文摘

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγ )是一种最广泛研究ligand-inducible转录因子(TFs),能够调节其转录活性构象的变化。特别感兴趣的,因为它是多向性的功能:它起着关键作用的关键基因的表达参与脂肪形成,脂质和glucid新陈代谢,动脉粥样硬化,炎症和癌症。其蛋白亚型,宽PPAR的数量 目标基因、配体和coregulators有助于确定其功能的复杂性。此外,遗传变异的存在可能会影响靶基因的表达水平尽管的影响PPARG基因变异在目标基因的表达并不是完全理解。大规模并行测序平台的引入下一代测序(门店)的时代已经彻底改变了调查遗传性疾病的遗传原因。在这种背景下,DNA-Seq identifying-within编码和管理的区域PPARGgene-novel核苷酸变化和单相关人类疾病,ChIP-Seq PPAR定义 绑定地图,RNA-Seq解开广泛和复杂的基因通路由PPARG表示难以置信的步骤PPAR的理解 在健康和疾病。

1。介绍

基因转录需要一个复杂的内部网络和细胞外信号,如激素、外源性物质,微,营养素(脂质代谢、维生素、离子等)和药物,收敛于细胞核后不同的通路,导致每个组织中的每个基因的表达。这是一个当前假设转录主要是由环境因素,通过直接和间接的机制。外源性和内源性信号影响基因转录,翻译成一个细胞生理反应需要协调行动和转录因子的微调(TFs)代理在DNA水平,包括那些属于核受体(NR)总科1,2]。

人类的NR总科包括48 ligand-inducible应对多种转录因子刺激并能调整他们的转录活动通过构象变化3]。最广泛研究这个TF总科的成员是过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs,也称为核受体家族1 c, NR1C)。晶体的研究表明,所有的关系,总科成员,其中PPARs,有着共同的结构特点,包括缺乏守恒的氨基端a / B域(潜在transactivation域AF-1),一个高度保守的DNA结合域(DBD),有两个锌指图案,c端区域包含配体结合域(小黑裙)和授予ligand-dependent transactivation函数(AF-2),和一个长度变量之间的铰链区DBD和小黑裙4]。

PPARs函数与类维生素a形成X受体(RXR NR2B)及其特遣部队活动是由配体的结合,互动与coregulators(活化剂和阻遏蛋白),和dna结合网站(5]。

在基础状态,PPARs-RXR复杂势必辅阻遏物和转录活性。绑定的内源性或合成配体AF-2领域促进一个构象的变化,导致辅阻遏物的释放,使招聘的- - - - - -和相互作用- - - - - -辅活化因子(6]。这些蛋白质具有或招募蛋白,组蛋白乙酰转移酶(HAT)活动允许绑定和启动转录的RNA聚合酶II复杂目标基因(4,7]。

PPAR基因表达在不同的器官,如生殖和主要目标organs-liver胰岛素,白色和棕色脂肪组织(窟和蝙蝠,resp),和骨骼muscle-cardiac组织,和其他8]。他们一直与不同的生物通路从脂质和葡萄糖体内平衡和胰岛素敏感,控制细胞增殖和分化,组织损伤和创伤修复、炎症和免疫(9]。

PPARs发生在三个不同的同形像,称为 (NR1C1), / (NR1C2), (NR1C3),由三个独立的编码基因,人类22号染色体的本地化q12-q13.1 [10),6 p21.2-p21.1 [11),和3 p25.2 [12),分别表示组织的方式。所有三个同形像能够结合,不同的亲和力,DNA反应元素相同的共识,叫过氧物酶体扩散者响应元件(PPRE) [13]。尽管大量的同源性和共享的证据转录目标,每个PPAR的生理功能是独一无二的。

PPAR ,最好的学习PPAR家族的成员,在preadipocytes分化成脂肪细胞诱导和表达最丰富窟和蝙蝠14]。PPARs人类生理有很大的相关性,但他们也参与许多人类疾病的病因,在这种大赛,PPAR 特别感兴趣的,因为它是多向性的功能:它起着主导作用的控制大量的基因的表达与广泛的生理过程,如脂肪细胞分化,新陈代谢,动脉粥样硬化,炎症和癌症。

替代促进剂的使用和信使rna剪接产生至少7 PPAR 亚型:5 的信使rna由交替拼接外显子A1, A2, B, C, D在各种组合。每个接头不同变体只在5 utr:外显子5 结束或勤杂人员占最终PPAR翻译 蛋白质(15,16]。特别是,研究PPAR 1和PPAR 2有不同的氨基端部分,不同的存在额外的28(鼠标)-30(人类)PPAR的氨基酸 (2对碘氧基苯甲醚17,18]。PPAR 1的表达式可以由多个启动子( 1, 3, 4),是所有PPAR表达 而PPAR表达组织和细胞 2几乎只存在于脂肪组织(19,20.),产生明显的脂肪形成的活动。

两个PPARG基因3 拼接变体- - - - - -缺乏几乎整个的小黑裙- - - - - - ORF4和PPAR 1 占主导地位,已经被确认为负与PPAR 野生型(21,22];因此他们不能够促进transactivationPPARG目标基因。

PPAR的相当数量 亚型以及其他NRs,强烈表明,剪接核受体功能起着重要的作用。此外,大量的PPAR 目标基因、配体和coregulators(辅活化因子和辅阻遏物)PPAR带来额外的复杂性 函数。此外,PPAR的改变 trans-activating必须分析能力的环境因素,遗传背景,和它们之间的相互作用23]。

本文总结了PPAR施加的转录调控 在关键目标基因和最常见的影响PPARG基因核苷酸的变化它的功能,也接近下一代测序(上天)技术将允许空前的准确性和完整性PPAR的研究 和其他转录因子。事实上,本文详细描述了如何将这些新技术将允许识别小说的遗传变异和多态性(snp) PPARG基因,绘制高分辨率绑定PPAR的地图 在整个基因组,并理解PPAR的转录调控 调节基因。

2。PPARG和基因表达调控(目标基因)

