文摘

过氧物酶体proliferator-activated受体-γ(PPARγ)据报道,减少炎症和减弱肝脏纤维化。在这项研究中,我们调查了PPAR的影响γ在20毫克/公斤引起的肝损伤伴刀豆球蛋白(Con)。老鼠管理PPAR的三种类型之一γ配体(吡格列酮、ciglitazone troglitazone) 1周,和血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平在20 h后Con PPAR注入明显升高γligand-treated老鼠。此外,血清ALT水平Con PPAR的注入γhetero-knock-out老鼠(PPARγ^{+ /−}老鼠)低于野生型小鼠(WT老鼠)。末端转移酶的dUTP尼克结束标记(TUNEL)显示广泛的欺诈引起的肝损伤的pioglitazone-treated老鼠。电泳迁移率改变分析(EMSA)显示激活的易位的核因子- (NF)κB,这是一种抑制细胞凋亡,肝细胞的细胞核在pioglitazone-treated抑制小鼠欺诈后注入。在这项研究中,我们表明,PPARγ加剧了反对A-induced肝损伤通过抑制NF -的易位κB核,从而抑制肝细胞凋亡的抑制。

1。介绍

PPARs是核受体超家族的成员(1]。三个同形像指定PPARα,PPARβ/δ,PPARγ描述了在哺乳动物2]。PPARs形式与视黄素X受体(RXR),形成和PPAR-RXR形成,绑定到一个配体时,改变其构象和绑定的DNA PPAR响应元素,导致基因转录(3,4]。PPARγ在脂肪组织表达、心脏、肾、骨骼肌、肝脏及其他器官PPAR吗γ配体改善胰岛素抵抗和炎症通过增加血清脂联素水平(5- - - - - -7]。因此,thiazolidinediones噻唑烷二酮类),PPARγ配体,广泛用于治疗2型糖尿病(DM)。

肝损伤是由各种因素如病毒感染、自身免疫反应和代谢紊乱。最近,PPARγ受体激动剂得到关注与肝脏疾病的治疗。PPARγ据报道,减少肝脏炎症减少肿瘤坏死因子的表达吗α(肿瘤坏死因子-α)[8,抑制NF -的易位κB到核(9]。此外,PPAR通路抑制肝星状细胞的纤维发生的行为,减弱肝脏纤维化在活的有机体内(10,11]。PPARγ受体激动剂已报告是有用的在小鼠和人类与非酒精性脂肪肝(12- - - - - -14),PPARγ促进脂肪细胞分化[15),增加甘油三酯储存在脂肪细胞,减少脂肪酸的肝脏(9]。然而对其他肝脏疾病的影响尚未研究。

在这项研究中,PPARγ配体和PPARγ^{+ /−}老鼠用来证实PPAR的影响γ在反对A Con引起的肝损伤诱发严重的肝炎小鼠通过激活T细胞,引发细胞凋亡16,17]。

2。材料和方法

2.1。动物实验

八周大男男性PPAR WT BALB / c小鼠和八周大γ^{+ /−}在BALB / c小鼠背景从克丽购买日本,inc .)和杰克逊实验室(美国我巴尔港),分别。所有的老鼠都维护在filter-topped笼子热压处理过的正常食物的饮食含有22%的蛋白质,6%的脂肪,碳水化合物47%。在反对A-induced肝炎模型中,反对(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国;20毫克/公斤)静脉注射(注射)注入老鼠。首先,老鼠WT (老鼠)美联储控制食物或食物补充PPAR的两种类型之一γ配体(ciglitazone(100毫克/公斤)和troglitazone(150毫克/公斤)随意后1周和牺牲20 h Con注入。这些与PPAR治疗剂量和持续时间γ受体激动剂选择基于试点实验中演示的有效性(数据没有显示)。随后,PPARγ^{+ /−}老鼠接受控制食物或pioglitazone-supplemented chow和牺牲20 h后反对注入。最后,探讨PPAR的效果γ激活的NF -κB引起反对,被控制或pioglitazone-supplemented chow WT老鼠和牺牲在不同时间点(0.5 h, 1 h、3 h, 6 h,和8 h)反对一个注射后,获得核蛋白质。批准的动物协议横滨市立大学医学院实验动物保健和使用指南。

2.2。生物化学

血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平是衡量当地实验室临床检查(SRL有限公司、东京、日本)。

2.3。肝脏组织学

肝脏标本固定在缓冲甲醛(10%)和嵌入石蜡。石蜡切片是准备在5μ米厚度和苏木精和伊红染色())。

2.4。检测细胞凋亡

肿瘤细胞凋亡染色使用TUNEL染色设备,根据制造商的说明(Wako纯化学、日本大阪)。总之,石蜡切片和20消化μ克/毫升的蛋白酶K(豆类、志贺、日本)在室温下15分钟和末端转移酶的酶反应为60分钟37°C。部分被孵化与antidigoxigenin共轭在室温下30分钟,其次是孵化diaminobenzidine解决方案。

2.5。电泳迁移率改变分析(EMSA)

