文摘

Perfluorononanoic酸(PFNA)是一种全氟烃基酸中发现组织的环境和人类和野生动物。产前接触PFNA负面影响小鼠的生存和发展并激活鼠标和人类过氧物酶体proliferator-activated receptor-alpha (PPAR)。在目前的研究中,我们使用PPAR击倒(KO)和129 s1 / SvlmJ野生型小鼠(WT)调查PPAR的角色在调停PFNA-induced在活的有机体内效果。怀孕KO和WT老鼠服用口服与水(车辆控制:10毫升/公斤),0.83,1.1,1.5,或2毫克/公斤PFNA在妊娠期的日子(GDs)队(精子塞日= GD 0)。母亲体重增加,植入,垃圾大小和小狗出生时体重未受影响的压力。PFNA接触生活幼仔出生时的数量减少,对后代生存在1.1和2毫克/公斤断奶组在WT。眼睛打开被推迟(平均延迟天)和小狗在WT小狗断奶体重减少了2毫克/公斤。这些发展端点并不影响KO。相对肝脏重量增加剂量依赖性的方式在大坝和幼崽的WT应变剂量水平但仅略有增加的最高剂量组KO压力。总之,PFNA改变肝脏重量的水坝和小狗,小狗生存,体重,和发展WT,只有诱导肝脏相对重量略有增加大坝和幼崽在KO小鼠2毫克/公斤。这些结果表明,PPAR是一个重要的调停人PFNA-induced发育毒性的老鼠。

1。介绍

全氟烷基酸(PFAAs)是一个家庭的化学物质有脂酸碳链饱和与氟和官能团。表面活性剂应用在许多消费者和工业应用,如防水和污渍的衣服,地毯,和其他面料,石油的食品包装、消防泡沫、油漆、粘合剂、液压液等(1- - - - - -4]。被广泛使用在消费品和工业产品相匹配的全球环境中存在2,5,6和在野生动物和人类7- - - - - -12]。无处不在的这些化学物质的存在,尤其是在人类血清,担心他们的安全。两种最常见的PFAAs,并酸(PFOA)和perfluorooctane磺酸盐(卵圆孔未闭),被发现在实验室动物诱发肝毒性,免疫毒性、致癌性,干扰甲状腺激素的水平,包括产前和新生儿死亡率和发育的影响,发育不良的乳腺发育,发育迟缓,体重下降(综述[6,13])。尽管卵圆孔未闭的制造是淘汰的生产在美国和全氟辛酸及其盐类(PFOA)被淘汰,替代PFAAs已推广使用。

Perfluorononanoic酸(PFNA)是一个9-carbon PFAA家族的成员在环境和血清中水平远低于PFOA的或卵圆孔未闭。然而,人类血清的PFNA水平上升在过去的几年中,目前站在大约ng / ml [7,14]。它的存在在人类血清已被证明与PFNA从食物和水中摄取[15,16]。很少有研究调查其毒性。体外细胞毒性的研究发现PFNA hct - 116细胞(17),和肝毒素的18]。PFNA immunotoxic还发现在活的有机体内(19,20.]。最近,发现PFNA诱导小鼠的发育毒性当管理在整个妊娠期(21]。怀孕期间接触PFNA的副作用包括减少产后存活在5毫克/公斤/天,延迟眼睛打开,延迟青春期,增加肝脏重量,和减少在3和5毫克/公斤体重/天。

的毒性的机制涉及PFAAs是过氧物酶体的激活proliferator-activated receptor-alpha (PPAR)。PPAR是核受体在调节脂质和葡萄糖稳态方面发挥重要作用,细胞增殖和分化,和炎症22]。PPAR的激活被认为是负责PFOA-induced肝毒性在啮齿动物23)和某些immunotoxic效应(20.,24,25]。除了全氟辛酸及其盐类(PFOA)外,其他一些PFAAs激活PPARα在体外(26- - - - - -28]。PPARα可能协调发展的过程,因为PPAR吗在小鼠发展(29日]。PFOA在小鼠体内的发育毒性,包括新生儿杀伤力,延迟眼睛打开,并降低体重,发现依赖PPAR(30.]虽然卵圆孔未闭的发育毒性不是[31日]。PPAR也可能调解PFNA效果。PPAR的证据激活肝脏中发现的老鼠暴露在胎儿发育(PFNA21]。PFNA也激活PPAR在体外是最有效的在激活人类和小鼠PPAR PFAAs测试α在转染COS-1细胞(28]。因此合理假定PFNA的发育毒性,像全氟辛酸及其盐类(PFOA),也可能是PPAR依赖。