PPAR 生物过程控制几个数组,通过调节特定目标基因的表达主要通过ligand-dependent机制(24]。PPAR 配体包括一个惊人的各种天然配体(25)如前列腺素PGJ2、亚麻、二十碳五烯二十二碳六烯,花生四烯酸,合成配体,如噻唑烷二酮类),L-tyrosine-based化合物,一些非甾体类抗炎药,各种各样的新的化学类。

PPARs, PPAR 其中,像许多nonsteroid NR家族的成员,作为预留与rxr形成(26]。形成能够绑定PPRE组成规范的直接重复AGGTCA half-site隔开一个碱基对(根据DR1)与上游特异性元素AAACT [13,27]。通常,rxr函数并不孤单,而是担任几个关键的主监管机构监管途径,结合不同关系的合作伙伴。

最近这个问题更好的阐明通过使用标准染色质免疫沉淀反应(芯片)加上大规模测序总会在平台上(更详细描述部分4.2题为“转录因子和ChIP-Seq”)(28]。在这项研究中作者异形PPAR 在脂肪形成的分化(图-和RXR-binding网站1)。他们发现了微分时空招募PPARs和RXR目标网站在脂肪生成;特别是,在分化的发生DNA入住率RXR单独检测。之后立即,有趣的是,许多这样的网站成为被RXR占领和PPAR ,低表达成脂肪细胞。此外,通过早期的分化,他们观察到一个不同的时间和创作模式的入住率PPAR之间切换 和PPAR ,这成为主要RXR伙伴整个脂肪形成,恰巧与PPAR显著增加 1和PPAR 2表达[28- - - - - -30.]。RXR孤独的绑定- - - - - -在分化的早期阶段- - - - - -在目标站点上后受PPAR的约束 :RXR复杂假设作为后续PPAR所需签名 端依赖绑定和/或激活靶基因的转录28]。


图1
小说洞察PPARG世界槽新方法。的配体(上),PPAR 结合其PPRE异质二聚体与RXR激活或抑制靶基因的表达。PPAR的图总结了新颖的分子机制 通过ChIP-seq获得的。PPAR ——和RXR-binding网站被ChIP-seq揭示不同的空间和时间激活不同的代谢途径和RXR二聚体成分的变化在脂肪生成(右面板,研究[28])。 在脂肪细胞和巨噬细胞:组织细胞类型特异的coregulators监管区域采用C / EBP 在巨噬细胞在脂肪细胞和PU.1(降低面板;ChIP-Seq研究[31日])。

转录取决于调制的代数余子式的招聘能够改变染色质结构使它更容易招聘和组装的基础转录机器的核心启动子目标基因(32,33]。事实上,它已被广泛认为染色质转录机械可访问性,通过组蛋白修饰(乙酰化、甲基化、磷酸化、ubiquitylation sumoylation, deimination, ADP核糖基化,和脯氨酸异构化)表示,一个非常相关的过程分为基因表达调控(34- - - - - -37]。鉴于这一点,不同的时间- - - - - -和组合模式- - - - - -居住在这些结合位点,尼尔森和他的同事观察到(2008)(28)可能需要这样的染色质重塑位点PPAR,使这些地区访问 :RXR绑定和随后transactivation目标基因。

尽管PPAR :RXR异质二聚体控制许多诱导基因的表达,转录调控全球和本地的不同因素。确定哪些特异性辅活化因子/辅阻遏物被PPAR招募 在不同的细胞类型,以及这些可能导致染色质的修改和微分基因表达,为实现我们的差距是一个至关重要的问题向PPAR的理解 生物学和功能。

目前认为教条,主要是指所有TFs,细胞类型特异的trans-activating能力是由于合作绑定其他cell-type-selective因素,特别“驾驭”特遣部队的目标基因。

然而,尽管众所周知,PPAR 能够调节靶基因的表达在某些细胞类型而不是其他人,分子机制的能力尚未阐明。微分PPAR的绑定 目标基因或其微分的PPRE活动(即DNA水平。,in chromatin remodelling) has been claimed as the putative mechanisms accounting for the cell-type specificity of its action [38]。

Lefterova非常最近出版的工作和他的同事(2010)(31日)提供了新颖有趣的洞察细胞类型特异的基因表达的分子基础在初级小鼠脂肪细胞和巨噬细胞。作者通过使用ChIP-Seq(见部分4.2),确定PPAR的分子特征 绑定,披露不同的巨噬细胞,adipose-specific PPAR 绑定的网站整体基因组。此外,他们阐明PPAR的特异性表达 目标基因,展示PPAR的紧,井然有序的合作 和其他细胞类型特异的蛋白质至关重要(PU.1和C / EBPb,附近的巨噬细胞和adipocyte-specific目标基因,分别地。)(见图1)。“PPAR 舞蹈与不同的合作伙伴”38),和所有的生物过程PPAR 因此调制可以归因于一个微分招聘辅活化因子和辅阻遏物功能作为染色质重塑酶的支架。

PPAR的辅活化因子 包括完善的辅助因子,如p300 / CBP p160, PGC-1 (PPAR coactivator-1),以及TRAP220(甲状腺激素receptor-associated蛋白质220或PBP, PPAR 绑定蛋白)[39,40),ARA70(雄激素Receptor-Associated蛋白质)41),和PRIP (PPAR 相互作用的蛋白质,ASC-2 / RAP250 / TRBP / NRC) (42]。

没有配体,PPAR 新兵辅阻遏物沉默中介等视黄和甲状腺激素受体(SMRT)和核受体辅阻遏物(N-Cor),结合的酶,如组蛋白脱乙酰酶酶(HDAC),特别是HDAC3 [43)或组蛋白甲基转移酶(HMT) SUV39H1,专门在赖氨酸甲基化组蛋白H3 9 (H3K9) [44]。RIP140 (receptor-interacting蛋白质)可能也是一个组件在辅阻遏物复杂45,46]。PPAR的能力 抑制转录反应不同的信号通路的生物活性是一个重要的方面,但机制确定特异性和功能后果的过程称为transrepression仍然知之甚少。然而,PPAR 也可以影响基因表达独立的PPRE绑定。事实上,PPAR 端依赖镇压的炎症基因表达发生干扰的作用通过transrepression NF-kB [47]。此外,其他转录因子的活动,例如,AP-1 STAT-1,可以被PPAR抑制 通过直接交互或竞争限制供应辅活化因子(48]。

