文摘
罗格列酮(显示),治疗2型糖尿病的发展,是已知的对碳水化合物和脂质代谢的影响导致胰岛素敏感性的提高在目标组织。进一步评估的能力显示在胰岛素敏感组织正常化基因表达,我们比较组18-day-treated db / db小鼠口服剂量的增加显示(10、30和100毫克/公斤/天)和未经处理的非糖尿病的同胞(db / +)。对于这个目标,转录变化以肝、腹股沟脂肪组织(IAT)和比目鱼肌使用微阵列和实时PCR。并行,有针对性的代谢组学的评估脂质(甘油三酯(TGs)和游离脂肪酸(远期运费协议))在血浆和组织是由UPLC-MS方法。多元分析显示差异基因表达之间的关系在肝脏和肝trioleate内容和血糖水平和差异表达基因的组合以肝、IAT和肌肉。总之,我们集成基因表达和有针对性的代谢组学数据提供一个全面的概述RSG-induced糖尿病小鼠模型和改进的分子变化的理解如何显示改善糖尿病对胰岛素敏感组织主要通过其影响。
1。介绍
2型糖尿病,也称为非胰岛素依赖型糖尿病,是一种慢性疾病,影响全世界超过1亿人,而在西方国家其发病率飙升由于高脂肪饮食和久坐不动的生活方式。这个病理特点是抗胰岛素在外围组织的影响,即表现为减少刺激葡萄糖摄取到骨骼肌和脂肪组织,有缺陷的胰岛素依赖型抑制肝葡萄糖输出,并从胰腺胰岛素分泌减少β肽。Insulin-sensitising药物,如显示、广泛应用于临床实践,提高糖尿病的葡萄糖代谢的改变。噻唑烷二酮类)已经被降低血糖浓度,改善肝脏和肌肉胰岛素敏感性(1,2,对脂肪组织产生重大影响诱导脂肪分化,脂肪生成和TG存储(3- - - - - -6]。服用tzd的作用机制是通过绑定和介导的激活过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR),核受体在脂类代谢的监管作用,在细胞分化,尤其是在脂肪细胞(7,8]。PPAR也表达了几个其他组织,包括肌肉、肝脏、胰腺、心脏、脾(9]。服用tzd的多个操作中血糖水平正常化,通过增加葡萄糖吸收和减少肝葡萄糖生产(10]。此外,服用tzd诱导系统性脂质变化的发生,降低远期运费协议和TGs水平循环,部分通过改善脂肪细胞功能(11]。综上所述,这些对碳水化合物和脂质代谢的影响与改善胰岛素敏感性有关的外围组织。然而,服用tzd行动也伴随着增加脂肪形成和脂质积累在组织12,13]。显示是一个原型TZD化学类的治疗2型糖尿病的发展,和一些已知的这些影响是通过介导的基因转录调节(14- - - - - -17];然而,在胰岛素依赖型RSG-mediated基因表达调控之间的关系组织和随后的生理变化尚不清楚。
糖尿病小鼠db / db,瘦素受体缺陷,繁殖的许多代谢障碍出现在二型糖尿病患者,包括高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、胰岛素抵抗(18]。解决的问题是否RSG-mediated正常化的血液和组织生物学特性在db / db伴随着规范化治疗基因表达在三大组织胰岛素依赖型,肝脏,IAT(腹股沟脂肪组织)和骨骼肌,我们分析了转录组的糖尿病小鼠RSG-treated db / db和比较他们与未经处理的非糖尿病同窝出生的db / +。多变量分析被用来建立关系RSG-regulated基因表达谱和代谢组学数据获得胰岛素敏感组织或血液样本。
这项研究提供了一个综合评价RSG-induced全基因组表达的变化及其关系RSG-mediated生理变化在三个主要的胰岛素敏感组织中参与脂质和葡萄糖体内平衡。
2。材料和方法
2.1。动物和治疗
