文摘

主要的脂肪形成的转录因子PPAR具有高亲和力2 4-TZD Thiazolidinedione家庭成员insulin-sensitizing化合物用作脂肪形成的代理。我们评估2,4-TZD对牛生长和PPAR组织表达的影响。17利穆赞公牛(18个月;350公斤体重(BW))被分配到2治疗:控制和2,4-TZD(70毫克/公斤体重),美联储直到公牛达到500公斤。他们重,他们的血液样本。DNA、RNA和蛋白质测定肝脏;骨骼肌;皮下(SC)、网膜的perirenal脂肪组织()来确定蛋白质合成率和细胞大小。PPAR mRNA的表达在肝脏和肌肉(PPAR测量,,)和SC脂肪组织(实时PCR)。没有发现显著差异()体重增加、天饲料和胴体品质。肌肉合成更大的控制();细胞大小与2大,4-TZD ()。PPAR,,表达式2,4-TZD肝脏低(比肌肉)。PPAR没有发现差异γ在拟声唱法mRNA的表达。结果显示2,的潜在使用4-TZD肉牛的饮食,因为它提高了分化,肝脏和肌肉脂肪酸氧化,因此,可能会提高能源效率。

1。介绍

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR)配体依赖性转录因子是属于核激素受体超家族。三个同形像已确定在脊椎动物和哺乳动物:PPARα或NR1C1;PPARβ/δ或NR1C2,也叫做NUC-1或FAAR;PPARγ或NR1C3。这些受体表现出不同的组织分布和功能,在某种程度上,不同的配体特异性。从力学上看,它们形成与类维生素a X受体(RXR)形成并激活DNA转录被绑定到一个特定的元素,称为过氧物酶体扩散国的反应元素(PPRE),监管地区的各种各样的基因编码的蛋白质参与脂类代谢(1和能量平衡2- - - - - -4]。PPAR噻唑烷二酮类)γ受体激动剂,具有抗糖尿病的临床疗效,主要在脂肪组织(通过他们的行动3]。TZD的影响脂肪分化已经证明通过修改脂肪组织沉积,增加肌肉内(IM)脂肪的肉类动物(5,6];另一方面,Michalik et al。3提到一些TZD可能作用于不同的PPAR,尤其是PPARα。

大理石花纹或IM脂肪与肉类质量呈正相关(7因为牛肉温柔和适口性的改善(8]。IM脂肪的发展主要取决于动物的品种、性别、年龄、和营养9,10]。因此,研究了脂肪组织及其代谢调节,以提高在饲养场肥育肉特征。

观察结果表明,牛肉的质量和价值的尸体可以通过这些化合物的利用率增加的倡导者大理石花纹,此外,他们可能会改善他们的能源效率。

2。材料和方法

2.1。动物、治疗和饮食

程序涉及动物实验动物保健机构委员会批准的大学根据墨西哥(自治)11]。8公牛作为控制(Cs)和9治疗组(T),美联储2,4-TZD(70毫克/公斤体重);动物的剂量调整的总重量;这是根据以前的药理和临床研究在人类治疗口服罗格列酮(8毫克/天),展示了重要的葡萄糖代谢的变化在胰岛素抵抗的治疗,因其对肌肉和脂肪组织的影响12,13]。为了测试2,4-TZD实用方法,我们决定使用给人类和小鼠口服;到目前为止,这是第一个研究使用它在反刍动物的食物;其他研究已经使用静脉注射管理(14]。动物被分配到治疗在地面完全随机设计和安置两两支钢笔。在实验开始之前,他们对牛呼吸道疾病免疫复杂(BRDC)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV),和钩端螺旋体病(Cattlemaster 4;美国辉瑞动物保健、Exton PA),注射维生素A, D和E (Vigantol正面;默克公司,达姆施塔特,德国),植入140毫克trenbolone醋酸和20毫克17β雌二醇(Revalor;Intervet /先灵葆雅动物保健),防止体外寄生虫(Tiguvon正确的、拜耳、德国)。参与实验的动物> 90天是reimplanted和注入的维生素。的饮食包括饲料(紫花苜蓿干草干物质(DM) 80%)和补充(89% DM、CP 15%;2.8 Mcal ED /公斤DM), 2: 1关系,分别。提供数量是基于3%的BW(运用:1.5 Mcal /公斤; ENg: 0.9 Mcal/kg, 14.9% protein). Feed was provided twice a day. Treated animals (T) received 2,4-Thiazolidinedione 90% (2,4-TZD) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) in a dose of 8 mg/70 kg BW per animal [12在补充)混合。动物血液单独称重和取样从尾骨的静脉(10毫升)在28天的间隔在为期196天的研究;血液采集和重量被接受人生的第一顿饭之前(禁食)抽样的一天。真空采血管中收集的样本管(湖南、中国)无抗凝血剂。他们离心机(在13000 rpm)和血清恢复和冻结在−70°C到分析。