PPAR transactivation ligand-dependent引起的能力和独立的机制。PPAR的AF-1域 是ligand-independent激活域调节PPAR的特异性 在脂肪生成[转录活动49]。一个额外的30个氨基酸的存在PPAR的AF-1域 2同种型,使得它比PPAR更好的转录激活 1 (50]。事实上,正是表明PPAR 2比PPAR活跃大约10倍 通过这个领域[1 ligand-independent转录激活,50,51]。因此,PPAR 1和PPAR 2可能有不同的功能,PPAR 1当配体丰富而PPAR使用 2将是至关重要的配体浓度较低的条件下,比如它可能发生在早期脂肪细胞分化[51]。然而,ligand-independent transactivation AF-1域,常见PPARs,了解甚少,超出了本文的范围。

2.1。PPARG-Modulated途径:肥胖和炎症

PPAR的生物活性 非常广泛,但是它是公认的转录监管机构脂质和糖代谢,因为它是脂肪细胞中高度表达和控制几个adipocyte-specific基因的表达参与脂质合成和储存、胰岛素信号和adipokine生产(52,53]。

PPAR - / -与选择性ko小鼠模型,在三个代谢组织(脂肪组织,骨骼肌和肝脏),显示,PPAR 是脂肪形成的主监管机构;PPAR 不足和/或部分中断在任何这些组织严重影响全身脂质稳态,改变胰岛素敏感性。PPAR的重要作用 在脂肪生成了PPAR的失活 1和PPAR 2在脂肪组织54,55]。

PPAR 2消耗了极大地减少脂肪组织(窟)质量- - - - - -由于强烈减少脂肪细胞的分化也观察到在体外,提供保护雌性引起体重增加和确定损伤的胰岛素敏感性56]。在这种背景下,一个共同的胺基酸多态性(PPAR Pro12Ala) 2(在下一节中详细描述)与2型糖尿病有关,建议引入适度的转录激活由于损伤的dna结合蛋白亲和力下降(57]。

冲突的结果已报告Medina-Gomez和他的同事(2005)(58]。虽然他们观察清楚在体外缺陷在脂肪细胞分化,他们证明了PPAR 2-depletion直接与胰岛素抵抗有关,没有改变在活的有机体内肥胖,甚至在高脂饮食的存在。剩余的可能的解释存在的脂肪在这些ko小鼠强烈建议PPAR仓库 1能够启动,至少部分脂肪细胞的分化。此外,它已被证明全球管制脂质在这些小鼠模型的实现。之间的复杂的相互作用这些代谢活跃的组织(肝脏、脂肪组织和肌肉)似乎是必不可少的能量平衡。

其他的研究也表明,杂合的PPAR的小鼠模型 (PPAR −/ +),降低了PPARG基因表达,显示改善胰岛素敏感性与wt老鼠(59,60]虽然减少了PPARG基因表达与降低代谢率和身体活动(61年]。减少PPARGPPARG基因表达−/ +小鼠模型PPAR轻微的减少有关 蛋白质含量(62年),这表明PPAR的调制 蛋白质含量,而不是mRNA本身,可能在确定PPAR扮演一个角色 在脂肪细胞的活动。事实上,PPAR的监管 蛋白质翻译将严格监管。Althoguh PPAR的适度减少 蛋白质可能防止饮食诱发胰岛素抵抗情况下高脂肪,在脂肪细胞完全没有有害的脂质和糖代谢和胰岛素敏感性的高脂肪的饮食,如在大多数,但不是全部,研究adipose-specific PPAR 基因敲除小鼠模型(63年]。

PPAR的相当大的作用 在巨噬细胞脂质代谢也清楚地证明64年]。PPAR的参与 在调节脂质代谢在巨噬细胞CD36的发现,提出的最初的清道夫受体家族成员介导氧化低密度脂蛋白的摄取,PPAR 目标基因在巨噬细胞65年]。

PPAR 在巨噬细胞和脂肪细胞有类似的功能调节脂质稳态两种类型的细胞通过调节基因包括LPL(脂蛋白脂肪酶),ACAT(乙酰辅酶A乙酰转移酶)和中国人民解放军(磷脂酶A)基因,和水平的远期运费协议(游离脂肪酸),动力(前列腺素),LTs(leukotriens)。PPAR 有缺陷的小鼠antiatherogenic PPAR的作用提供了线索 因为这些老鼠明显受损的脂质在动脉壁内稳态和增强动脉粥样硬化发展(66年,67年]。背后的分子机制antiatherogenic PPAR的属性 涉及从巨噬细胞胆固醇流出到等离子体的刺激和抑制单核细胞招聘到发展中动脉粥样硬化病变(67年]。有趣的是,macrophage-specific PPAR的消融 导致高胰岛素抵抗表明巨噬细胞PPAR 在肥胖可能产生一种保护作用[68年]。

事实上,它总是更加明显的是巨噬细胞之间的功能联系活动,炎症,脂肪组织,和2型糖尿病(T2DM)病人体内(69年,70年]。

在生理状态下,巨噬细胞居住在脂肪组织中的脂肪质量负责保持抗炎环境,赋予一个适当的程度的胰岛素敏感性。在病理条件下,如肥胖、脂肪组织代谢压力下不断,导致应力本构激活和炎症通路,导致巨噬细胞内积累脂肪组织。促炎巨噬细胞渗透脂肪组织,加重炎症,引起胰岛素抵抗(31日]。在这种情况下,即使PPAR 不需要巨噬细胞分化或吞噬活动,其缺乏与本构出现炎症环境有关,进而导致一个增强的食源性肥胖易感性,葡萄糖耐受不良,胰岛素抵抗[31日]。

这些发现表明PPAR的至关重要的作用 在脂肪细胞以及巨噬细胞,但迄今为止,只有两项研究[28,31日]分析了深入PPAR的本地化和机制 招聘在这个细胞,试图解决这些非常复杂,但基本的问题。

