文摘
过氧物酶体proliferator-activated受体δ(PPARδ)调节多种生理过程与葡萄糖和脂质代谢有关,炎症和增殖。一个或多个这些过程可能产生的风险因素与PPAR的能力δ在某些器官受体激动剂促进肿瘤发生。在目前的研究中,我们描述了一种新的胃肿瘤小鼠模型依赖于强有力的和高度选择性PPARδ受体激动剂GW501516致癌物后管理。胃肿瘤发生的过程是快速由磁共振成像和导致的高转移性鳞状细胞癌在两个月前胃。肿瘤发生与基因表达有关签名表明细胞粘附,入侵,炎症和代谢。增加PPARδ表达在肿瘤相关基因增加,一种蛋白激酶,β连环蛋白,S100A9表达式。转移性胃肿瘤的快速发展在这个模型将用于评估这种疾病预防和治疗干预措施。
1。介绍
胃癌是癌症死亡的第二大原因。在全球范围内,尤其是在发展中国家,由于其自然转移诊断的时候(1,2]。在众多胃癌的危险因素是饮食,吸烟,和炎症相关幽门螺旋杆菌感染(3- - - - - -5]可能加剧患者促炎基因多态性(6]。
PPARs是ligand-dependent核受体调节的表达与代谢疾病相关的基因的多样性,如II型糖尿病和脂肪代谢障碍(7,8]。PPARs包括α,γ和δ同形像,不仅调节葡萄糖和脂质代谢,而且扩散,炎症和血管生成(9- - - - - -13]。PPARδ表达式是增加乳腺癌、结肠癌、头颈肿瘤(9,14- - - - - -17),与更积极的在乳腺癌细胞表型18]。选择性PPARδ受体激动剂GW501516作为肿瘤启动子在乳腺致癌作用19)和结肠肿瘤发生[15,20.,21),而PPAR中断δ乳腺表达块(22)和结肠肿瘤发生[23,24]。PPARδ是受风险因素与癌症恶化,包括k - ras基因(25],Wnt [26,网页/ Cox2 [22,27),与激活的血管生成20.,28- - - - - -30.]。PPARδ通过NF调节促炎的信号κB和il - 1β(31日),激活花生四烯酸代谢的代谢产物作为PPAR配体(14,29日,32]。尽管这些结果,有几个报告显示azoxymethane-induced结肠PPAR致癌作用增加δnullizygous老鼠(33,34)和选择性PPARδ配体GW0742 [35)(审核(36])。差异可能占的各种nullizygous模型讨论了其中的一些差异(9,21]。
在这里,我们表明,PPAR的激活δ通过选择性受体激动剂、GW501516迅速引发高转移性胃肿瘤后致癌物质管理,这表达了明显增加炎症基因表达的签名。这些发现表明PPAR的至关重要的作用δ在这种疾病的进展。
2。材料和方法
2.1。材料
GW501516合成如前所述[37),是由化学预防提供分支,NIH,马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所。
2.2。致癌作用
DMBA (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)溶解在棉籽油的浓度为10毫克/毫升,女性和六个星期FVB老鼠服用4周剂量的1毫克DMBA填喂法。吃普通食物的同类动物或饮食补充0.005% (w / w) GW501516开始一天后最后一剂DMBA如前所述[19]。小鼠安乐死时,胃肿瘤达到≥2厘米3由核磁共振成像或者老鼠成为垂死挣扎。所有协议都是乔治敦大学动物保健和使用委员会批准。
2.3。磁共振成像
MRI进行7.0特斯拉的力量水平光谱仪/成像仪20厘米孔配备100高斯/厘米缩微成像梯度和由Paravision 4.0软件的临床前成像研究实验室,Lombardi综合癌症中心。小鼠麻醉使用1.5%异氟烷和30%氧化亚氮,定位在一个定制的立体定位动物持有人与温度和呼吸控制,和成像72毫米鸟笼射频线圈体积如前所述[38]。使用成像协议是t2加权罕见(快速收购重新反射)使用以下参数:二维序列矩阵:256年,TR: 5822 msec, TE: 36米秒,平均数量:4,罕见的因素:8,视场:4.0厘米,片数量:4片厚度:0.5毫米,呼吸门控占呼吸运动。
2.4。组织病理学和免疫组织化学(包含IHC)