NF -κB绑定由EMSA决定。我们收集肝组织标本在不同时间点(0.5、1、3、6和8 h)反对后注射。核蛋白质提取物(10μg)准备使用核提取工具包(BizScience,大阪,日本),根据制造商的指示。寡核苷酸探针22日英国石油公司,双链(5′-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3′)和endlabeled生物素(σ化学、圣路易斯、钼)。dna蛋白质复合物解决在80 V taurine-buffered 1 h,本地6%聚丙烯酰胺凝胶supershift(4%)和涂抹到一个带正电的尼龙膜(σ化学,圣路易斯,密苏里州)。立即转移DNA交联膜的紫外透照器配备312海里的灯泡和检测使用辣根peroxidase-conjugated链霉亲和素(Light-Shift化学发光EMSA工具包),根据制造商的指示。

2.6。统计分析

数据意味着±SD。两组间的差异都使用未配对的双尾学生的评估以及;值< 0.05被认为是表示的意义。所有统计分析使用Microsoft Excel和SPSS 16.0统计软件包(SPSS,芝加哥,IL)。

3所示。结果与讨论

评估肝损伤的程度,我们分析了时间的变化后的血清ALT水平Con注入。出乎意料,血清ALT水平在吡格列酮-(30毫克/公斤)明显高于治疗小鼠相比,在nonpioglitazone-treated老鼠注射(图20 h后反对1(一))。nonpioglitazone-treated小鼠的存活率为100%,而吡格列酮的——(30毫克/公斤)治疗小鼠30% 20 h Con注射后(图2)。随后,我们进行了组织学检查评估的程度Con A-induced肝损伤在20 h后反对在小鼠注射治疗,而不是30毫克/公斤吡格列酮治疗。组织病理学检查的组织部分沾)透露,在pioglitazone-treated小鼠肝损伤是更广泛的价格相比nonpioglitazone-treated老鼠(数字3(一个)和3 (c))。确定凋亡细胞的存在和程度,我们执行TUNEL分析。更多TUNEL-positive肝细胞可以在肝脏中发现部分pioglitazone-treated老鼠比对照组小鼠(数字3 (b)和3 (d))。TUNEL阳性细胞的数量/ 100 pioglitazone-treated老鼠的肝脏细胞还要高的价格相比nonpioglitazone-treated小鼠的肝脏(与,)。从这些结果,我们推测,PPARγ可能会加剧反对A-induced肝损伤的加剧肝细胞凋亡。然后,我们使用两个PPARγ配体(ciglitazone和troglitazone)确认PPAR的效果γ。所有的三个PPARγ配体产生的显著增加小鼠血清ALT水平比未经处理的小鼠(水平数据1(一),1 (b),1 (c))。这个结果表明PPARγ配体加剧反对A-induced肝损伤无论种类。

评估PPAR的效果γPPAR在肝损伤,我们使用γ^{+ /−}老鼠。使用外源PPAR的原因γ^{+ /−}老鼠是这个基因导致胚胎杀伤力的双重淘汰赛。反对A-induced PPAR肝损伤并不广泛γ^{+ /−}老鼠一样的价格相比WT老鼠(图4)。这一结果表明,内生PPAR参与的可能性γ介导的通路Con A-induced恶化的肝损伤。

确认pioglitazone-treated细胞凋亡和nonpioglitazone-treated老鼠A-injection监狱之后,我们分析了NF -的表达κB这是一个已知的细胞凋亡抑制。确定数量的激活NF -κB我们EMSA执行。激活NF -κB在肝细胞细胞核Con A-injection压制后的肝脏pioglitazone-treated老鼠相比,肝脏的nonpioglitazone-treated老鼠(图5)。这一结果表明,PPARγ抑制NF -的易位κB核,从而抑制肝细胞凋亡的抑制。Maeda等人报道,hepatocyte-specific IKKβ基因敲除小鼠表现出小NF -κB活动极易受Con A-induced肝损伤的肝细胞凋亡(18]。

从这项研究中,PPAR的抑制γ使用PPAR等γ拮抗剂可能减少肝损伤的程度。

4所示。结论

在这项研究中,我们表明,PPARγ配体加剧反对A-induced肝损伤通过抑制NF -的易位κB到细胞核。反对A-induced PPAR的肝损伤γ治疗小鼠代表一个细胞凋亡加剧。PPARγ拮抗剂可能被视为小说候选人治疗肝损伤的加剧细胞凋亡模型。

缩写

PPARγ:	过氧物酶体proliferator-activated受体-γ
非酒精性脂肪肝:	非酒精性脂肪肝病
反对:	伴刀豆球蛋白一
ALT:	丙氨酸转氨酶
WT老鼠:	野生型老鼠
TUNEL:	终端deoxinucleotidyl转移酶dUTP尼克结束标签
EMSA:	电泳迁移率改变分析
尼克-弗瑞:	核转录因子
RXR:	类维生素a X受体
服用tzd:	Thiazolidinediones
糖尿病:	糖尿病
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子α
):	苏木精和伊红。

承认

作者感谢Machiko Hiraga技术援助。