最近的技术进步- - - - - -高通量测序方法和创新技术等三维交互后细胞核的染色体- - - - - -允许在PPAR快速发现新层的复杂性 世界。通过使用这些方法,将感兴趣的分析PPAR的选择模式 活动在特定的细胞类型,最终的目标是了解它的改变可能影响人类健康。

几项研究已经执行PPARG基因和其主要亚型,即PPAR 1,- 2,即使其他变体披露(16,21,22]。在不久的将来,这将是伟大的相关性也解决新角色的描述亚型在生理和病理条件。

然而,人类PPAR描述的表型效应 变异和各种与改变PPARG mRNA表达,小鼠模型,并从不同的研究到目前为止表现往往相互矛盾的结果,明确描述一种高度复杂的PPAR的照片 和生物学功能。

3所示。PPARG:目标基因多态性、单体型和基因表达

PPARG基因核苷酸变化,及其可能的表现型的后果,已经广泛和相反的分析在过去的二十年7,23,71年,72年]。自从PPAR 是一个转录因子参与调节的几个目标基因在许多组织中,一个基因变异的主要后果可能是目标基因表达水平的改变。

虽然常见的单核苷酸多态性(snp)的影响PPARG基因在目标基因的表达并不是完全理解,一个SNP和/或它们的组合(单体型)可能影响PPARG记录本身,进而调节基因的表达能力(23]。

PPAR真的发生什么 活动一个DNA多态性的存在和/或突变?很少有研究直接考虑的实际效果PPARG变异的PPARG表达式本身和它的目标基因,评估变更的亲和力PPRE,启动子的效率,和其他因素,可能会影响其transactivation能力(73年- - - - - -84年]。

事实上,大多数的研究核苷酸的变化PPARG主要集中在DNA变体之间的关系和一个特定的表型(如预测糖尿病、肥胖、和BMI) (57,85年- - - - - -89年)或相关生化标记(等离子体水平的激素、多肽或代谢物)证明或者只应该被PPAR转录调控 本身(78年,90年- - - - - -102年]。

研究最广泛的SNP PPARG基因(57,72年,73年,83年),Pro12Ala,发生在PPAR 2同种型,通常相关的临床结果和一些生理代谢状态的改变57,72年,73年,85年- - - - - -87年,89年,103年]。的直接影响这对PPAR多态性 活动,一些功能研究显示Pro12Ala PPAR授予 2 PPRE的亲和力下降和降低transactivation能力,在荧光素酶报告基因分析和TZD-induced脂肪生成(73年,75年]。

它也已表明,在人类脂肪组织没有明显一些PPAR的基础表达水平的差异 目标基因(UCP-2, LPL、p85aPI3K和 1肥胖Pro12Ala和Pro12Pro运营商之间),除了观察减少约40%p85aPI3K基因在大网膜78年]。

为了解释观察到的差异,两者之间在体外和在活的有机体内研究,Kolehmainen等人推测Ala12纯合子有更多相关的差异基因表达激活相比Ala12杂合的;此外,它必须被认为是遗传和环境因素之间的相互作用和观察到的趋势PPAR的高表达 2的皮下脂肪仓库Pro12Ala航空公司(78年]。

此外,嘉尼•海基宁和他的同事(2009)(83年)最近强调的重要性代谢环境调节Pro12Ala效果,报告或确认几个这种PPARG变异和表型特征(表之间的关联1)。他们表明,阿拉巴马州窟阿拉巴马州/老鼠有些基因表达下调,而大量的基因调节肌肉。此外,他们有有趣的建议Pro12Ala可能涉及G蛋白质功能,脂联素的敏感信号和改变代数余子式招聘83年]。

表1
核苷酸PPARG编码和监管区域内变化。

调查Pro12Ala如何影响基因表达的分子目标和外生的响应刺激,n端结构域的功能属性应该也会考虑。特别是,这个SNP发生在12 PPAR的氨基端区域位置 2,显示了不同于PPAR transactivation能力 1,不同的只有在它的n端。正如上面提到的,额外的残留PPAR的n端 2,外显子编码的B,赋予trans-activating多达10倍大于PPAR的能力 1,这表明 2同种型更有效诱导目标基因的表达没有激活的配体(50]。箴Ala氨基酸变化可能会影响蛋白质的二级结构,因此其功能(110年]。事实上,它最近表明脯氨酸残基,尽管抵消 螺旋的形成,只适合的氨基端 螺旋线,积极调节蛋白质的稳定性(111年]。

PPAR之间的直接关系 转录能力和监管区域的SNPPPARG报道基因c - 2821 t,穆勒和他的同事(2003)(79年皮马印第安人人口)。这种多态性,在强大的连锁不平衡(LD) Pro12Ala,落在一个假定的E2-box在结合位点 EF1转录抑制因子。因为它已经表明,c - 2821 t PPAR授予 增加转录能力(79年),这个SNP可能负责之间的亲和力下降 EF1和E2-box或减少复杂的稳定。尽管这些等位基因的机制在LD (2821 t和Ala12−)功能仍不确定,总之这些发现表明,Ala12可能改变PPAR 2 transactivation能力,−2821 t可能改变PPAR的转录 (2对碘氧基苯甲醚79年]。其它核苷酸变异,其中大部分是获得或丧失突变,已被描述的PPARG基因。

关于功能一个罕见的PPAR功能研究 2突变,Pro115Gln,强调了相关性的磷酸化在减少PPAR Ser 114 活动;这种变化在PPAR的配体独立激活域 影响磷酸化和PPAR呈现 持续活跃,根据身体质量指数(BMI)增加肥胖个体中观察到(71年,108年]。

另一个PPARG核苷酸变异,影响PPAR 功能,发生在相同的领域:一种罕见的移码突变,[A553 AAAiT fs。185(stop186], resulting in a truncated protein in the DBD [76年]。在同一个家庭,这种过早的终止密码子被发现在所有患者胰岛素抵抗和代谢综合征(MS),携带也类似的突变([C1984 在PPP1R3A AG) fs.662 [stop668])(蛋白质phosphatase1 -调节亚基3)(7,76年,82年]。这种转移是一个损失函数影响形成和PPAR形成突变 与PPRE目标基因的启动子,导致一个失败的transactivation [76年]。