2.2。屠宰、取样和分析

动物达到了500公斤的重量,C和T动物被送往附近的一个联邦inspection-type屠宰场(TIF)在墨西哥联邦检查法律操作15,16]。样品肝、肌肉和脂肪组织从网膜的perirenal,和SC仓库解剖,收集CryoTubes (Nunc低温管瓶;鲁开德、丹麦),在液态氮冷冻,储存在−70°C进行后续分析。尸体被冷冻在−2°C 32-36 h和质量和产量的成绩进行评估,评估包括以下几点:外部的脂肪厚度;longissimus dorsi肌肉(LM)地区在7日和8日肋;肉和脂肪颜色;大理石花纹,根据北美肉类加工商协会(NAMPA) [17)标准。

2.3。总RNA和DNA隔离

总rna从所有组织样本(100毫克)使用1毫升的试剂盒纯化试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。RNA在40筛选了μL diethylpyrocarbonate——(DEPC)处理过的水通过分光光度计和量化;样品被储存在−70°C,直到进一步的分子生物学实验。DNA提取(1毫升/ 50毫克的组织)DNAzol试剂(英杰公司)是根据制造商的协议和筛选了50μL(8毫米氢氧化钠(氢氧化钠)。分光光度法进行阅读(纳米降1000;热费希尔科学,Inc .)、美国德威尔明顿)和样本存储在−20°C。RNA完整性被琼脂糖凝胶电泳验证(Seakem LE琼脂糖大我,美国)。

2.4。总蛋白隔离

从组织中提取蛋白根据加西亚和菲利普斯(18]。提取解决方案包含以下:1米(三羟甲基氨基甲烷摩尔液L⁻¹),0.1 M EDTA(摩尔L⁻¹),1 M氯化钠(氯化钠),0.1%的蛋白酶抑制剂鸡尾酒;叠氮化钠0.5% (NaN₃)。一个500μL提取解决方案+ 50毫克组织孵化一夜之间在5°C下风潮。随后在13000 rmp离心10分钟进行获得总蛋白,由布拉德福德的测定[spectrophotometrically决定19](惠普安捷伦8453紫外可见(595海里))白蛋白标准曲线。

2.5。提取2,4-TZD从组织

拔牙2、4-TZD从组织样本(250毫克)进行了使用500年μL 20% KOH甲醇在65°C 45分钟;然后,添加了2毫升的乙醚和两个同等体积的水洗液进行去除KOH。上阶段是氮气氛下蒸发;残留的流动相溶解在铵acetate-acetonitrile和转移到瓶20.]。

2.6。提取2,4-TZD集中

为了确保2的存在,4-TZD浓缩饲料,我们进行了高效液相色谱法(HPLC)分析。5克和7.5毫升的萃取溶液(己烷:丙酮:酒精:甲苯、10:7:6:7)25毫升容量瓶,1分钟手动摇,一夜之间在黑暗的条件下(16 h)。随后,KOH(0.5毫升)增加了40%,动摇了,充满了Na₂所以₄为10%,并保持在黑暗中再次1 h。提取(7毫升)放入猎鹰管进一步氮蒸发。残留是溶解在流动相acetate-acetonitrile铵,转移在瓶由高效液相色谱分析20.]。

2.7。2,测定4-TZD通过高效液相色谱法(HPLC)

色谱法分离和测定的高效液相色谱进行4-TZD 1046(惠普)和荧光检测器。利用5进行了分离和测定μm C18柱(250×4.6毫米)(美国Phenomenex托兰斯,CA) [21]。2的参考标准,使用4-TZD(σ)。流动相是由乙酸铵(美国新泽西州费舍尔科学公司,Fairlawn) 0.01年乙腈高效液相色谱试剂级(SOLUSORB j.t贝克;Mallinckrodt Baker Inc .)、巴黎,肯塔基州,美国),和pH值调整到8.0的比例65:35 v / v,所描述的Muxlow et al。22]。股票的解决方案2,4-TZD准备在1毫克/毫升的浓度稀释剂的流动相。血浆样本(500μL)准备根据他et al。23];这些都是与500年稀释μL(乙腈和混合物在涡流搅拌3分钟,在13000转离心10分钟。上阶段在氮气氛下蒸发。这是重组和流动相转移到一个锥形瓶中插入插入(100μL)(琥珀autosampler瓶;美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。色谱分离进行了室温下的流量0.7 mL / min,荧光检测器波长269纳米。注射是由重复50μL的样本。