一个为期八周的老男noble - Cg米+ / + Leprdb / J糖尿病小鼠(db / db)和非糖尿病的应变(db / +)是来自查尔斯河实验室(L 'Arbresle、法国)。三种动物被安置每笼和与会的标准光源下1周(12 h光明/黑暗),喂养(db / +:标准实验室chow (A03、安全、法国);db / db: 5 k52、安全、法国)。不同小鼠随机分为5组(/组)如下:车辆(HEC - 1%)治疗非糖尿病患者糖尿病db / db / +和db老鼠(控制老鼠db / db)和糖尿病与PPAR db / db小鼠口服治疗受体激动剂显示(Syntheval,卡昂,法国)3单独剂量(10、30、100毫克/千克/天)18天。每天体重测量,和血液收集通过轨道窦穿刺治疗前后(18 h上次治疗后)来评估血糖水平。实验过程都是按照欧洲国际道德标准(86/609-EEC)和法国国家委员会(法令87/848)的护理和使用实验动物。
2.2。组织和血液分析
在治疗结束时,老鼠被颈椎脱位安乐死。肝、IAT和比目鱼肌是立即,称重,flash在液态氮冷冻,保存在-80°C。血液样本被卷入heparin-containing管(1.5国际单位肝素为100L的血),等离子体是整除和储存在4°C。血糖、Hb和糖化血红蛋白水平测定使用自动分析器COBAS系统(罗氏、巴塞尔、瑞士)。FFA和TG肝脏和脂肪组织(50毫克整除)与CHCl提取3。蒸发后,有机干提取重组在CH3CN/iPrOH (1/1)。等离子体(50L)提取CHCl的混合物3/甲醇(2/1)。FFA和TG分析UPLC-MS使用C18本·Acquity分析柱,CH的梯度3CN、iPrOH和甲酸(0.1%)(0.5毫升/分钟,50°C),和4000 QTRAP(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)和LCT总理(水域)。
2.3。RNA制备
冷冻的总RNA制备肝、比目鱼肌、和IAT,使用试剂盒试剂(表达载体、法国),并进一步纯化醋酸铵沉淀根据标准协议。纯化总RNA浓度和260/280或260/230 nm比率测定使用Nanodrop nd - 1000分光光度计(Nyxor生物技术、法国)。然后,总RNA检查完整性microelectrophoresis在丙烯酰胺凝胶(安捷伦2100生物分析仪,安捷伦,圣克拉拉,CA,美国)。
2.4。微阵列杂交和数据分析
总RNA (500 ng)样本标签与青蓝Cy5——或者Cy3-CTP染料使用安捷伦低RNA输入线性放大工具包(安捷伦科技、PN 5184 - 3523),根据制造商的协议。体外转录后,825 ng的测试样本(个人db / +:)或RSG-treated db / db cRNA涨跌互现825 ng的参考样本(池:db / db cRNA)。样本杂化(dye-swap复制)k全基因组60米oligo-microarrays(安捷伦科技,PN G4122F) 17个小时在65°C。微阵列扫描使用一个动态自动对焦芯片扫描仪(安捷伦技术)。原始数据是正常使用当地背景减法和洛斯染料正常化。数据分析使用罗塞塔解析器基因表达分析系统v6.0 (Rosetta Inpharmatics LLC、西雅图、佤邦)。Dye-swap复制之前precombined任何统计分析。为每个组,统计上显著的调节序列被定义为序列的表达式在db / +或RSG-treated db / db样本统计不同表达式的未经处理的db / db(参考),计算通过罗塞塔error-weighted模型(19]。在这项研究中一个P价值。001被认为是重要的,一个叠化值截止创新路径分析应用程序(美国智慧系统,CA)是用于允许数据的功能解释。启动子基因序列进行了调查的近端(500个基点从起始点)PPAR响应元素(PPRE)启动子与MatInspector (Genomatix;GmbH) [20.]。偏最小二乘(pls)投影到潜在的结构分析(21)是使用Simca-P12执行软件(Umetrics、期刊、瑞典)。
2.5。实时rt - pcr
总RNA (1从每个动物(g)从合并参考db / db /组)和反向转录成cDNA使用转录工具包(应用生物系统公司,PN 4368813)。PCR反应接着在微流控卡使用ABI棱镜7900 ht序列检测系统(应用生物系统公司)。每个微流控卡加载与预先设计Taqman探针和引物的基因和基因RNA 18岁参考。互补脱氧核糖核酸(100 ng)是混合2 x Taqman普遍PCR反应混合液(应用生物系统公司,PN 4324020)和加载在每个()。以下使用温度剖面图:10分钟94.5°C,紧随其后的是40 97°C的周期为1分钟30秒和59.7°C。正常数据与RNA 18岁使用阈值周期进行分析(Ct)相对量化方法22),Ct方法被用来比较RNA的含量测试和参照群体。