在目前的研究中,我们试图确定PFNA-induced PPAR的发育毒性鼠标需要表达。怀孕129 s1 / SvlmJ野生型(WT)和PPAR击倒(KO)老鼠PFNA妊娠期间,生育和新生儿发展指数,以及血清水平的PFNA进行评估。我们报告的发育影响PFNA包括小狗生存,眼睛打开,和体重是PPAR依赖肝肿大,主要是PPAR依赖但可能利用其他途径。

2。材料和方法

2.1。动物

男性和女性的野生型小鼠(WT) 129 s1 / SvlmJ(股票没有。002448)和PPARα敲除小鼠(KO) 129 s1 / SvlmJ背景(Ppara-tm1Gonz / J,股票没有。003580年)获得杰克逊实验室(巴尔港,我)。WT和KO小鼠在繁殖地EPA生殖毒理学设施,达勒姆,数控。动物被性组安置在殖民地Tecniplast笼子(Tecniplast美国、Exton、PA) Beta-chip硬木床上用品(东北产品、Warrensburg NY)在一个封闭的通风系统,提供颗粒状鼠标chow (PMI营养国际LCC LabDiet 5001年,布伦特伍德,密苏里州)和自来水随意,在68年的氛围F和湿度40 - 60% 12小时的光暗周期。所有动物研究按照指南进行了使用EPA奥德/ NHEERL制度建立的动物保健和使用委员会。程序和设施符合1996年NRC的建议“指导护理和使用实验动物,动物福利法案,和公共卫生服务政策的人道关怀和使用实验动物。

2.2。研究设计和协议

这项研究是在四个街区进行WT,在每一块KO表示。WT,一夜之间KO雌性交配的雄性各自的压力,每笼一对交配。女性第二天早晨检查阴道插头,插头积极的动物称重,随机分配到治疗组和单独住在常规通风聚丙烯的笼子里。天的插头被认为是妊娠(GDs) 0。的每个应变称重和给动物口服填喂法每天一次在GD队与水(车辆控制:10毫升/公斤)或PFNA (CAS # 375-95-1;97%的纯;奥尔德里奇,圣路易斯,密苏里州)为0.83,1.1,1.5,和2.0毫克/公斤,基于以前的研究PFNA和全氟辛酸及其盐类(PFOA) (21,30.]。计量解决方案被稀释,准备新鲜的每日剂量之前立即。在术语,成年女性每天两次被检查的幼崽。成年雌性幼崽和那些怀孕被称为水坝。出生一天被认为是产后一天(PND) 0。大坝和幼仔每天监控。生活和死去的幼崽的数量记录每天两次,和小狗生活重性产后天0,1,2,3、7、10、14、21(断奶)。每天从患产后抑郁症的幼崽被监视的眼睛打开11直到所有的眼睛都是开着的。眼睛打开被描述为每窝幼崽的百分比有双眼完全开放,由技术人员培训示范和协议消除主观性。动物研究都牺牲在患产后抑郁症的21日验尸产仔的成年女性postcoitus(42天)。 Body and liver weights were measured from each adult female and from 2 pups per litter. Blood was collected from each dam individually and from all pups pooled by litter. Serum was extracted and stored atc .子宫收集来自所有成年女性,硫化铵沾2%,子宫植入网站统计(32]。