2.8。量化的PPAR实时PCR

为了量化PPAR表达肝脏,肌肉,和SC脂肪组织总RNA的互补脱氧核糖核酸分离使用益生元(σ)底漆和上标二世逆转录酶(RT)(表达载体)后,制造商的指示。PPARα引物如下:前5′-AGCCTCTGGCTACCACTACG,反向5′-CATCCCAACTGAAAGGCACT-3′;PPARδ提出5′-GGTGACCCTGCTCAAGTACG-3′,反向5′-ACTTGACGGCAAACTCGAAC-3′;PPARγ提出5′-CCATCATGAAGTGTGACGTTG-3′,反向5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGA-3′-PPIA受雇看家基因:向前5′-AGCACTGGGGAGAAAGGATT-3′,反向5′-AGCCACTCAGTCTTGGCAGT-3′。

样本分析LightCycler(1.5仪器;罗氏诊断、巴塞尔、瑞士);一个LightCycler DNA主人Sybr绿色我由于“快速上手”项目(罗氏)以及使用毛细管配方(σ)。PCR条件PPARα和PPIA基因如下:最初的变性,95°C / 10分钟;第二个变性,95°C / 10秒;退火,56°C / 10秒;放大,72°C / 10秒55周期。PPARδ条件如下:变性,95°C / 10分钟;第二个变性,95°C / 10秒;退火,56°C / 10秒;放大72°C / 8秒,55个周期,和PPARγ变性,95°C / 10分钟;第二个变性,95°C / 10秒;退火,58°C / 10秒;放大,72°C / 8秒55周期。由重复的样本进行了分析;确定目标基因的相对表达,他们与参考基因采用方法。

3所示。统计分析

动物是按体重在一个完全随机设计两个治疗(控制C和2、4-TZD T)和四个复制。胴体产量,LM肋眼牛排,和脂肪厚度与邓肯的测试();DWG,天饲料和初始和最终活重线性回归分析进行了测试。分析了合成和细胞大小与最小二乘方法(LS方法)的过程。所有数据分析统计软件SAS系统包(24]。

4所示。结果

4.1。生长性能

没有发现差异(DWG)治疗,天饲料,初始和最终活重、胴体产量,LM肋眼牛排,或脂肪厚度(表1)。

4.2。胴体质量

尸体评估根据NAMPA [17)程序。脂肪和肉的颜色、尸体形态和大理石花纹数据显示治疗之间没有差异。脂肪染色观察两种治疗方法,根据潘通色卡比色系统,是7499年,代表奶油颜色。肉颜色被报告为1805 c两种治疗方法;根据肉的质量标准颜色,色调是在选择和报告标准的尸体。大理石花纹的LM导致nongrade尸体,这说明治疗方法(表都没有脂肪的痕迹1)。

4.3。总DNA, RNA,蛋白质在组织

观察2的影响,4-TZD新陈代谢相关组织,细胞合成和尺寸测量。细胞合成与RNA / DNA比值估计,与DNA、蛋白质和细胞大小比率(结果如表所示2)。

没有肝细胞合成的差异()和大小()治疗之间的展出。肌细胞合成较低()在动物治疗2、4-TDZ与细胞大小,更高的比(C)的动物。

内脏脂肪组织(网膜和perirenal)和SC组织采样比较脂肪仓库。网膜只显示差异()在细胞合成(T)和(C)之间。Perirenal样本()细胞合成较低(T)(表2),而(T)动物是最大的尺寸。SC组织导致更高的合成()在治疗控制组织,与细胞大小(),这是小(T)。

4.4。2的浓度,4-TZD在血液、组织和补充

血液中没有检测到峰值的治疗与内部标准相比,证明没有相关的化合物2,4-TZD新陈代谢,预计因为血浆的间隙在人类服用tzd治疗后发生3 - 4小时的管理(12]。2,4-TZD残留在肝组织中显著()治疗(表之间的不同3)。关于2的存在,没有山峰4-TZD残渣(T)肌肉样本分析出现在高效液相色谱分析。

