文摘

最近的研究表明PPARγ的transactivation函数是受细胞外信号。特别是,细胞因子和Wnt家族蛋白抑制ligand-inducible transactivation PPAR的函数γ和减弱脂肪生成/ osteoblastogenesis切换在间充质干细胞(msc)。例如,Wnt5a抑制PPARγ转录活动通过NLK / SETDB1 / CHD7通路。在这些因素中,BMP2强烈诱导骨形成,但在PPAR BMP2的效果γ功能尚不清楚。我们检查了BMP2和PPAR的效果γ在ST2细胞,发现PPARγ通过表观遗传调节激活BMP2信号通路的影响。尽管BMP2没有干扰PPARγ调节脂肪形成,BMP2增加PPAR的信使rna表达水平γ(如目标基因Fabp4和Nr1h3)当细胞第一次接受troglitazone(有望)。此外,PPARγ激活影响BMP2通过增强组蛋白激活标记(乙酰化组蛋白H3和trimethylated Lys4组蛋白H3)上Runx2启动子。有望治疗三个小时后,BMP2增强活动组蛋白的水平标志着PPAR的启动子γ目标基因。这些结果表明,治疗和BMP2 PPAR的顺序γ配体的脂肪形成和osteoblastogenesis切换msc是至关重要的。

1。介绍

间充质干细胞(msc)再生治疗的都是有用的工具,因为他们隔绝的缓解患者在文化和简单的处理。msc来自各种成人组织(脂肪组织和骨髓等)和有可能分化成各种各样的血统,包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和细胞(1,2]。最近的研究已经确定了差异化监管机构在msc。在这些因素中,PPARγ通常被认为是PPAR的主自激活脂肪形成的因素γnonadipogenic谱系细胞的前体触发他们分化转化成脂肪细胞(3,4]。内生和合成PPARγ受体激动剂(15-deoxy-Δ(12、14)前列腺素J2和thiazolidinediones)促进脂肪生成和抑制osteoblastogenesis原发性骨髓MSC文化(5]。此外,与罗格列酮治疗的老鼠(thiazolidinedione)增加骨髓脂肪过多,减少骨矿物质密度(BMD或骨量)显然是通过抑制pro-osteoblastic转录因子Runx2,Osterix,和Dlx5(6,7]。Haploinsufficiency PPAR的γ在老鼠身上导致增强osteoblastogenesis和减少骨髓脂肪生成增加骨小梁体积(8]。同样的, 老鼠,携带hypomorphic PPAR的突变γ位点,减少PPAR的表达式γ亚型在白色脂肪,显示异常增加骨形成导致骨髓腔的空间不足以维持正常造血作用[9]。总的来说,这些在活的有机体内和在体外研究表明,骨髓,PPARγ功能分化osteoblastogenesis之间切换和脂肪生成,充当osteoblastogenesis的抑制剂。然而,这种抑制作用的分子基础的PPARγ在osteoblastogenesis知之甚少。具体来说,重要的是要理解transactivation PPAR的函数γ,因为它是调节脂肪形成和osteoblastogenesis之间转换的关键。

除了ligand-dependent激活,各种信号通路可以调节transactivation PPAR的函数γ在msc。例如,一些细胞因子(TGFβ1和BMP2)抑制脂肪细胞分化的PPAR通过抑制骨髓mscγtransactivation函数(10,11]。此外,Wnt配体调控msc分化为成骨细胞和脂肪细胞12]。规范Wnt信号(Wnt1 Wnt3a、Wnt5b Wnt7a, Wnt10b,等等)促进骨形成,最初见临床研究的Wnt受体亚基基因,LRP5和功能的突变11,13- - - - - -17]。另一组Wnt配体(Wnt4, Wnt5a, Wnt11等)激活非规范Wnt信号通过细胞膜形成Fzd和Ror1 Ror2 [18),增加骨形成。我们之前发现Wnt5a似乎开关MSC分化命运从脂肪生成通过抑制PPAR osteoblastogenesisγ函数通过NLK / SETDB1 / CHD7复杂[19]。有趣的是,Setdb1信使rna被PPAR镇压γ在脂肪生成(20.通过控制]和Wnt5a调节破骨细胞分化Tnfsf11信使rna表达水平在成骨细胞(21]。