2.6。免疫细胞化学
脂肪组织是中性缓冲福尔马林固定在4%,和低温恒温器部分的7m是准备。标签使用执行发现XT自动机(美国图森Ventana医疗系统)。部分是孵化1 h30 37°C和488 -共轭anti-OxPhos Alexa萤石复杂的第四单元我抗体(1/100稀释,分子探针,PN A21296)。Immunolabelling可视化和成像利用LSM 510共焦显微镜(卡尔蔡司SAS、法国)。
3所示。结果
3.1。显示对生理的影响特征
实验开始时RSG-treated和控制db / db组的老鼠相对肥胖和糖尿病。血糖浓度和身体重量为两组相似,都是明显不同于db / +非糖尿病的老鼠(表1)。十八天的治疗存在剂量依赖的相关性显示导致高血糖症的降级。事实上,减少血糖和糖化血红蛋白浓度观察显示剂量测试。血糖正常化是来自30毫克/公斤(与在db / +) g / L;糖化血红蛋白水平从db / db-treated老鼠都显著高于db / +控制老鼠,只显示部分正常化这个参数(表1)。
3.2。有针对性的血浆和组织的脂质代谢组评估
糖尿病小鼠db / db显示等离子trioleate浓度高于db / +。RSG-treated db / db小鼠表现出明显的减少水平的两个主要等离子TGs trilinoleate trioleate。db / +相比,TG正常化实现从10毫克/公斤显示治疗(与nmol /毫升,与nmol /毫升trilinoleate trioleate,分别)。血浆FFA浓度显示趋势要比db / db / db +老鼠,但仍明显差异仅对亚油酸。显示治疗进一步降低血浆FFA浓度相比,db / db和db / +,但在这后一种情况没有达到意义阈值(表1)。
在糖尿病db / db的老鼠的肝脏,TG、FFA水平达到一个更高的浓度相比,db / +。从10毫克/公斤db / db的显示治疗进一步增加trioleate和油酸和棕榈酸。并行,RSG-treated db / db的老鼠的肝脏重量增加(+ 86%、+ 64%和+ 46%,10点30和100毫克/公斤显示,resp)和控制db / db老鼠。
正如所料,IAT体重高RSG-treated和控制db / db / db老鼠相比+老鼠(在未经处理的db / db老鼠;,和g在10 db / db小鼠治疗,30日分别显示和100毫克/公斤与 在db / g +老鼠)。相比之下,TG浓度相对于脂肪组织在db / +质量明显高于RSG-treated或未经处理的db / db。FFA脂肪组织浓度基本上保持不变在db / db和db / +或显示治疗后除了油酸在db / db的水平有或没有显示治疗远远超过那些db / +。
比目鱼肌重量是不变的病理学和治疗(表1),尽管控制db / db观察脂肪堆积和RSG-treated db / db比目鱼肌解剖。
3.3。胰岛素敏感组织的转录组概要文件db / +和RSG-Treated db / db
全球基因表达变化进行评估在三个胰岛素敏感组织,肝、IAT,比目鱼肌,参与葡萄糖和脂类代谢利用whole-mouse基因微阵列。基因表达差异db / +或RSG-treated db / db和控制db / db组过滤显示价值。001年,一个褶皱的变化(罗塞塔误差加权模型[19])。一个基因可能是由不同的基因序列(探测器)。基因改变之间的非糖尿病患者糖尿病db / db / +和db老鼠(见补充表在网上材料doi: 10.1155 / 2010/679184)决定在肝脏(6539监管序列),在比目鱼肌(7895监管序列),和IAT(13207监管序列)。显示治疗db / db老鼠引起重大变化在相当数量的基因的表达,观察之间的db / db / db +和糖尿病控制参照群体,即在肝脏(5567、4788和4549年调控序列,10点30和100毫克/公斤显示,职责),在IAT(5710、9005和10335年调控序列,10点30和100毫克/公斤显示,职责),和比目鱼肌(3413、3644和3620年调控序列,10点30和100毫克/公斤显示,职责)。
