文摘

新兴的证据表明,过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ)和DNA甲基转移酶(DNMTs)发生过程中发挥作用。在这项研究中我们旨在评估PPAR的表达γ种能阻碍DNMT3B DNMT1,与clinical-pathological及其相关特性对胰腺癌患者(PC),并定义PPAR的效果γ激活在PC细胞系DNMTs表达式。种能阻碍DNMT3B存在分析显示肿瘤与正常组织表达下调( ),而PPARγ和DNMT1水平没有显著改变电脑的病人。PPAR之间表达水平γ种能阻碍DNMT3B DNMT1和DNMT1之间高度相关( 和 职责)。DNMT3B超表达在肿瘤组织中呈正相关,淋巴结传播( )和手术部位边缘肿瘤细胞切除状态( ),边缘与神经周的入侵( )被发现。种能阻碍DNMT3B此外,高水平的表达显著降低死亡率在整个人口( 95% -0.895, )和子群的病人没有围神经的入侵( ;95% -0.758; ),而这样的协会肿瘤患者中未发现入侵围神经的结构( )。总之,在体外和在活的有机体内PPARγDNMTs相关出现在电脑,这种交互行为可能会影响细胞表型和疾病。

1。介绍

胰腺癌(PC)列为全世界癌症相关死亡的第四大原因(1,2]。高度积极抵抗化疗,我们无法检测它处于初级阶段,缺乏有效的系统性治疗负责几乎相同的发病率和死亡率3,4]。更有效的治疗和/或小说的发展战略需要改善患者预后的电脑。

的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)属于核受体超家族和被认为是主监管机构的脂质和糖代谢代谢和营养信号转导到转录反应(5,6]。PPARs已知的三个亚型:PPARα,PPARδ,PPARγ(7]。后者已经参与多种疾病的病理,包括肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化和癌症。PPARγ配体诱导分化脂肪肉瘤细胞和多种抗肿瘤作用也在胰腺癌细胞(8]。这样的高亲和性的可用性配体促进了PPAR的信号通路的研究γ调节代谢过程,监管也通过表观遗传事件。表观遗传调节的机制由PPARs仍有待探讨。DNA甲基转移酶(DNMTs)是至关重要的表观遗传事件通过增加甲基的DNA (9,10]。甲基化模式的维护是通过DNMT1函数(11在DNA复制,而新的或]新创甲基化主要是由种能阻碍DNMT3b DNMT3a和催化(12]。是否以及如何PPARs调节表观遗传事件仍有待探讨。在本文中,我们试图检查PPAR的mRNA水平γDNMT1和3 b在一群电脑病人和关联研究结果与临床病理特性,包括病人的生存,并评估是否药理PPAR的调制γ可能会影响在PC DNMTs细胞系的表达。

2。材料和方法

2.1。病人和组织样品准备

一群30配对的肿瘤和邻近的正常组织样本收集患者的胰脏切除手术,”德拉Casa Sollievo Sofferenza”医院,IRCCS、San Giovanni Rotondo,意大利在2007年10月和2011年6月之间。书面知情同意了之前收集病人的组织。胰腺导管腺癌的最后诊断是确定在所有患者通过组织学检查。在最后跟踪,18例(60%)病人还活着,12例(40%)患者死亡。人口统计学和临床病人的特点如表所示1。

表1
胰腺导管腺癌患者的临床和病理特征(PDAC)。

立即组织标本在液态氮冷冻,储存在−80°C到RNA提取。癌症细胞结构丰富的低温恒温器切片和大多数细胞的解剖区域。

2.2。细胞培养和治疗

BxPC3、CF-PAC MiaPaca, Panc1细胞培养在37°C公司5%2大气与10%胎牛血清的DMEM培养基补充的边后卫,100 U /毫升青霉素和100 ng / mL链霉素(生命表达载体技术,意大利米兰),而CFPAC和MiaPaca维护RPMI介质(生命表达载体技术,意大利米兰)。罗格列酮治疗(从开曼群岛购买化学品)执行在不同的时间点(24小时和48小时)和在不同浓度(5μ米和15μ米)。

2.3。实时定量PCR(存在)