细胞因子,诱导骨形成蛋白(bmp) osteoprogenitor细胞成骨细胞的分化和有潜力作为自体骨移植替代物(22]。特别是,BMP2高度有成骨诱导骨形成通过刺激内层间充质细胞向成骨细胞的分化。最近的临床试验表明,治疗用重组人类BMP2提供重要的临床潜力(23]。在分子水平上,骨祖细胞缺乏BMP2的mRNA水平降低Sp7,Wnt1,Lrp5,Fzd1,Axin1,和Axin2(24]。然而,BMP2的影响在transactivation PPAR的函数γ和脂肪形成尚不清楚。在这项研究中,我们分析了PPAR间信号串扰γ和BMP2 msc。

2。方法

2.1。细胞培养和脂肪细胞,成骨细胞分化

ST2基质细胞来源于小鼠骨髓中培养αMEM培养基中含10%胎牛血清的边后卫和青霉素和链霉素(生命技术)在37°C和5%的公司2。脂肪细胞的分化,ST2细胞治疗/没有troglitazone(一个μ米)和/或BMP2 (50 ng / mL)。七天之后,脂质积累与Oil-Red-O评估染色。总之,细胞与磷酸盐缓冲盐水洗(PBS;2.7毫米137毫米氯化钠,氯化钾,10毫米Na2HPO4,1.76毫米KH2阿宝4)和固定用4%甲醛/ PBS五分钟在室温下。PBS洗后,细胞与油红O染色15分钟的缓冲(70%异丙醇/ PBS被过滤)。染色后,细胞被显微镜洗两次与PBS和可视化。

ALPL染色,细胞被洗用4%甲醛/ PBS PBS和固定。他们沾染了0.1毫克/毫升的混合物磷酸萘酚AS-MX(σ),0.6毫克/毫升坚牢蓝色BB盐(σ),MgCl两毫米2,五μN, L /毫升N-dimethylformamide和光)(kouichi,和100毫米Tris-HCl (pH值8.8)缓冲区在37°C五到十分钟。当细胞变成蓝色的,这些细胞被洗两次通过显微镜与PBS和可视化。

2.2。RT-qPCR分析

为扭转transcription-quantitative PCR (RT-qPCR),一个μg总从每个样本反向转录成RNA的第一链cDNA六聚体随机使用上标三世逆转录酶(表达载体)。引物组对所有基因从豆类购买生物有限公司(日本东京),包括Nr1h3,MA056056;Fabp4MA034980;Runx2MA056487;AlplMA024599;Gpd1MA066553;Gapdh,MA050371。实时rt - pcr进行热循环仪用SYBR绿色SuperMix CFX96 (Bio-Rad)根据制造商的指示。实验样本匹配生成的标准曲线放大连续稀释的产品使用相同的PCR协议。纠正可变性的RNA复苏和反转录的效率,glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶互补脱氧核糖核酸在每个cDNA准备放大和量化。归一化和计算步骤进行根据制造商的协议。

2.3。芯片分析

染色质免疫沉淀反应(芯片)分析使用芯片检测工具(微孔)根据制造商的指示。溶性染色质准备从 细胞和抗体免疫沉淀反应表示蛋白质。由qPCR Fabp4放大的启动子,我们使用了引物对,5′-TGCCCTCTCAGGTTTCATTTCT-3′5′-AGTTGTGGTGGGTGGTTATGG-3′, PPRE Fabp4基因启动子区域。此外,5′-GCTCAGAACGCCACACACTC-3′, 5′-TCTACCCCTCCTCCCTTTCC-3′是用于Runx2基因启动子区域。PCR,我们使用引物对,5′-AGTTC ACTAGTGGAAGTGTCACAGC-3′, 5′-CTAGAAACAGACACTGGAACCACTCT-3′,的Fabp4在PPRE基因启动子区域。PCR半定量测量条件是27 30秒的周期 ,45岁 ,一分钟 。PCR产品可视化2% agarose-Tris-acetate-EDTA (TAE)凝胶。

3所示。结果

3.1。BMP2没有干扰PPARγ端依赖脂肪形成

阐明分子BMP2和PPAR之间的联系γ,我们首先检查了BMP2对脂肪细胞/成骨细胞分化的影响分析ST2细胞的反应。这些细胞是来源于小鼠骨髓基质细胞,可以分化成脂肪细胞和成骨细胞(25]。我们用一个ST2细胞治疗μM troglitazone PPAR(有望)γ配体和/或50 ng / mL BMP2诱导脂肪细胞和成骨细胞。我们证实脂肪细胞的分化,油红O染色和成骨细胞为碱性磷酸酶染色(ALPL)活动。之前报道,有望诱导脂肪生成但不是osteoblastogenesis。然而,ST2细胞治疗有望和BMP2接受脂肪形成和osteoblastogenesis(图七天1)。这些结果表明,PPARγ和BMP2不互相干扰。