3.4。功能解释转录组变化的概要文件
解释生物变化,差异表达基因(db / +或RSG-treated db / db和控制db / db参照群体,补充表)与已知基因符号(雨果)提交给创造力途径分析。每个基因符号映射到相应的基因在独创性通路知识数据库中,和生物功能和疾病是基因表达的模式。函数从最重要到最不上市,水平线显示意义的截断值(调整Benjamini-Hochberg;补充图)。正如所料,在非糖尿病的db / +(糖尿病效果作为互惠(db / +对db / db),见下文)或在RSG-treated db / db老鼠,主要涉及基因表达的变化与脂质和碳水化合物代谢不仅在肝脏,而且IAT和比目鱼肌(补充图)。此外,集团在几个功能相关的基因也丰富细胞信号,运动,或开发在肝脏,脂肪组织和比目鱼肌。这些结果可以解释为diabetes-induced形态和/或增长改变肝细胞,脂肪细胞,细胞在db / db老鼠在db / db显示治疗。然而,在试图联系转录组和代谢组学数据我们集中研究基因参与脂类和碳水化合物代谢,并可能与糖尿病有关。这个列表包括506基因序列参与糖酵解、糖质新生,TG、FFA代谢,和磷酸戊糖的合成,以及基因参与线粒体功能,也就是说,氧化,柠檬酸循环和氧化磷酸化。此后,促进与显示的直接比较治疗效果,我们使用了互惠形式的糖尿病的效果,也就是说,未经处理的非糖尿病患者db / +与糖尿病老鼠db / db。因此,RSG-induced正常化的基因表达被定义为基因显著改变显示(RSG-treated db / db和db / db)在同一方向非糖尿病患者(db / +和db / db)老鼠。
3.5。显示对肝脏的影响Metabolic-Related mRNA的表达
在肝脏中276 506个基因序列差异表达在db / +和db / db(补充表)或RSG-treated db / db和db / db。补充图(一个)显示之间的差异表达基因微阵列数据概述精益db / +或RSG-treated老鼠和糖尿病db / db应变与葡萄糖代谢有关。如图1(一),值得注意的是,显示治疗导致部分或完全正常化mRNA的表达等关键酶基因编码糖酵解/糖质新生Glut-2, Gapdh, Pklr或Fbp1 G6pc。这些因素的影响尤为明显显示的100毫克/公斤。唯一的例外是Pdk4 mRNA表达下调在db / +老鼠,但增加RSG-treated db / db的老鼠相比,控制db / db。实时PCR用于确认微分在葡萄糖代谢相关基因的表达(补充表)。图2(一个)显示芯片比率测量有紧密的关联,通过PCR (;xy配对的数量= 23)。
(一)
(b)
(一)
(b)
(c)
(d)
相反gluconeogenesis-related基因,这似乎是正常显示治疗,微阵列数据概述表明大量的脂质代谢基因监管相反的方向db / +(补充数据(b)和1 (b))。这包括基因表达下调在db / +但都显著调节RSG-treated老鼠相比,db / db。例如,10毫克/公斤RSG-mediated upregulation基因参与脂类代谢合成(图1 (b)),如脂质转运蛋白Cd36 (+ 62%,),脂肪酸结合蛋白Fabp4 (+ 870%,),FFA和TG合成的关键酶,如ATP柠檬酸裂解酶(ace + 124%,),acetyl-CoA-carboxylase (Acaca + 87%,)、脂肪酸合酶(FAS, + 270%,),stearoyl-Coenzyme desaturase (Scd1 + 455%,)或参与了磷酸戊糖途径如转酮醇酶(Tkt + 74%,)和phosphogluconate脱氢酶(Pgd + 117%,)。这些结果证实了实时qPCR很强的相关性(补充表和图2 (b);;xy配对的数量= 155)。编码基因的表达增加脂肪生成的酶和磷酸戊糖途径可以考虑增加肝脏TG、FFA含量、肝脏(表和重量1)。