4.5。PPAR表达组织

表达式的PPAR肝脏(图1)治疗之间明显不同();所有PPAR表现出更强的控制(C)动物的表达比(T)的治疗。在肌肉中,只有PPARα是不同的((图)治疗2)。在PPAR没有差别γ治疗()(图3)。

5。讨论

5.1。生长性能

Thiazolidinediones与证明是广泛使用的抗糖尿病的药物功效主要是糖尿病管理的替代标记。然而,后者可能在临床结果不总是转化为效益。与TZD有关的在人类中,常见的副作用包括平均体重增加3 - 4公斤TZD前6个月以上的治疗(25,体重增加的速度降低后6 - 12个月(26];然而,在这项工作,没有治疗在屠杀DWG和重量差异观察;这可能是由于不同动物的重量和时间他们在实验;此外人口更高的公牛,我们可能能够看到DWG的增加。关于DM摄入,没有治疗之间的差异被发现();然而,其他作者报道peripartum和产后期间增加奶牛使用2,4-TZD [14,27]。

5.2。胴体质量

虽然我们的数据没有显示治疗之间的显著差异,这可能会以某种方式相关品种的特点。利穆赞牛已知迟到成熟与安格斯和赫里福德28),这意味着我们的公牛可能还没有达到一个适当的体重。差异在成熟的重量与胴体产量、肉品质,和大理石花纹;此外,利穆赞分为低生产商,当谈到脂肪沉积(10]。

5.3。细胞合成和大小

TZD的降糖作用归因于其论争的行动过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγγ),核受体主要表达在脂肪组织,调节脂肪形成。在肌肉和肝脏,这是最重要的定量组织对于胰岛素依赖型葡萄糖稳态,TZD-induced胰岛素致敏与PPAR似乎发生相关γ介导的变化从脂肪组织脂质处理和信号输出29日]。虽然这种fat-mediated TZD行动模式是无可争议的,证据积累的药理学TZD PPAR不仅可以推动γ由PPAR激活,也γ独立和nongenomic对线粒体的影响30.]。在这部作品中,降低肌肉合成所示(C)与(T)的更大的规模可能是由于2,4-TZD action-related胰岛素刺激,导致肌肉从血液葡萄糖和脂肪酸吸收;这可能表明细胞在一个积极的代谢状态。因此,(T)保持细胞合成,细胞蛋白质降解较低和(C)相比,这是反映在一个更大的尺寸。重新分配内脏脂肪组织诱导脂肪形成的小脂滴,这是更多的胰岛素敏感,是最主要的一个重要的影响TZD [31日];在人类和啮齿动物,TZD增加SC脂肪细胞细胞表面(32]。细胞合成网膜和perirenal不同治疗,被高(C)。众所周知,内脏脂肪组织细胞规模更大,因为联盟的脂质与SC滴。大的解释(T)可能是由于2,4-TZD行动导致脂滴的积累。尽管细胞大小网膜的组织并没有表现出差异;在perirenal组织,(T)是高于(C),这可能意味着,某些表达的因素,如白介素6 (IL),抵抗素和PPARγ在内脏脂肪与SC脂肪相比,更高的表达式由脂肪酶、瘦素和脂联素33,34]。

5.4。2,4-TZD在血液、肝脏和肌肉

2,4-TZD浓度测量血液,肝脏和肌肉中,为了验证残留物的存在。如前所述,在28天的间隔收集血液样本。没有证据表明TZD的血液(T)与其他研究相比,TZD应该有3 - 4 h消除时期(35),这也解释了它没有如果采集标本在> 12 h 2时的最后一餐后,4-TZD管理。肝脏样本(T)与(C)呈现显著差异(表3)。肝脏是TZD的主要途径是由细胞色素P450酶和同功酶代谢(CYP2C8和CYP2C9) (36]。由于TZD肝脏损伤的毒性剂量(TZD治疗期间或毒性)是不确定的;troglitazone已经退出市场由于线粒体肝毒性37]。此外,罗格列酮是由肝脏代谢,代谢产物的64%和23%由粪便和尿液排出,分别为(12]。

肌肉样品没有显示TZD的存在也没有它的代谢物,但需要进一步研究肝和肌肉药物动力学及其与剂量相关,管理和动物物种。

5.5。PPAR表达式

在肝脏,低表达的PPAR (T)是一致的,在文献中报道38,39]。TZD明显有效地降低肝脂肪含量30%和-50%敏化肝脏对胰岛素。这减少了所需的endo和外源性胰岛素抑制肝葡萄糖生产(40]。研究小鼠肝组织报道PPAR的低表达γ当吡格列酮被用于长期治疗(41),类似于我们的结果。另一方面,PPARα表达的机会高的组织活动,如肝组织,经常发现。