30个人电脑总RNA提取新鲜冷冻标本和从不同的胰腺癌细胞(BxPC3, CFPAC、MiaPaca Panc1)使用RNeasy迷你包(试剂盒S.P.A.意大利米兰),随后消化DNase即50 ng的互补脱氧核糖核酸合成总RNA和定量实时PCR进行使用QuantiFast Sybr绿色PCR设备后一步协议。实时rt - pcr,我们使用以下SYBR绿色QuantiTect底漆购买试剂盒:人类PPARγ种能阻碍DNMT3B (QT00029841) DNMT1 (QT00034335)和(QT00032067)。反应是建立在96 - 7700孔板使用实时PCR系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)和所有样本化验一式三份。光学数据分析使用默认和可变参数在SDS软件包(版本1.9.1;应用生物系统公司,培育城市,CA)。目标基因的表达水平是规范化使用管家控制基因:塔塔结合蛋白(真沸点,QT00000721)之前执行(14]。

2.4。统计数据

人口统计学、临床和遗传特性报告为中位数和四分位范围(问1 -问3)测试差别。基因表达,或者对这些用例Wilcoxon符号秩检验。组比较进行使用皮尔逊卡方检验和Mann-WhitneyU分别测试分类和连续变量。连续变量之间的相关性评估使用r斯皮尔曼系数。Time-to-death使用Cox比例风险回归分析模型和风险报告为危险比率(人力资源)及其95%置信区间(95% CI)。总生存期之间的时间被定义为手术和死亡。对于那些没有经验事件,时间变量当时审查最后的随访时间可用。在死亡时间分析,基因的表达logarithm-transformed尊重Cox模型的线性假设。也报道kaplan - meier曲线显示的目的。所有统计分析使用SAS版本9.1.3 (SAS研究所卡里、数控、美国)。至于细胞实验,结果表示为±SD方法。进行统计比较,意义是评估使用学生 测试。的值 (*), (* *)或 (* * *)被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。PPARγ在胰腺癌、DNMT1和3 b表达活检

PPAR的相对表达水平γ种能阻碍DNMT3B DNMT1,信使rna在组织样本30 PC患者呈现在图1。看着中等水平的基因表达在肿瘤与邻近nontumor组织相比,种能阻碍DNMT3B的mRNA表达下调(值= 0.4,问1 -问3 = 0.22 - -1.05, ),而PPARγ和DNMT1 mRNA水平没有显著改变(PPARγ:中值= 0.98,问1 -问3 = 0.41 - -1.8, ;DNMT1:中值= 0.76;问1 -问3 = 0.61 - -1.29, )。PPAR之间的关联分析γ种能阻碍DNMT3B DNMT1,表明PPAR mRNA水平γ表达水平与DNMT1表达水平呈正相关,在PC患者( , 种能阻碍DNMT3B),但不是表达水平( , )。一种能阻碍DNMT3B DNMT1之间显著相关,即表达水平观察患者的个人电脑,( , )。


图1
PPARγ种能阻碍DNMT3b DNMT1,信使rna表达水平在胰腺导管腺癌患者组织从30 (PDAC)。每一个污点表明基因的相对表达肿瘤与正常组织相比,内生GAPDH正常化后。值大于1表明基因超表达发炎组织。对每个基因表达水平观察病人组中值表示的水平黑条。在对数尺度相对表达式值报告(y设在)。
3.2。PPAR之间的相关性γ种能阻碍DNMT3B DNMT1, mRNA水平与临床和病理特征

当PC患者分层根据他们的临床表型,PPARγ表达水平与人口和临床特征,DNMT1显示,只有一种趋势的增加表达对肿瘤分化低年级(G1:中值= 0.55,问1 -问3 = 0.45 - -0.57;G2:中值= 0.87,问1 -问3 = 0.62 - -1.47;G3:中值= 0.94,问1 -问3 = 0.75 - -1.29; )。种能阻碍DNMT3B相反,表达水平与重要的PC患者预后变量联系在一起。种能阻碍DNMT3B在细节,表达与淋巴结肿瘤组织是直接相关的比率,表示为总涉及淋巴结切除淋巴结总数( , )。种能阻碍DNMT3B此外,表达水平显示边缘协会神经周的入侵在PC患者:DNMT3B水平更高的患者神经周的入侵的证据(值= 0.98,问1 -问3 = 0.67 - -1.07)比那些没有肿瘤入侵神经结构(值= 0.26,问1 -问3 = 0.18 - -0.62), (图2)。种能阻碍DNMT3B此外,表达更高的利润率切除患者的肿瘤细胞(R0:中值= 0.65,问1 -问3 = 0.26 - -1.16),与肿瘤浸润的证据比切除利润(R1:中值= 0.20,问1 -问3 = 0.12 - -0.42), (图3)。