3.6。显示对IAT Metabolic-Related mRNA表达的影响
在脂肪组织中,在506年391年基因序列差异表达在db / +和db / db或RSG-treated db / db和db / db(补充表)。许多调节基因在db / +或RSG-treated db / db相对于db / db糖尿病小鼠(补充图和图3)可能刺激脂质代谢及线粒体功能。
肝脏相反,显示治疗IAT监管大部分代谢相关基因在同一方向观察到在db / +老鼠相比,db / db。事实上,与葡萄糖代谢有关的基因,FFA和TG新陈代谢,磷酸戊糖合成、和线粒体功能调节和/或由RSG-treatment正常化,其中一些具有明显的剂量效应(数字4(一),4 (b),4 (c))。显示治疗(10 - 100毫克/公斤)部分正常化mRNA表达(图4(一))等两个关键基因参与葡萄糖代谢的葡萄糖转运体Glut4 (Slc2a4 + 45%,在30毫克/公斤显示组和+ 114%,在db / +集团)的差别和丙酮酸脱氢酶激酶4对这些刺激葡萄糖代谢(Pdk4,- - - - - -37%,在30毫克/公斤显示组和没有改变在db / +组)。一方面,我们观察到部分基因编码FFA或正常化TG代谢酶包括Acaca(+ 163%, 30毫克/公斤显示组和+ 474%,在db / +集团)和Fasn(+ 240%, 30毫克/公斤显示组和+ 674%,在db / +集团)或磷酸戊糖途径的基因Tkt(+ 86%, 30毫克/公斤显示组和db / + 409% +组,)(图4(一))。另一方面,几乎所有参与线粒体基因氧化,柠檬酸循环、氧化磷酸化水平调节基因中观察到RSG-treated老鼠远远超过的db / +调节基因(数字4 (b),4 (c))。所有这些结果都验证qPCR技术,并有很强的相关性(补充表和图2 (c);;xy配对的数量= 96;图2 (d);,;xy配对的数量= 156)。
(一)
(b)
(c)
3.7。线粒体在db / db IAT接受显示更新
的基因表达改变脂肪组织建议db / db糖尿病小鼠线粒体功能障碍,但显示治疗似乎正常化这些改变的一部分。糖尿病和显示测试是否也影响了线粒体生物起源和功能在细胞水平上,脂肪细胞的线粒体的内容是由使用单克隆抗体特定OxPhos复杂的第四单元我(Cox1),线粒体膜结合蛋白复合物。相比我们有控制db / db和30毫克/公斤RSG-treated db / db脂肪细胞线粒体的内容,以避免任何可能的副作用的剂量100毫克/公斤。如图5,信号强度更强的脂肪细胞处理显示比控制db / db糖尿病小鼠()。这些结果证实了转录upregulation Cox1 (+ 74%;)观察到剂量30毫克/公斤,建议显示诱导线粒体生物起源在脂肪细胞,如前所述[23,24]。
(一)
(b)
3.8。显示效果在比目鱼肌Metabolic-Related mRNA的表达
506年比目鱼肌在监管186年基因序列差异表达在db / +和db / db或RSG-treated db / db和db / db(补充表)。比目鱼肌在碳水化合物和FFA代谢中起着重要的作用。是建立在肥胖有功能障碍的能力骨骼肌储存糖原。同时,增加了TG存储与标记的胰岛素抵抗呈正相关。补充图显示之间的差异表达基因微阵列数据概述精益db / +或RSG-treated db / db老鼠和未经治疗的糖尿病db / db参与葡萄糖和FFA代谢。更少的基因调节显示治疗肌肉相比,肝脏和IAT。然而,同样观察之间的基因差异表达db / +和db / db糖尿病老鼠,显示诱导的upregulation等碳水化合物代谢的关键基因Pkm2(+ 44%、+ 45%和+ 42%,30和100毫克/公斤显示,resp)和HK1(+ 57%、+ 60%和+ 69%)。