图1
BMP2的影响以及有望ST2脂肪细胞和成骨细胞分化的细胞。该方案的实验显示在面板上。ST2细胞培养μM troglitazone(有望)或50 ng / mL人力重组BMP2七天。这些细胞被固定为4%甲醛/ PBS五分钟在室温下,和沾油红O或碱性磷酸酶(ALPL)活动。比例尺意味着50μm。

据报道BMP2抑制PPARγ调节脂肪生成(26];此外,BMP2-dependent osteoblastogenesis被PPAR镇压γ激活(27]。这些报告反驳我们的发现。我们假设治疗BMP2和PPAR的顺序γ配体可能会减弱一个或另一个分化途径的激活。因此,我们对待ST2细胞BMP2然后有望或有望BMP2每个(图3人力资源2(一个))。然后执行RT-qPCR和芯片分析(图2 (b)和数字3(一个)和3 (b))。有趣的是,我们发现,脂肪细胞和成骨细胞标记基因的表达水平变化根据有望和BMP2的顺序添加到细胞中。例如,治疗后与BMP2三小时,TRO-dependent感应的Fabp4和Nr1h3信使rna (PPARγ目标基因在脂肪细胞4,28(图)被压抑在ST2细胞2 (b)离开了,比较有望(三小时)BMP2(3小时)有望(三小时))。有趣的是,有望治疗三个人力资源之后,BMP2诱导脂肪细胞标记基因的mRNA水平(Fabp4和Gpd1)。此外,与有望三人力资源增强BMP2-dependent预处理Runx2和碱性磷酸酶(Alpl)mRNA表达(图3 (b)右:比较BMP2(三小时)有望(三小时)-BMP2(三小时))。然而,预处理与BMP2没有加强TRO-dependent感应的mrna(图2 (b))。这些结果表明,PPARγ激活增强与PPAR BMP2活动和预处理γ配体减毒osteoblast-related基因表达。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
脂肪细胞和成骨细胞标记基因mRNA水平改变通过改变BMP2的顺序,有望治疗。(一)方案中使用的实验数据2和3。我们检查了五个条件。(- - - - - -)未经处理的ST2细胞培养αMEM补充10%的边后卫和青霉素和链霉素。(有望)ST2细胞被孵化 有望三人力资源。(BMP) ST2细胞治疗50 ng / mL BMP2三人力资源。(TRO-BMP) ST2细胞治疗有望三人力资源中被改变,细胞培养与BMP2三人力资源。(BMP-TRO) ST2细胞接受BMP2三人力资源和媒介改变了;细胞培养与有望三人力资源。(b) RT-qPCR分析脂肪细胞和成骨细胞分化标记基因。ST2后细胞培养在上述条件下,细胞被收集和提取rna。然后RT-qPCR实验进行规范化Gapdh信使rna。每个实验进行至少三次。学生的t以及执行。 。
(一)
(一)
(b)
(b)
图3
没有BMP2 ST2细胞芯片分析/处理和/或有望。(a)后ST2细胞培养条件下在图中描述2,细胞细胞溶解和芯片分析根据制造商的协议使用表示抗体(微孔)。H3KAc, anti-acetylated赖氨酸组蛋白H3(微孔);H3K4me3, anti-trimethylated Lys4组蛋白H3(微孔)。样本检查qPCR使用CFX96 (Bio-Rad)。引物被用作之前报道(19]。每个实验进行至少三次。学生的t测试被执行。 。(b)使用anti-H3AcK ST2细胞芯片分析,-H3K4me3, -PPARγ。芯片分析在相同的条件下进行(a)。PCR进行描述和可视化在2%琼脂糖TAE凝胶。
3.2。表观遗传相声BMP2信号和PPAR之间γ