图2
种能阻碍DNMT3b协会表达水平与神经周的入侵(IP)患者的胰腺导管腺癌(PDAC)。患者根据IP分层状态(不与是的)。每个箱子亮点值,四分位范围(问1 -问3)和上下相邻值为每个学科组(垂直酒吧)。箱子的上下边界定义四分位数,75%和25%百分位数,分别和黑条代表了中值。在对数尺度相对表达式值报告(y设在)。

图3
种能阻碍DNMT3b协会表达水平与切除的胰腺导管腺癌患者的利润(PDAC)。根据手术部位边缘肿瘤细胞切除患者分层状态(R0和R1)。每个箱子亮点值,四分位范围(问1 -问3)和上下相邻值为每个学科组(垂直酒吧)。箱子的上下边界定义四分位数,75%和25%百分位数,分别和黑条代表了中值。在对数尺度相对表达式值报告(y设在)。
3.3。生存分析

种能阻碍DNMT3B time-to-death分析,表达水平logarithmic-transformed完成Cox模型的线性假设。种能阻碍DNMT3B 30 PC患者,单变量分析的高表达水平降低死亡率的HR = 0.485 (95% CI -0.895 = 0.262, )。此外,一种能阻碍DNMT3B重要的互动表达水平和神经周的入侵也观察到( )。在21个病人的子群的细节,没有证据表明围神经的入侵种能阻碍DNMT3B高表达水平与长生存(HR = 0.314;95%可信区间= 0.130 - -0.758; )。相反,这种效果没有观察到9组的肿瘤患者入侵围神经的结构(HR = 0.879;95%可信区间= 0.466 - -1.655; )(图4)。


图4
3.4。PPARγDNMT1 3 b在胰腺癌细胞系

为了证实了之前的研究,我们分析了PPARγ、DNMT1和3 b mRNA水平四个不同的胰腺癌细胞系。如图5更高水平的PPAR PANC-1细胞显示γ相比其他细胞系,同时CFPAC MiaPaca细胞呈现PPAR的mRNA水平较低γ。也显示出了类似的模式DNMT1表达式。CFPAC和PANC-1cells DNMT3B显示水平较高,而在BxPC3表达下调和MiaPaca细胞。

(一)
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(b)
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(c)
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图5
定量实时PCR。信使rna PPAR的相对表达水平γDNMT1 3 b在四个不同的胰腺癌细胞系。
3.5。罗格列酮治疗的效果在胰腺癌细胞株DNMTs表达式

为了测试是否PPARγDNMTs互相关联,我们使用药理方法,用罗格列酮治疗PC细胞(PPARγ在罗格列酮受体激动剂):挑战不同的表达模式在不同电脑细胞系被观察到。如图6BxPC3细胞中,罗格列酮治疗15μM 48 h浓度降低DNMT1表达式( 种能阻碍DNMT3B),导致表达下调与罗格列酮治疗后5μM 48 h与汽车相比治疗( )。至于CFPAC细胞(图6),罗格列酮的挑战并没有影响DNMT1表达式,种能阻碍DNMT3B而导致增加5点用罗格列酮治疗μ24小时和48小时( 和 、职责)和与罗格列酮治疗后15μM 48 h ( )。在PANC1细胞(图75)DNMT1罗格列酮治疗后下降μ米24 h ( )和48小时( ),15岁μ米24 h ( )和48小时( )。种能阻碍DNMT3B关于罗格列酮治疗诱导显著upregulation 5μM和15μ米24 h ( 和 5点),但不显著μ米和15μM 48 h ( 和 职责)。

