞生存取决于PGC1生理水平α,而不是高的LSN PPAR -部分的影响γ及其共激活剂(除了抗炎和抗氧化压力属性)可能导致nigral神经保护。

虽然我们观察到的变化的upregulation PPAR -γ和PGC1α在平行于胶质激活LSN注射+ MPTP药物治疗老鼠,我们不能明确状态是否LSN PPAR——的影响γ相关或无关(61年)和部分PPAR -什么角色γ激活与罗格列酮相比,这种调制;LSN PGC1 66%招聘有效性α(25]。多项研究表明,抑制NF等抗炎作用κB (62年,63年2),磷酸酶(64年],ERK [65年),和物66年)是独立于PPAR -介导的γ。理想情况下,这个问题可以通过复制研究PPAR -回答说γ零老鼠,这些老鼠embryonically是致命的。另一种解决方案是用选择性PPAR - coadminister LSNγ拮抗剂如GW9662为了阐明PPAR -γ依赖项(67年)或用siRNA可拆卸的PPAR -γ(68年]。

这部小说non-thiazolidinedione部分PPAR -γ未来临床应用作为一个LSN可能存在优势抗糖尿病的治疗以及多巴胺黑质纹状体系统的候选人的神经。发现,在动物模型II型糖尿病,LSN诱导的葡萄糖和脂质降低效果与罗格列酮(25),结合我们的演示LSN-induced神经保护与降低小鼠的神经炎症PD模型,表明纯PPAR -γ活动不需要代谢或神经保护功效。虽然thiazolidinediones PPAR -γ受体激动剂大大受益的糖尿病患者,也表明神经保护属性相关的抗炎在PD动物模型,出版物有害的心血管效应与罗格列酮(20.- - - - - -22),膀胱癌吡格列酮(69年)挑战他们的重新定位疾病这种神经退行性疾病的修改策略。新报道了吡格列酮与肿瘤形成,(70年)和临床试验评估其神经保护潜在的早期PD是目前正在进行的(http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01280123)。此外,罗格列酮最近的风险评估(71年]。然而,停留在两个化合物的安全担忧,使LSN LSN-like部分或双重受体激动剂化合物有吸引力的替代品。

后续研究需要推进LSN神经保护功效的描述和评估调制的PPAR -γ和PGC1α影响多巴胺nigral细胞生存和PPAR -α激活导致其功效。他们应该包括分析神经保护作用的LSN在周围神经系统中,当自主神经功能障碍发生在许多PD患者。此外,进一步的研究是必要的评估潜在的毒性脆弱周边器官,如膀胱评估LSN安全。

总之,我们的结果表明,小说non-thiazolidinedione PPAR -γ受体激动剂LSN862引起氧化应激和炎症的神经调制的相关特征,可以有利于早期PD。进一步研究LSN安全性和有效性是保证继续对这种化合物的临床翻译。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

确认

作者谢谢Viktoryia Bondarenko案博士和维维安蒋介石的优秀的技术援助,科琳娜博士汉堡,她建议在RT-qPCR过程,和谢尔盖Przedborski博士为他注射建议MPTP药物代谢实验。作者感谢杰森·t·约翰逊先生,约翰·t .先生心血来潮和Kalpana商人博士(礼来制药厂有限公司)为他们的援助LSN药物动力学。支持本研究提供的迈克尔·j·福克斯帕金森氏症研究基金会(滨e . Emborg),格兰特T32 AG000213(克里斯汀·r·Swanson) NIH-NIA和格兰特P51RR000167 / P51OD011106 NIH-NCRR威斯康星州国家灵长类动物研究中心,威斯康星大学麦迪逊分校。礼来公司优雅LSN862提供。资金来源没有参与研究设计、数据收集、分析、解释。

补充材料