胃和肿瘤切除,formalin-fixed石蜡包埋部分准备)包含IHC染色。抗原检索是由孵化的组织部分在10毫米柠檬酸钠缓冲(pH值6.0)20分钟在电动船subboiling温度如前所述[19,39]。内源性过氧化物酶活性与3%过氧化氢淬火10分钟和30分钟孵化屏蔽解决方案Tris-buffered盐水山羊血清(10%),其次是孵化一夜之间在4°C与适当的主要抗体稀释阻挡的解决方案。Biotin-conjugated二级抗体稀释在TBS含有0.1% Tween-20和孵化30分钟在室温下使用ABC Vectastain(向量实验室)检测系统和diaminobenzidine(皮尔斯),和幻灯片复染色与Harris-modified苏木精(费舍尔科学)和脱水和安装在Permount(费舍尔科学)。下面的抗体及其稀释使用:anti-CK14 (1: 200 - 115 p1女士,Neomarkers), anti-CK18 (sc - 7197 1: 200年,圣克鲁斯生物技术),基因(1:50,sc - 17765,圣克鲁斯生物技术),anti-pS473 Akt(1: 200、40515、细胞信号生物技术),反β连环蛋白(1:50,sc - 7963,圣克鲁斯生物技术)和anti-S100a9 (1: 50, sc - 65580,圣克鲁斯生物技术)。
2.5。基因微阵列分析
分析了三组组织:(1)胃肿瘤,(2)前胃(nonglandular) GW501516-treated老鼠,和(3)从DMBA-treated小鼠前胃。组织切除,洗在磷酸盐,并存储在RNAlater (Ambion)- - - - - -20°C到RNA提取。组织在液氮snap-frozen,粉在研钵和研杵,RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒)根据制造商的协议。RNA纯度被一个评估260年/一个280年比≥1.9,18岁的完整性和28 s rRNA使用安捷伦的微流控芯片。数组进行分析cRNA准备从等量的RNA (1μg)汇集从5老鼠每组如前所述19,40]。Biotin-labeled cRNA分散在94°C 35分钟,一夜之间杂化Affymetrix鼠标430 2.0 GeneChip代表约14000带注释的老鼠的基因。GeneChips安捷伦基因阵列扫描仪进行扫描,和网格对齐和原始数据生成Affymetrix GeneChip 1.1操作软件。噪音值(基于低强度探测细胞是用来计算的方差为每个GeneChip最小阈值。平均样本和数据提炼通过消除基因与信号强度< 300在两个比较组,热图≥3重产生改变基因表达的规范化治疗前胃使用无监督层次聚类分析(如前所述)(41]。基因本体论分析利用阿里阿德涅通路Studio 7.1版本
2.6。定量实时聚合酶链反应(存在)
总RNA提取如上所述,等量的RNA (1μg)汇集从每组(每组5样品)和反向转录Omniscript RT工具包(试剂盒)总量的20倍μL如前所述[19,39]。使用ABI-Prism 7700 PCR进行了一式三份(应用生物系统公司,培育城市,CA) SYBRGreen我检测(试剂盒)根据制造商的协议。使用合适的引物扩增(见表S1在补充资料http://dx.doi.org/10.1155/2010/571783)证实了溴化乙锭染色的PCR产物琼脂糖凝胶。每个目标基因的表达规范化GAPDH和提出了目标基因的比例GADPH表达式使用公式计算,,在那里。
3所示。结果
3.1。PPARδ受体激动剂GW501516迅速促进胃肿瘤发生
老鼠与PPAR保持节食补充δ受体激动剂GW501516致癌物后政府导致胃肿瘤的快速发展在12/15的动物,而治疗GW501516或DMBA不是肿瘤发生的(表1)。更精确地遵循肿瘤发生的发病和进展,五个老鼠被MRI监控(图1(一))。肿瘤可见早在19天之后开始GW501516饮食和似乎开始在前胃(图1(一))。到50天,肿瘤已经充满了胃腔,并通过胃到56天,墙(图1(一))。总胃的检查证实肿瘤局限在胃在20天,但已经入侵通过胃壁形成当地白天转移56(图1 (b))。老鼠显示发病率天63年和70年之间(平均生存67天),在肠系膜转移在场和相邻浆膜器官表面包括腹壁(图1 (b))。