它已被证明体外,四个罕见突变PPAR的小黑裙 导致PPAR减少 trans-activating能力合成配体的存在,影响其能力招募代数余子式,配体和RXR :Pro495Leu(也称为Pro467Leu), Val318Met(也称为Val290Met), Phe388Leu和Arg425Cys(表1)[7,71年,74年,77年,81年,109年]。前两个突变影响两个螺旋招聘的重要配体和辅助因子,对野生型PPAR显性负活动 。相比之下,后者是haploinsufficient突变,发生在与RXR交互的疏水区域 和配体7,71年]。

在最近的一项研究中,其他罕见突变,发生在DBD-Cys114Arg, Cys131Tyr, Cys162Trp-and小黑裙315−停下来Arg357X-of PPAR 被描述。这些变体编码蛋白质无法绑定DNA,缺乏transactivation能力和显示一个占主导地位的消极活动组成的竞争招聘与野生型PPAR辅活化因子 (见表1)[82年]。

此外,我们最近在PPAR小说占主导地位的负面报道突变 与结直肠癌相关的小黑裙,Ser289Cys,血脂异常、高血压、超重,但没有与2型糖尿病。之间形成一个s桥,Cys289 Cys285,可能阻碍受体激动剂定位,解释了减少transactivation突变蛋白的能力(84年]。

虽然一些研究已经证明了功能的影响PPARG核苷酸变异蛋白质活动和/或稳定和trans-activate目标基因在其能力,大多数PPARG变异与临床疗效相关(71年,88年,89年没有调查]或等离子体水平的一种蛋白质PPARG表情,同种型丰富,目标基因的mRNA水平。这些非功能关联研究不prove-allowing只是猜测的表达改变PPARG目标基因。此外,它已被证明(即基因基因和基因-环境相互作用。,diet, exercise, and age of onset of the disease) may greatly affect the contribution of a specific SNP to the resulting phenotype.

综上所述,这些因素有助于解释相互矛盾的结果PPARG核苷酸的变化获得在不同人群57,73年,78年,85年- - - - - -89年,104年,108年,110年,112年- - - - - -115年]。

例如,Pro12Ala一直常与一些疾病和表型的影响(7,71年,72年),如增加2型糖尿病发病的保护和胰岛素抵抗,降低心脏疾病的发病率,提高高密度脂蛋白胆固醇、降低BMI在nonobese个人57,73年,85年,87年,103年],肥胖者(体重指数增加86年,91年]。最近的一项研究在俄罗斯人口支持Pro12Ala协会与2型糖尿病(改善胰岛素敏感性和保护89年]。此外,60协会最近的一项荟萃分析研究也证实了Ala12等位基因和降低2型糖尿病风险之间的关系(110年]。

相比之下,最近的两个相互矛盾的研究在印度人口表明Pro12Ala有助于2型糖尿病发展(105年),不表现出任何与MS,通络,分别和肥胖102年]。基因-环境和基因基因交互可能强烈导致不同Pro12Ala效果观察的研究人群(23,116年]。

这个SNP也关联到改变等离子体LPL、瘦素、脂联素、抵抗素。事实上,它是显示,在活的有机体内,Ala12等位基因与降低LPL活动postheparin等离子体(93年];高瘦素水平观察Pro12Ala Pro12Pro载体相比,女性(92年]。Pro12Ala的影响瘦素水平的增加可能是由妇女的一项研究支持功能雄激素过多症(呸),作者表明,阿拉巴马州的等位基因在呸更频繁的女性比健康对照组(36%比28%),瘦素水平高于nonobese呸女性相比,控制(One hundred.]。

还Pro12Ala和等离子体脂联素水平之间的关系似乎有争议:日本人口Ala12等位基因与血清脂联素水平降低(94年,96年)而无显著影响的多态性在多囊卵巢综合征观察血清脂联素,健康女性,在亚洲的印度人98年,101年]。

在一项由王et al . (2004) (97年),据报道,Ala12等位基因可能会影响基因的表达RETN编码一个脂肪分子约,抵抗素,在中国人口;杂合的和纯合子Ala12运营商显示低血浆抵抗素水平相比,纯合子Pro12航空公司(97年]。相反,最近在印度人口的一个报告称,在血浆抵抗素水平之间没有明显的统计学差异Pro12和Ala12运营商(杂合的和纯合子)[102年]。

Pro12Ala被描述在连锁不平衡(LD)和另一个共同之处PPARG变体,C1431T;这个沉默的SNP,发生在外显子6,也被称为His477His和C161T外显子671年]。已经观察到,当Pro12Ala LD C1431T SNP,其保护作用在2型糖尿病发展消失(87年(BMI),而影响疗效106年]。

缺乏功能结果在上述关联研究和可能的种族的影响,环境和遗传因素可能解释有争议的结果到目前为止报道。此外,由于LD之间多态性,确定每个SNP的相对贡献产生的表型是相当困难的。

例如,不同的研究报告,1431 t等位基因与增加BMI在肥胖的芬兰人91年),降低糖尿病的风险在一个大型亚洲人口(107年),而不是与2型糖尿病,肥胖和体重指数变化(88年]。

对其影响血浆蛋白水平,C1431T一直与瘦素水平增加有关(90年]。还阀等。91年)观察到的高瘦素水平在肥胖女性C1431T比其他肥胖妇女研究;这种多态性与脂肪量增加有关,,尽管在这项研究中,作者假设高瘦素水平完全是由于脂肪组织的增加质量和PPAR没有直接联系 端依赖转录调节(91年]。

此外,还在个人携带C1431T抵抗素水平显著增加而Pro-C单体型更频繁的在组织抵抗素水平较低。相比之下,Pro-T和显示Ala-T单体型频率增加组与高抵抗素水平虽然统计上不显著(102年]。