(一)
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(b)
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(c)
(c)
(d)
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图6
定量实时PCR。信使rna DNMT1的相对表达水平和3 b BxPC3 CFPAC用罗格列酮治疗胰腺癌细胞株在指定的浓度和时间点。
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图7
定量实时PCR。信使rna DNMT1的相对表达水平和3 b PANC1 MiaPaca用罗格列酮治疗胰腺癌细胞株在指定的浓度和时间点。

至于MiaPaca细胞(图7),DNMT1导致增加活性氧治疗后在5μ米和15μ米24 h ( 和 职责),但这48 h后治疗5超表达并不明显μ米( 15)48 h后仍然存在μM浓度( )。种能阻碍DNMT3B至于我们观察到48 h后表达降低治疗5μM罗格列酮( )。

4所示。讨论

新兴的证据表明,PPARγ在发病机制中发挥作用的一些病理过程,如糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化和癌症(15]。最近的科学报告表明,PPAR的调制γ活动可能是治疗价值的电脑(16- - - - - -19]。PPARs活化剂在治疗可能是一个理想的组合伙伴设置tumour-protecting蛋白的抑制可能是克服治疗抗药性相关(20.]。Kristiansen et al。21)表明,PPARγmRNA和蛋白表达调节在胰腺导管腺癌,可能作为该病预后标记。在目前的调查,我们分析了PPAR的mRNA水平γ种能阻碍DNMT3B DNMT1, PC患者为了评估这些因素之间的相关性及其对一些患者的临床和病理特征。我们没有找到一个PPAR改变γ表达式匹配在肿瘤与正常组织,但PPARγ表达了一种能阻碍DNMT3B DNMT1正相关,但不与表达式。此外,后两个基因的mRNA表达是高度相关的。DNMT3B表达显著下调肿瘤与正常组织相比,和淋巴结和保证金比例状态呈正相关。彭et al。22)建议增加DNMT1蛋白表达参与多级胰腺癌生成从癌前阶段导管癌的恶性转变,可能是一个生物预测预后不良。种能阻碍DNMT3B在我们组,我们发现表达式显示低水平相比,非侵入性侵袭性肿瘤。这些数据是一致的在体外种能阻碍DNMT3B调查结果显示,高水平PANC1 CFPAC细胞其优越的入侵能力已经证明(23- - - - - -25]相比BxPC3和MiaPaca细胞。

在PC患者,单变量分析显示保护作用,减少死亡率,种能阻碍DNMT3B高表达水平在非侵入性肿瘤,而在侵入性肿瘤这种种能阻碍DNMT3B效果超表达没有进一步的观察。

此外,在我们的在体外电脑模型细胞,PPARγ显示更高水平PANC-1细胞比其他细胞系同时CFPAC MiaPaca细胞呈现PPAR越低γ信使rna水平。DNMT1 PPAR的显示相同的趋势γ确凿的PPAR之间的正相关关系γ表达与DNMT1 PC组织。

当处理PPARγ配体(罗格列酮),胰腺癌细胞以不同的方式回应表明存在剂量依赖的相关性和时间效应。PPAR的观察到的差异γ和DNMTs水平和罗格列酮反应的差异在不同的细胞系可能是由于不同的遗传背景(23]。此外,DNMTs改变引发的低剂量罗格列酮24小时后,在孵化中未发现这惊人的高剂量的48小时内,表明细胞适应机制来增强和可能存在的饱和PPAR信号。

5。结论

我们的研究表明,PPARγ种能阻碍DNMT3B与DNMT1积极相关,但不与这种能阻碍DNMT3B更高的mRNA水平存在的非侵入性肿瘤预测在胰腺癌患者生存时间而在浸润性肿瘤的种能阻碍DNMT3B更高的mRNA水平与预后不良有关。

作者的贡献

a . Andriulli和p . di Sebastiano同样这项工作做出了贡献。

确认

作者感谢教授阿尔多斯卡帕提供细胞株。这项工作受到了“意大利卫生部”格兰特在胃肠病学单位的研究实验室(RC1203GA58),内科与生物钟单元(RC1203ME46)和外科学系(RC1203CH50) IRCCS科学研究所和地区综合医院“德拉Casa Sollievo Sofferenza”歌剧di Padre Pio da Pietrelcina San Giovanni Rotondo,意大利,“5 x1000”自愿捐款。