许多转录辅活化因子和PPAR辅阻遏物γ已确定(29日),其中一些有组蛋白修改活动30.]。组蛋白修饰在转录扮演关键角色通过收紧或扩大核小体。核小体是染色质结构的基本单位,它由两个副本的每个核心组织蛋白H2A、H2B, H3和H4, DNA缠绕在octameric核心。H3和H4组蛋白具有氨基端尾尤其容易受到转译后的修改由特定的酶。修改染色质的组蛋白乙酰化、甲基化和磷酸化构成重要的表观遗传调控机制。这些修改的组合改变局部染色质组蛋白的结构和物理性质。因此,这些变化可以促进或者阻止转录机器及其启动子结合的能力和调节活动。事实上,大量的酶参与组蛋白修饰也可以改变non-histone影响转录的蛋白质。表观遗传酶发挥关键的转录作用包括组蛋白甲基转移酶(hmt),组蛋白demethylases (hdm),组蛋白乙酰转移酶(帽子),组蛋白去乙酰酶抑制剂(hdac), DNA甲基转移酶和DNA demethylases。

一般来说,trimethylation赖氨酸4 H3 (H3K4me3)和乙酰化作用的赖氨酸H3 (H3KAc)被认为是转录活性染色质标记,而di -和tri-methylation赖氨酸9或27的H3(指定H3K9me2, H3K9me3、H3K27me2或H3K27me3)是染色质转录镇压的标志。表观遗传监管机构构成包括PPAR核受体超家族的许多活动γ。因此,研究由PPAR表观遗传控制γ是理解ligand-mediated关键转录调节代谢途径。

调查是否有望和BMP2的治疗顺序引起的表观遗传改变,我们执行qPCR芯片启动子的分析Fabp4或Runx2。如(图所示3(一个)),Runx2子地区,更高水平的转录活跃的标志(组蛋白H3KAc和H3K4me3)诱导的时候首先有望处理,然后与BMP2 BMP2比单独或有望。此外,BMP2预处理抑制TRO-dependent H3K4me3的感应Fabp4启动子。有趣的是,三个小时的BMP2治疗或三个人力资源有望治疗高度抑制H3K4me3水平上Runx2子比未经处理的细胞。然而,PPAR的招聘γ并没有增强的Fabp4子当处理有望(三小时)-BMP2(三小时)(图3 (b))。这些结果表明,BMP2的顺序或减毒transcription-related有望治疗组蛋白标记脂肪细胞或osteoblast-related基因启动子在msc。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现有望的顺序或BMP2治疗减脂肪形成的mRNA表达/ osteoblastogenesis-related基因在msc。特别是,有望治疗(3人力资源)-BMP2(三小时)诱导mRNA水平的脂肪生成(Fabp4和Gpd1)和osteoblastogenesis (Runx2和Alpl)比有望相关基因、BMP或BMP(3小时)有望(三小时)。这些结果可能表明PPAR的激活γ影响在BMP2-induced osteoblastogenesis。此外,在Fabp4和Runx2启动子,转录活跃引起组蛋白标记更有望(三小时)-BMP2比有望(三小时),BMP或BMP(3小时)有望(三小时)。这些结果与每个mRNA水平(图2 (b)PPAR之间),表明信号串扰γ和BMP2是由表观遗传调控。

MSC的潜在机制引导lineage-specific分化是只有部分理解。改进的理解这些机制可以显著提高再生和移植治疗。在这个手稿,我们表明,PPARγ函数作为BMP2的调节因子在msc。此外,最近表明,人类的MSC PPAR处理γ抑制剂GW9662和人类MSC-derived骨细胞外基质可以修复效率高(31日]。综上所述,这些研究表明,除了控制细胞的环境中,转录调控和表观遗传调制需要合适的骨再生。表观遗传组蛋白修饰是尤其重要的转录抑制或激活。尽管我们发现表观遗传regulation-mediated PPAR间信号串扰γBMP2, PPAR机制γ端依赖增强BMP2激活尚不清楚。配体可能PPARγ定义了全基因组的位置在分化活跃转录机械。另外,配体的直接交互PPARγ和Smads可能有助于调节基因表达。最近的研究表明,Smad2/3决定细胞特定类型反应通过改变转录因子相互作用[32]。PPARγ也可能与Smads和减弱成骨细胞标记基因的信使rna表达水平。进一步的表观遗传研究和全基因组分析需要完全理解信号串扰在msc。

确认

作者感谢教授k .松尾和a . Yoshimura的书面指令。他们也感谢所有成员有益的讨论和实验支持。这项工作由补助金支持部分优先领域基础研究(“细胞外环境动力学”和“免疫自我”),补助金的年轻科学家(B)(23791622),日本社会科学,促进日本、细胞科学研究基金会,和离开巢拨款。