此外,核苷酸的变化假定的监管区域PPARG相关,与不同的区段,对人类疾病。的确,我们最近发现了一个- 2819 g SNP PPARG启动子和观察到的一个重要的协会与2型糖尿病和增生性视网膜病变在糖尿病女性而没有连锁不平衡Pro12Ala观察和与肥胖协会(88年]。假设这个SNP可能改变PPARG转录丰度影响一些PPAR的表达水平 目标涉及的眼睛生理(88年]。

其他三个变异PPARG假定的启动子的识别:A-14G, c - 681 g和c - 689 t [71年),尽管它们对PPARG转录的影响和作用尚未完全阐明。这些多态性可能影响一些PPAR的表达 分子靶点,因为c - 681 g和c - 689 t增加血浆低密度脂蛋白水平和A-14G PPAR的活动下降 4促进剂(80年,95年,99年]。

大规模并行测序平台的介绍,提供给研究人员识别的可能性,在一个实验中,点突变和/或总基因组重组,在致病基因的编码,但未知的监管区域,肯定会是一个强大的工具系统地发现变化PPARG基因,可能给人类疾病的因果关系。

4所示。下一代测序技术和转录因子:ChIP-Seq,有针对性的重新排序,RNA-Seq

任何遗传信息转达了从DNA到蛋白质通过信使rna,通过一个复杂和精细调节的过程。揭示这些基因信息然后翻译成基因调控几十年来一直是一个有趣的领域,实现了许多进步,推测和科学争论。为实现这一目标调整的规定,多采取协调一致的行动独联体作用的蛋白质,能够专门绑定独联体监管元素,如启动子和增强子,是必要的(2,117年]。此外,由于基底转录活动,造成所谓的一般TFs的绑定核心启动子,通常是低,不同位点专一的TFs参与招聘和/或稳定的通用TFs的复合物,增加细胞的转录率。此外,histone-modifying酶有可能被其他factors-binding远端增强地区——确定有利的染色质环境和随后的转录增强。另一方面,可以通过绑定负调节转录的压制因素远消音器地区或与TFs竞争本身。

理解PPAR 介导的现象在特定的细胞/组织/器官不能忽视PPAR的考虑 是一个转录因子。它机械的理解是微调的治疗活动的先决条件PPARG。

更普遍的是,一些人类疾病已经直接联系造成的基因表达变化的结构和/或功能缺陷的关键转录监管机构(2虽然是有争议的,许多其他“TF-disease协会”仍有待确定。扩大我们的理解如何因地制宜TFs导致基因表达的调节,进而如何改变TF结构和活动可能占到一个特定的疾病表型,似乎是一个至关重要的端点。

在这种背景下,PPAR的具体案例 也不例外,相反,它可能是最具代表性的候选基因之一“TF-disease”协会的研究,为其参与许多生理和病理过程(7]。

这一目标,2004年大规模并行测序平台的介绍,再加上最近的进步染色质immune-precipitation(芯片)测序(ChIP-seq)紧随其后,也显然已经彻底改变了我们的方法和研究不同生物现象(118年- - - - - -121年]。尽管所有的测序平台商业化使用不同的测序化学和方法论的过程,也不同数量的顺序读取,读取长度和错误的特点,他们都是基于库的生成序列,和个人测序反应的小型化121年]。不像以前使用基于测序的方法,如串行和帽的基因表达分析(鼠尾草和笼、职责)、香肠多元分析的基因表达(PMAGE),门店库不需要前一步克隆测序。此外,总会在平台上的一个共同特征是模板绑定到固体表面或支持(由底漆或模板固定)或其间接固定(通过链接支持)的聚合酶(122年]。然而,无论使用的测序化学和方法论的过程,单个门店平台可以生成大量的数据2碱基(Gb)的序列读取每天将努力从生物学,生物信息学的研究。

这些平台已经迅速应用于许多科学环境,导致许多“Seq”协议,特别是发达国家和适合一个特定的研究分支,从转录组(RNA-Seq)有针对性的重测序鉴定致病的核苷酸变异(CNV-Seq和DNA-Seq),包括dna蛋白质相互作用研究(ChIP-Seq)和全基因组表观遗传标记(Methyl-Seq)的分析。

虽然毫无疑问挥动平台改变了我们思考的方式很多科学问题,这项技术的广泛的和有用的应用之一是对遗传性疾病的遗传原因的识别,孟德尔和多因素疾病。

鉴于这一点,深入调查PPARG从DNA变异基因表达及其监管将会加强我们的理解对其参与健康和疾病。识别小说核苷酸变化,点突变和基因重组,在编码,但未开拓的地区intronic和监管的区域PPARG通过有针对性的重新排序(总会在平台上)将成为第一个砖来建立一个更完整和详细的视图PPARG(总结图功能和活动2)。此外,可能确定确切位置的结合位点,因此画一个完整的高分辨率绑定映射整个基因组(ChIP-Seq) (123年,124年),结合大量有用的整个RNA-seq获得的转录组数据,将提供比以往任何时候都空前的准确性和复杂性(参见图完成1)[125年]。


图2
通过使用下一代测序技术创新方法。下一代测序技术可以应用于许多科学背景:有针对性的重测序鉴定致病的核苷酸变异基因的编码和未知的监管区域(CNV-Seq和DNA-Seq);ChIP-Seq,染色质dna蛋白质相互作用研究耦合immuno-precipitation(芯片)和大规模并行测序;RNA-Seq全转录组研究,包括已知和未知的表达水平的成绩单(编码和非编码)、微分拼接,allele-specific表达式,RNA编辑和融合成绩单(见评论(121年])。
4.1。上天有针对性的重新排序

影响个人的全基因组重测序的基因组总会在平台的使用可能会代表最强大的方法来识别单核苷酸变异和/或基因重组(插入、删除和拷贝数变化)在致病基因。然而,很明显,这样全基因组方法不能用于常规突变筛查广泛影响个体的数量,由于所需的高计算和经济工作,特别是考虑到有几个研究小组在大公司和/或大型企业,以及大型公共和私人世界领先的研究机构,能够维持这些成本。