(一)
(b)
原发性肿瘤和转移与不同程度的角质化均匀鳞状细胞癌(图2(A))。动物喂养GW501516饮食治疗6个月事先DMBA没有展览增生或发育不良(图2(B)), DMBA治疗仅产生鳞状细胞增生的前胃不发育不良的迹象(数字2(一)和2(B))。任何改变发生在胃粘膜造成DMBA GW501516治疗(数据未显示),和食管鳞状上皮被DMBA治疗(图未受影响2(B))。胃肿瘤鳞状基底细胞标记CK14是积极的,和消极的柱状上皮细胞标记CK18 [42)(图2(C))。
3.2。差异基因表达在胃肿瘤和胃部
肿瘤表现明显炎性表型用趋化因子表达增加Cxcl-1, 2、5、9、-14和Ccl-2, 3, 8日S100a8, S100a9, S100a3和白细胞介素il - 1β、il - 6和IL-24(表2,图3 (b)和表S2)。除了这些变化,增加前列腺素代谢基因的表达Ptgs2 / Cox2和ptg PPAR的表达式γ和PPARα被指出。来确定这些变化是肿瘤特定基因表达是胃部组织的评估治疗后与GW501516七天(图3(一个)、表S3)或DMBA 4周(表S4)。GW501516只有五个基因的表达增加三倍,≥Angptl4, Cyp2b10, Cfd /脂肪酶,Adipoq Chi3l4和显著减少了恐吓的表情,Ccla3, Glycam1, Spp1, Serpina1a, Cela1, Cldn2, Fabp2(表S3)。S100a9 DMBA S100a8表达的增加,Ccl8 4-10-fold和减少表达相同的基因子集GW501516(表S4)。因此,恐吓的变化,Ccla3、Glycam1 Spp1, Serpina1a, Cela1, Cldn2, Fabp2由于GW501516肿瘤治疗和不具体。另一方面,DMBA产生炎症反应用增加S100A8 Ccl8 S100A9,尽管这是一个数量级低于肿瘤。增加Krt6a DMBA符合增加角质化的胃(图2(B)),但明显低于肿瘤。一般实时存在分析证实了几个基因的表达变化,包括Cldn8,处于受控,Cxcl5, Foxg1, S100a8, Angptl4, Cyp2b10, Vegfα俄罗斯Bmp3战车,恐吓Spp1 Dkk1,, Bmp4, PPARα,PPARγ(图3(c))。
(一)
(b)
(c)
PPAR的表达δ和已知因素与肿瘤的信号进行评估和前胃GW501516治疗后(图4)。GW501516增加PPAR的核本地化δ在胃鳞状上皮和肿瘤,相比之下其扩散细胞质染色在未经治疗的胃组织中。GW501516也引起强烈pS473Akt和pT308Akt染色在基底细胞和粘膜层,以及在肿瘤和间质组织,与更强烈的基因表达。β连环蛋白表达基底鳞状上皮细胞和细胞核的不是GW501516改变的治疗,而肿瘤表达增加β连环蛋白在细胞连接。S100a9在治疗胃上皮缺席,但表达内皮和上皮细胞从GW501516-treated老鼠。肿瘤表达S100a9扩散模式,具有较强的表达血管和相邻的上皮细胞。
4所示。讨论
本研究描述了一种新的模型依赖于肿瘤的转移性胃癌PPAR的推广活动δ受体激动剂GW510516致癌物后管理。与之前的一项研究报告较低比例的鳞状细胞癌的前胃DMBA [43),我们DMBA方案仅前胃增生没有发育不良的迹象(图五个月后治疗2(B))。这表明高灵敏度的小鼠前胃鳞状上皮发育不良,和偏爱GW501516促进肿瘤的histotype [19]。该模型不同于N-methyl-N-nitrosourea-induced胃肿瘤在野生型和APC最小值转基因小鼠(44,45),因为它依赖于DMBA-induced诱变和GW501516的肿瘤促进作用。该模型的一个特性是它的短延迟大约三周相比,10到20周NMU-treated野生型和APC最小值老鼠。一个重要的组织病理学的区别,也许GW501516肿瘤模型的缺点,是它产生的鳞状细胞癌nonglandular前胃而不是从腺腺癌组织,包括大多数的人类胃癌(46]。因为这个模型是选择性PPAR依赖δ受体激动剂GW501516 [47),重要的是要注意,使用的剂量的GW501516现在和以前的研究(19]相当于每日口服剂量的3 - 10毫克/公斤,以前特别加强PPARδ端依赖脂肪酸氧化在老鼠48]。此外,PPARδ受体激动剂GW7042,几乎相同的结构GW501516,力量,和特异性,在PPAR在诱导基因表达活性δ基因敲除小鼠(49),这表明GW501516的肿瘤促进效应和GW7042不是因为脱靶效应。