此外,显示治疗导致基因的镇压参与脂质运输(图6(一)),像Cd36 (- - - - - -42%,- - - - - -30%,- - - - - -11%在10、30和100毫克/公斤显示,resp。)和Fabp4 (- - - - - -59%,- - - - - -35%,+ 30%)。显示也减少了在足总杯与TG代谢相关基因的表达,如Acaca (- - - - - -25%,- - - - - -40%,- - - - - -16%在10、30和100毫克/公斤显示,resp。)和MgII (- - - - - -32%,- - - - - -14%,+ 33%)(图6(一))。值得注意的是改变基因表达的诱导10毫克/公斤显示往往是最接近db / +和db / db比30和100毫克/公斤剂量(见图6(一)Acaca, Fabp4或Mgll)。这种趋势似乎是特定于比目鱼肌和建议可能的毒性或副作用的高显示浓度。综上所述,这些结果表明降低FFA吸收和增加葡萄糖利用率RSG-treated比目鱼肌的动物。
(一)
(b)
3.9。请分析
多元统计方法(PLS)已经应用为了建立潜在的转录概况和代谢参数的变化之间的关系(表显示下治疗1)。该方法利用线性回归模型潜在结构找到两个数据之间的相关性矩阵(X, Y)。显著差异表达序列(补充表)参与代谢被定义为预测变量(X)和FFA, TG(组织和等离子体)和葡萄糖浓度被定义为观测变量(Y)。保留基于模型解释平方和(%),预测平方和(%)和P价值。基于微分基因表达没有模型,使用的数据来自IAT(391序列)和比目鱼肌(186序列)可以获得。然而,差异表达序列的预测变量对应的肝脏(276)使我们获得重大请模型关于Y变量如油酸和trioleate组织浓度(表2)以及肝脏重量。数据7(一),7 (b)显示之间的相关性观察trioleate浓度或肝脏重量和预测的获得请使用40最佳序列构建的模型预测(和0.96,分别地)。在40序列预测肝trioleate浓度和体重,20是常见的。20中删除冗余预测导致16基因的13显示在其近端启动子由MatInspector PPRE Genomatix套件(见部分2和补充表)。一个有趣的观察是,使用组合的三个组织基因差异表达的基因序列(853)我们能够找到一个请模型,使预测基因序列之间的联系和血糖浓度。观察和预测使用40葡萄糖之间的相关性最好的预测因素导致一个可接受的模型(和;图7 (c)),但模型的预测效能仍相当薄弱()。在40预测35属于IAT, 4到肝脏,比目鱼肌和1。大量的IAT信使rna -(24/35)序列编码的蛋白质参与线粒体呼吸和三羧酸循环(表3)和3 4基因肝脏参与糖质新生。最后,在32个独特基因(对应于40基因序列),21了PPRE启动子调控序列。
(一)
(b)
(c)
这些观察强调之间的联系RSG-mediated PPAR激活和IAT线粒体功能相关基因的表达,肝脏糖质新生,调节血糖。
4所示。讨论
首次在这篇文章中,我们试图建立一个联系RSG-treated糖尿病老鼠的代谢状态(db / db)和RSG-mediated转录组变化的三个主要胰岛素依赖型组织包括肝脏、脂肪组织和骨骼肌。
正如预期的那样,许多基因调节显示,确定在本研究分为关键代谢途径参与碳水化合物和脂质代谢。PPAR受体激动剂也调节许多基因在脂肪组织超过肝脏和骨骼肌,正如所料,基于PPAR表达水平在各自的组织。尽管这种差异,我们的数据表明,PPAR激活有协调作用在这些组织的基本代谢途径,包括骨骼肌葡萄糖和脂类代谢,糖质新生在肝脏、脂肪生成、TG存储,并在脂肪组织线粒体功能。基因转录调制显示可以分为两种类型,即那些抵消diabetes-induced变更和关联中观测到的调制db / +和db / db和那些强调糖尿病引起的变更和具有负相关性。第一组可以解释PPAR的葡萄糖和降脂的行动受体激动剂,和第二组与服用tzd compound-mediated副作用。
4.1。肝