因此,目标排序的一小部分候选基因或疾病位点似乎是唯一可靠的方式获得上天的高精度数据标准的数组的访问成本分析。另一方面,它似乎至关重要的有效和具有成本效益的捕获方法不断丰富和发展“高价值”基因组样本地区为了避免偏离测序序列。

鉴于这一点,不同的技术最近发达让研究人员丰富的样本目标需要进一步测序的基因组区域。多重PCR扩增特定目标区域首次用于候选基因的方法,丰富的样品感兴趣的区域,进一步处理之前准备库测序(126年- - - - - -128年]。另一种方法是capture-by-hybridization [129年]。有效(自定义基于数组的捕获方法现场合成寡核苷酸微阵列)已经成功地用于提高测序模板浓缩(130年- - - - - -133年]。公司,如罗氏,最近开发了微阵列的capture-by-hybridization成千上万的预定义的基因组区域,主要的编码区(外显子),广泛用于有针对性的重测序实验(134年]。几个研究小组已经清楚地表明,上述捕获方法在其中扮演着重要的角色在推动目标门店的重测序应用平台(129年]。

因为大多数的人类遗传学的研究目前主要集中在蛋白质编码外显子,这些区域通常代表高价值目标有针对性的重新排序,尽管这种方法可以——我们相信,在大多数情况下,它必须被扩展基因调控区域(上游开始翻译网站和内含子)。的确,核苷酸的变化假定的或已知的识别管理序列,在非编码基因区域,因此未来的相关性研究。这种方法似乎非常有前途的研究首先TFs绑定网站,因为他们的参与人类疾病,孟德尔和多因子的(135年]。地方行政区域和同事(2009)(135年首次发现,目标重测序的基因组区域包括大约20 kb,非编码的变化与两种红细胞发育不全,证明非编码RPS19基因序列变异导致高的临床变化观察到红细胞发育不全。他们推测,这些非编码区域特定的等位基因可能改变调控蛋白的结合和/或TFs,可能改变或删除的重要刺激造血作用[135年]。

在这种情况下,可能有高浓缩的编码和未知的监管区域PPARG,耦合的目标总会在平台上的重测序,研究人员将代表一个非常强大的方法。事实上,它可能允许识别所有潜在的致使发现变化,在其编码区域,假定的小说的单核苷酸变异(突变和snp)和插入/删除或其他基因重组,可能对人类疾病相关。它也允许获得进一步洞察其监管区域的基因组结构,提供了快速、准确地识别潜在的可能性的变异来源负责变更的mRNA水平。此外,目标区域的特定的浓缩,紧随其后的是有针对性的重新排序,也可以进行著名的PPAR 调节基因在特定的通路。

事实上,自几项研究PPAR上执行 目标基因并没有明确显示出清晰的单核苷酸多态性和相关人类疾病之间的相关性,通过使用这些方法会更容易识别特定的目标基因的等位基因非编码区域并验证这些核苷酸变化是否负责PPAR的已知PPRE-and反过来的变更 绑定到这些elements-finding直接疾病和功能的链接。

4.2。转录因子和ChIP-Seq

感谢上天的引入平台,广泛使用的方法,染色质immuno-precipitation其次是微阵列(ChIP-chip)和在许多情况下被ChIP-seq协议。事实上,在ChIP-seq,感兴趣的DNA片段(即。,binding sites for a TF) are directly sequenced instead of being hybridized on a chip-array. Thanks to the high resolution, coverage, the wider dynamic range, and the absence of hybridization-based artifacts, ChIP-Seq allows now researchers to improve both quantity and quality of produced data. Moreover, fundamental advances toward a more accurate definition of the consensus sequences for the binding of TFs have been done [136年]。

到目前为止,这个新方法,夫妻在一个实验中一个标准的芯片分析大规模基因组大规模测序目标区域,允许研究人员获得一个更完整的地图TFs-DNA相互作用[2]。画一个精确的地图TFs结合位点,核心转录机械、和其他dna结合蛋白基因调控网络的关键一步识别潜在的生理和病理过程(136年]。

特别是,因为PPAR 徒结合RXR异质二聚体,需要与许多不同的合作tissue-selective因素,理解PPAR的微分时空招聘 :RXR复杂目标PPAR的基因可能会提高我们的知识 生物学。

在最近的一项研究中,尼尔森et al。28)通过ChIP-Seq挥动平台(Illumina公司,罗氏)获得了PPAR ——在脂肪细胞分化和RXR-binding网站地图3 t3-l1细胞(28]。特别是,他们总共约8600万测序片段(分为六天的分析在脂肪细胞)来自PPAR 芯片分析和大约5000万来自RXR芯片。他们证明了时空PPAR的招聘 和RXR目标基因在脂肪生成不同(图1)。更多的细节,他们观察到在脂肪细胞分化的早期阶段,恰逢PPAR的极低水平 在第0天,只有九PPAR 目标站点被检测到,但是这个数字在第一天保持在低位。相比之下,发现DNA单靠RXR入住率很高。更有趣的是,在分化过程中,大部分这些网站成为被PPAR占领 :RXR复合物。随后在天2-between switch-starting PPAR 和PPAR ,这成为主要RXR伙伴整个脂肪形成,恰逢PPAR显著增加 1和PPAR 2表达[28- - - - - -30.]。他们发现了> 5000高信任度PPAR :RXR-binding站点在脂肪细胞诱导基因的多数一致。在网上分析可以观察,结合发生在邻近的基因参与脂质和糖代谢。PPAR的最多(约7000) :RXR-binding网站6天。这全基因组ChIP-Seq分析允许确认PPAR的绑定 :RXR异质二聚体的ppr在已知目标基因。此外,小说的目标网站在不同的基因的内含子也确定了。

ChIP-Seq也是Lefterova和他的同事们最近利用(2010)(31日解决一个关键问题影响几个关于PPAR的报告 函数,行动的特异性,PPAR的方式 调节目标基因在某些细胞类型而不是其他人的。通过使用这种创新方法,作者决定细胞类型特异的代数余子式的被PPAR招募 在小鼠巨噬细胞和脂肪细胞31日]。事实上,它已被广泛证明了PPAR transactivation能力目标基因,与特异性的基因模式调制特征,但这种特异性的分子基础尚未完全了解。