PPAR表达组织的研究已经证明,当有严重的胰岛素抵抗肌肉组织,这可能导致异常的PPAR转录因子(42]。我们的结果表明,PPAR拥有更高的表达式(T)比(C)在肌肉。PPAR的情况α在肌肉中,有证据表明,肌原性的分化与线粒体生物起源的过程是由PPAR在共激活剂PGC1 -α在调解OXPHEN(氧化表型),肌肉的活动能力,衬底,和新陈代谢隐含在纤维类型和建立在肌细胞生成,维修,或肥大的肌肉43]。

PPARδ参与开发、感应和维护的I型纤维,暗示一些来自II型肌纤维转换成氧化纤维,通过诱导共激活剂PGC-1α在骨骼肌表达。此外,PPAR的表情δ与基因相关的规定人类骨骼肌脂质和糖代谢(44]。PPAR的增加δ(T)是在协议与其他研究,其中不饱和脂肪酸增加共激活剂PGC-1α在差异化的肌管,PPAR的可能δ配体在肌肉脂肪酸和一些代谢产物(45]。另一方面,一些研究建议PGC-1α水平小鼠具有负相关性与IM脂肪酸水平,但是,在这种情况下,动物的新陈代谢不同物种间(45]。

在肌肉,PPARγ,以及PPARδ已经与脂肪形成和被认为有助于分化转化成adipocyte-like细胞(46]。同意PPAR就越高γ在SC组织表达,细胞合成2,4-TZD治疗如预期(47]。此外,在荷斯坦奶牛过渡的研究提出了一个更高的PPAR表达式γ在脂肪组织切片上执行的最后一天治疗2,4-TZD [48]。首先,SC脂肪细胞对膳食营养的影响更敏感(49]。SC组织是众所周知的拥有更好的比网膜细胞分化;因此,它接受TZD的影响比其他组织(1,50]。此外,评估不同立地的SC和腹部脂肪组织观察转录后的不同水平的脂联素分泌的作用,2,4-TZD SC脂肪可以与腹部脂肪组织变化(51]。可以预期,动物不形式的遗传易感性在SC大理石花纹会堆积脂肪,而不是我(52]。这些可以解释2的影响,4-TZD (T)的动物,我们可以讨论关于SC仓库积累脂肪,,也许,如果我们将增加治疗的长度,我们可以达成一些大理石花纹。相反,如果我们使用另一个品种,如安格斯、治疗2,4-TZD可能会导致大量的肌内脂肪。此外,在我们的研究中,引导也接受trenbolone醋酸和17β雌二醇,因为它证明,增加蛋白质合成,合成化合物涉及胰岛素样生长因子(IGF)我和减少蛋白质降解。另一方面,合成化合物促进减少身体脂肪。一些研究显示,这些化合物通过减少和阻止PPAR行动γ和C / EBPα(53]。因此,根据我们的研究结果,2,4-TZD将有助于改善肉的质量与合成代谢的交互促进肌肉和脂肪组织增生的增量。

6。结论

结果显示2的积极影响,对肌肉的新陈代谢和PPAR 4-TZDα表达,这表明增加脂肪酸氧化,从而改善脂质代谢。在脂肪组织,2的影响,4-TZD,加上使用的合成代谢产生PPAR的抑制γ内脏脂肪组织中的表达(网膜和perirenal)根据细胞的合成比率。据我们所知,这是第一个研究,认为使用TZD提高牛肉生产;还需要进一步的研究来提供信息的剂量,品种,和时间的使用,之前其在动物生产中使用这些可能被考虑。

确认

本研究支持格兰特55429 Secretaria de Educacion上市(SEP) consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia-Mexico (CONACyT-Mexico),并从PAPIIT-Universidad IT201912根据墨西哥;墨西哥城,墨西哥。这项工作是科学大师的一部分论文,第一作者提交大学根据墨西哥(自治)。马格达莱纳河Arevalo-Turrubiarte同时也感谢CONACyT-Mexico奖学金Facultad de Estudios Superiores-Cuautitlan (FES-Cuautitlan)自治。作者还要感谢玛吉Brunner, m·A。修改英文手稿。