一个最有趣的观察是,显示治疗正常葡萄糖稳态在db / db老鼠(这里给出结果,在15])的mRNA表达gluconeogenic关键酶如G6pc Fbp1,葡萄糖转运体Glut-2。这些结果表明,转录调节G6pc和Fbp1 mRNA在RSG-mediated减少糖质新生中发挥作用和血糖正常化。这一观测结果与之前的研究结果相一致显示增加G6pc Fbp1活动在db / db老鼠和随后的db / db肝葡萄糖生产的增加(25]。
在人类,肝醣类是显著增强2型糖尿病和正常显示(10,26]。因此,G6Pc和Fbp1的转录状态,相关RSG-mediated糖质新生正常化,值得进一步研究。
在啮齿动物thiazolidinedione治疗的副作用之一是与肝脏功能障碍有关。RSG-treated db / db老鼠显示肝体重和脂肪变性的外表,正如前面所示(12]。事实上,强有力的antihyperglycaemic显示伴随着增加的影响新创合成脂肪酸相比,db / +或db / db。脂质代谢组分析整合与我们获得的基因表达分析在肝脏和证实了之前的研究中获得的结果(13]。增加肝基因表达属于众多下观察肝脏TG合成的步骤显示治疗包括那些编码FA转运蛋白(Lpl、Cd36 Fabp2 4), TG (Gpd1)和FFA合成(ac、Fasn Acaca, Gpd1, Agpat2, 6日Scd1)和可能相关的肝trioleate RSG-mediated增长水平。这个结果与人类和正常小鼠的显示效果,在治疗慢性显示减少肝脏脂肪(27,28]。但是db / db是一个缺乏瘦素信号模式,和大量的出版物在野生型小鼠瘦素减少肝新创FA通过减少信使rna,蛋白质的合成,或酶活动的FFA和TG代谢酶包括ac, Acaca, Fas, Scd-1或Agpat [29日- - - - - -33]。因此,老鼠缺乏瘦素信号不是最好的范例预见到PPAR激动剂副作用在人类肝脏。
4.2。腹股沟脂肪组织
不仅在脂肪组织中,线粒体脂肪酸氧化的主要网站,但也可能发挥重要作用在脂肪生成提供了TG合成的关键中间体。受损的线粒体可能导致缺乏ATP和随后的减少在脂类代谢23]。这个功能障碍可能与降低葡萄糖的利用能力,参与高血压糖尿病小鼠的血糖水平。ATP下降也可能影响发病的合成和分泌,这以前与糖尿病有关(34]。在我们的研究中,显示显著诱导增加存在剂量依赖的相关性在许多基因与线粒体的活动。基因编码的酶参与氧化,柠檬酸循环,和氧化磷酸化调节以类似的方式观察db / +和db / db老鼠。此外,我们发现一个PPAR upregulation共激活剂PGC1(数据未显示),这是众所周知的,强有力地激活线粒体生物起源在脂肪和肌肉组织(24,35]。结合免疫细胞化学结果,这些数据显示,显示治疗导致线粒体生物起源的增加。PPAR的影响受体激动剂对线粒体数量和形态以前观察到大鼠和狗的脂肪组织中处理显示(36]。显示也是诱导脂肪细胞的分化和线粒体生物起源37]。这些新的小脂肪细胞胰岛素敏感和具有更高的脂质代谢能力可以解释RSG-increased信使rna的基因参与脂质运输和氧化。的IAT由褐色脂肪组织(蝙蝠)和白色脂肪组织(窟)。我们的数据显示upregulation蝙蝠标志Ucp1或Cpt1b IAT治疗小鼠,如他人所述34]。这个观察支持显示的视图转换窟蝙蝠,IAT转化成的脂肪机械。他们还建议,减少外围组织的脂质可以改善全身胰岛素敏感性。
4.3。比目鱼肌
高血糖症的正常化RSG-decreased肝葡萄糖合成和输出似乎结合更好地利用葡萄糖在比目鱼肌。事实上,RSG-treated老鼠基因编码关键酶表达的增加参与糖酵解,像Hexokinase1 Hk1,烯醇酶Eno3,或丙酮酸激酶Pkm2,类似于我们的观察在db / +和db / db。显示治疗db / db也导致协调降低一些基因的表达在肌肉脂肪酸运输和代谢。值得注意的是这些基因的表达在肝脏和一定程度上调节IAT显示,表明PPAR激活促进脂肪酸进入肝脏的通量和脂肪组织和肌肉。总之,这些数据表明减少依赖脂肪酸和葡萄糖作为能源的依赖增加肌肉,如前所述[2,38]。令人惊讶的是,RSG-mediated肌肉细胞中基因表达正常化观察主要是在10毫克/公斤剂量,而最高剂量诱导基因的表达与葡萄糖和脂质通路在相反的方向以db / +和db / db,建议一个可能的负面影响在这个组织中药物浓度更高。