GW501516表现出明显的炎症引起的肿瘤基因表达特征主要由趋化因子,MMP和S100基因(表S2)。这是意想不到的缺乏类似的签名与GW501516治疗后(表S3),事实上,GW501516诱发巨噬细胞抗炎反应(50和保护心脏免受氧化应激51,52]。基因本体论胃肿瘤的基因表达分析表明,PPARδ,MMP13 MMP12处于受控,Cxcl5 S100A8, S100A9分享共同和不同的通路相互作用可能导致肿瘤发生的表现型(图5)。PPARδ与激活扩散相关的基因(表皮生长因子受体,Akt1)和附着力(Itgb2),而S100A9与血管生成(Fgf2)和炎症(蒸机)。处于激活扩散(Mapk3 Mapk14, Akt1),血管生成(Fgf2)和入侵(MMP2, MMP9), Cxcl5激活其它趋化因子(Cxcl2,处于受控和Cxcl3)和Ptgs2 / Cox2。这个方案重申S100A8能力和S100A9作为配体为蒸机(晚期糖成品受体)介导急性和慢性炎症,肿瘤发展和转移(53,54]。这种模式也符合GW501516-induced激活ptg和Ptgs2 / cox - 2表达(55,56),启动生产环前列腺素(14和花生四烯酸代谢物29日作为PPAR]δ配体(57]。因为cox - 2抑制剂减少炎症相关的胃肠道致癌作用[58,过度增加或删除Ptgs2或抑制肿瘤发生,分别为(59,60];这表明PPAR之间的协同δ和炎症信号通路在胃肿瘤发生。PPAR的能力δ在正常细胞有抗炎效应(51,52在肿瘤)和促炎效应让人想起TGF -的双重角色β在肿瘤细胞(61年,62年]。TGFβ可以作为促炎细胞因子激活S100A8和S100A9表达式的Ras激活(63年),但作为一个阻遏的inflammation-induced PPARδ表达在正常细胞(64年,65年]。增加PPAR的表达式δ目标基因、Agptl4 TGFβ激活基因Runx1和Runx2, S100A8 S100A9胃肿瘤的确提出了一个二元性的PPAR的函数δ和TGFβ信号在胃肿瘤发生。
PPARδ广泛表达于胃肠道组织和胃肿瘤(27],GW501516引起PPAR增加δ核染色和高架pAkt在胃上皮细胞和肿瘤。PPARδ需要依赖激活Akt PPAR的促生长和凋亡的影响δ(66年- - - - - -68年),如图所示,PPAR的延迟愈合反应δ缺角化细胞(57,69年]。增强Krt6a和肿瘤进一步表明,PPAR Krt16表达式δ扮演着一个重要的角色在胃鳞状细胞分化和组织更新。
肿瘤也减少PPAR展出γ和PPARα可能造成的表达式,在一定程度上,从负PPAR的监管γ由PPARδ(70年]。PPARγ抑制了增长和入侵人类结肠(71年和胃72年,73年)和中晚期食管癌细胞(74年],PPARγ(75年)和PPARα有抗炎的行为76年]。因此,减少PPARα和PPARγ表达可能是一个额外的促进机制促炎和GW501516肿瘤促进作用。
总之,我们描述一个迅速发展的转移性胃癌模型依赖的肿瘤促进作用GW501516致癌物治疗后,这表明PPAR的促炎的开关δ函数。因此这种动物模型将有助于描绘PPAR的角色δ在肿瘤发生和发展作为一个可能的早期干预的目标。
确认
这项工作是支持的批准号R01 CA111482和合同编号。N01 CN43309从美国国立卫生研究院的贝塞斯达,MD。这次调查是使用动物研究,进行组织病理学和组织,基因组和表观基因组学,临床影像共享资源支持的研究机构改进批准号C06 RR14567国家研究中心的设施,和癌症中心支持批准号1 e - ca - 51008来自美国国家癌症研究所。作者感谢易简李帮助MRI。