作为其他TFs通常假设,假定其程控特异性可能是因为一个微分绑定到监管区域目标的共识序列基因或一个微分能够招募染色质重塑酶(38]。作者发现了一个特定的分子PPAR的签名 绑定,通过大规模sequencing-overall鼠标直接受PPAR基因组区域 。这一分析显示,PPAR 与细胞类型特异的因素,一些合作PU.1和C / EBPβ在定义PPAR行动的特异性 在每一个细胞(巨噬细胞和脂肪细胞,分别地。)(图1)。PPAR 在巨噬细胞结合独特的基因组地点位于邻近immunity-related基因和专门colocalizes PU.1地区开放的染色质组蛋白乙酰化作用的存在而,在preadipocytes,压抑的组蛋白签名不包括PPAR的存在 从macrophage-specific网站。在这种情况下,它已经表明,PPAR 能够打开在adipocyte-specific基因组染色质组蛋白乙酰化,增加网站。本文表明,至少在这些细胞类型,PPAR施加的转录调控 是由于一个微分招聘特定的代数余子式功能作为染色质重塑酶的支架。

上面描述的作品明显显示的巨大潜力sequencing-based芯片分析,哪些不需要先天的TFs结合位点的基因位置的信息,并允许生成高分辨率绑定映射到一个特定的反应刺激(123年,124年]。然而,在最近的一份工作Reddy和同事(2009)(125年),耦合ChIP-Seq RNA-Seq(详细描述在接下来的段落)为研究TF特定药物的反应可以检查著名模型在更大的深度和细节。特别是,他们获得了糖皮质激素受体结合的综合地图ChIP-Seq整体基因组DNA,并测量RNA-Seq相关基因表达的变化,与地塞米松对治疗的反应(125年]。

我们坚信,结合sequencing-based芯片检测的高通量转录组分析RNA-Seq总会在平台上,最重要的是为诱导转录因子(PPAR 其中),肯定会提供一个完整的、准确的,有用的数据和可靠的来源,使完成,一块一块的,PPAR的错综复杂的难题 功能。

4.3。发现通过RNA-Seq转录景观

自90年代末“转录组”这个词被用来描述每个基因表达的身份在一个特定的细胞类型和/或组织/器官/生物,和其相关的转录水平137年]。它第一次被认为由80 - 90%的核糖体RNA (rRNA), 5 - 15%的转移核糖核酸(tRNA),剩下的一部分信使核糖核酸(mRNA),大多数untranscribed组成的基因组和基因惰性区域。

相比之下,最近的证据表明,基因内和基因间序列再也不能被视为“垃圾DNA”,但他们代表的一个主要驱动力占所有生物的多样性和生物复杂性(121年]。事实上,几项研究已经证明了一个意想不到的的复杂性真核转录水平,显示其普及性几乎nonrepeat区域的完整基因组的转录(138年,139年]。

因此,解读整个转录组的复杂性可能是一个至关重要的端点解开基因组的功能元素的作用,而且,鉴于这一点,总会在平台的引入为分析提供了研究人员一个强大的工具在一个单一的实验。

的确,RNA-Seq的快速扩散协议提出了量化的可能性成绩单在队医的微分表达式——和病理条件和识别和描述的所有记录(包括蛋白质编码和非编码)表示在一个特定的细胞和/或组织一个特定发展阶段或之后内源性或外源性刺激正确地确定基因的剪接和结构。不像hybridization-based基因表达方法(芯片)和基于排序(即。,CAGE and SAGE), RNA-Seq does not require prior knowledge of any gene sequence (as occurs for microarrays) or laborious and time-consuming steps for the cloning and sequencing (as occurs for existing tag-based approaches) (reviewed in [121年])。

最近的一些研究已经清楚地演示了使用RNA-Seq的优点在转录组的审讯在多种条件下,如细胞增殖、分化、和各种环境压力(140年- - - - - -148年]。

在这种情况下,由于PPAR的至关重要的作用 特遣部队参与许多细胞通路,对PPAR进行调查 端依赖通过RNA-Seq调控靶基因的表达在单一实验中代表了一个巨大的挑战。

而先前描述ChIP-Seq PPAR地图可以画一个绑定 PPRE,激活或抑制靶基因的表达,直接识别(通过RNA-Seq)基因表达对PPAR的回应 调节药物(TZD等受体激动剂),或在特定的发展条件(在脂肪生成),将为研究人员有机会直接测量其调节特定基因的转录的能力在一个细胞/组织特定的方式。

高通量测序以来肯定被证明是一个强大的和定量方法示例转录组分辨率单核苷酸(149年),使用RNA-Seq可能揭示了一个新的特异性PPAR的作用 在不同的细胞或组织,在生理和病理条件。几个未解决的问题关于PPAR的“真正的”影响 现在在目标基因的调控表达几个条件可以被充分解决门店的使用。

5。结束语

在过去的几年中,PPARs,尤其是PPAR ,已成为重要的转录因子调节基因的表达参与了几个重要途径和生物过程,值得注意的,在人类疾病中。尽管巨大的知识领域,未来的研究成果将无疑揭示小说PPAR机制 将这些复杂的生理和病理通路。应特别注意的问题如何PPAR的选择性的影响 实现在不同的细胞类型。它也将重视理解行动的微妙的机制决定了这种选择性通过不同亚型的研究,基因变异,他们招募了代数余子式能够改变染色质结构。知道所有的PPAR 目标是一个完整的理解的先决条件的代谢缺陷发生在患者PPARG突变和/或解释的变异和将帮助效果和也与PPAR边效应可以发生 受体激动剂已经在临床使用。因此,有一个完整的PPAR的照片 功能和影响,研究这些方面,通过使用大规模并行测序平台,将提供一个更好的方法来描述的行为PPARG产品和受体激动剂。

确认

诉科斯塔和m·a·盖洛同样这项工作。那不勒斯大学生物科学系的费德里科•II, 80138那不勒斯,意大利目前的阿梅利亚Casamassimi合著者的地址。