4.4。请模型
利用实验设计包括转录组和代谢组学方法,我们应用一个多元线性回归模型(PLS)为了预测(即代谢参数。、血糖和FFA和TG从血液和组织)基于监管基因(预测(X)变量)。只有变量X从肝脏允许我们推导模型显著预测的一些测量生物参数,比如肝脏油酸和trioleate以及肝脏重量。值得注意的是,最好在40预测20(16基因)是常见的trioleate和肝脏重量之间的模型。事实上,其中16个基因13显示PPRE因此应该是由PPAR激动剂强化了predictory这20个基因序列的状态。显然应该进行更多的实验显示不同剂量治疗证实了这些预测。此外,没有明显的模型可以建立微分从肝脏和血液代谢基因表达数据参数,和没有模型可以获得IAT和比目鱼肌组织和血液代谢参数。然而,最有趣的观察是,模型验证与血糖水平和基因表达数据的组合3组织。看着40时最好的预测,我们发现大部分基因序列隐含IAT-expressed基因(35/40),并在35岁25编码线粒体蛋白质参与能源电池生产和4基因序列来自肝脏和参与糖质新生。在这种情况下我们可以假设,那些血糖预测与分子机制,因为;(i)线粒体功能障碍与糖尿病2型和thiazolidinediones已知改善糖尿病由生产更多的脂肪细胞功能状态; (ii) in db/db mice high levels of blood glucose partially is due to gluconeogenesis [25)和显示减少信使rna编码gluconeogenic酶可能确实调节血糖。
因此,请不仅揭示了IAT /肝预测血糖调节也是一个潜在的分子机制,该机制可以解释部分葡萄糖调节。这种机制是否由于直接PPAR全身的转录或PPAR交互影响与线粒体蛋白质如MitoNEET [39],随后激活线粒体功能还有待调查,但是大多数基因在前40预测序列(21/32)基因在各自的启动子预测PPRE显示。
5。结论
据我们所知,这是第一个研究比较基因表达谱与db / + RSG-treated db / db控制糖尿病db / db在肝脏、肌肉和脂肪组织。转录组和代谢组学方法的结合导致了一个全面的分子肖像和假设的影响存在剂量依赖的相关性显示在db / db糖尿病小鼠和突出了各自的胰岛素依赖型组织的作用。这种方法可能是有用的在未来区分选择性PPAR调节器对其特定分子概要文件与特定的目标组织。
缩写
| 远期运费协议: | 游离脂肪酸 |
| 显示: | 罗格列酮 |
| IAT: | 腹股沟脂肪组织 |
| PPAR: | 过氧物酶体proliferator-activated受体 |
| PPRE: | PPAR响应元件 |
| 请: | 偏最小二乘 |
| TZD: | Thiazolidinedione |
| TGs: | 甘油三酸酯 |
| UPLC-MS: | 超高液相色谱-光谱法。 |
承认
作者要感谢c . Bourrier Naime,和j·理查德(Servier研究所de生僻、Croissy-sur-Seine、法国)的专家技术援助。
补充材料
补充图1:细胞和分子功能改变由II型糖尿病和罗格列酮治疗。
补充图2:二维表示的差异表达基因在肝脏代谢碳水化合物(A)和肝脏FA和TG新陈代谢(B)。
补充图3:二维的代表参与IAT FFA和TG新陈代谢的差异表达基因。
补充图4:二维表示的差异表达基因比目鱼肌脂类和碳水化合物的新陈代谢。
补充表1:概述序列的数量增长和衰减在db / +和RSG-treated样本而db / db。
补充表2:补充表2:差异表达基因(506序列探针)参与脂类和碳水化合物的新陈代谢。
补充表3:补充表3:肝脏和IAT实时PCR与相应的微阵列数据分析和比较的结果。
补充表4:补充表4:常见的肝脏trioleate序列预测浓度和重量,使用请分析决定。