2.3。血清分析PFNA

PFNA分析血清中使用的修改方法执行先前描述的(33]。在目前的研究中,25血清l是放置在一个6毫升聚丙烯管,脱去蛋白质1毫升0.1甲酸,和漩涡。二百年l的混合物被转移到一个新的6毫升聚丙烯管和上升2毫升含有25 ng / ml的乙腈-PFNA(剑桥同位素实验室,Inc .,安多弗,MA)。管是涡20分钟,然后离心3分钟3500 rpm沉淀蛋白质或其他残留物。二百年l的上层清液然后转移到500L与200年聚丙烯autosampler瓶和混合l 2毫米醋酸铵为高效液相色谱/ MS-MS分析。解决方案进行了分析使用一个安捷伦1100高效液相色谱仪(安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA)加上一个API 3000三重四极质谱(LC / MS-MS;应用生物系统公司,培育城市,CA)。十l的解决方案是注入到Luna C18 (2) 350毫米,5米列(Phenomenex托兰斯,CA)用流动相组成的30% 2毫米醋酸铵溶液和70%的乙腈。集成和地区峰值测定使用分析软件(应用生物系统公司版本1.4.1)。为每一个分析批matrix-matched校准曲线是准备使用小鼠血清中掺入不同程度的PFNA(奥尔德里奇、圣路易斯、钼)。质量控制、检查标准是由大量的小鼠血清在几个任意水平飙升。检查标准储存冷冻和整除分析分析。此外,控制小鼠血清样本强化两个或三个层次在复制与已知数量的PFNA每个分析组的准备。重复强化和几个检查标准运行在每个分析批量评估精度和准确性。定量的极限(定量限)被设置为最低标准曲线校准点。分析批次被认为是可接受的,如果矩阵和试剂空白没有显著PFNA峰值接近定量限,标准曲线相关系数,所有标准曲线点,强化,并检查样本中70% - -130%的理论和之前确定值,分别。

2.4。数据分析

孕产妇妊娠、新生儿发展,尸体剖检数据分析了GraphPad棱镜(版本4;圣地亚哥,CA)。个人意味着(的数据)或垃圾手段(小狗数据)和标准剂量组和应变和分析获得的错误是由方差分析。成对t测试中计算方差分析比较各个治疗组在应变相关的对照组。在适当的时候使用Bonferroni调整多重比较。线性回归分析进行肝脏数据检测剂量相关的趋势。使用卡方趋势分析怀孕率进行了分析。垃圾损失被描述为大坝,全窝吸收(FLR子宫移植,但不幼崽出生时)或整个垃圾损失(出生时,只有死去的小狗)。垃圾损失是检查使用卡方分析治疗效果。血清数据分析了SAS Windows v9.1 (SAS,卡里,NC)。分析分别对成年女性和幼崽。成年女性进一步分为妊娠和哺乳期状态(住小狗或者没有住小狗包括妊娠和垃圾的损失)。大坝的子集与他们的幼崽是用来确定PFNA水平差异大坝和幼崽。 Where variances were heterologous, data were log10 transformed to calculate means and standard errors and analyzed by ANOVA to investigate effects of treatment, strain (WT, KO), and block. When treatment differences were found by ANOVA, pairwise t-tests between treatment groups were calculated within each strain and separately by dams or pups, using Tukey-Kramer adjustment for multiple comparisons where appropriate.

3所示。结果

3.1。孕产妇妊娠和妊娠期体重结果

每日产妇体重和母亲的体重从GD 1 GD 18并不影响妊娠PFNA曝光。植入和总窝大小(生活和死去的小狗)出生时不影响压力。然而,生活幼仔出生时的数量是1.1 WT应变显著降低(P . 05)和2.0 (P 毫克/公斤PFNA(表措施)1),而不是重要的在1.5毫克/公斤。垃圾损失百分比没有明显改变在任何剂量组在KO或WT虽然是一个适度但微不足道的增加,垃圾的损失在WT(表1)。在每个剂量组KO,只有1或2大坝FLR或将,WT组暴露2毫克/公斤PFNA、4大坝将FLR, 2(35%垃圾损失)。大多数水坝FLR与体重没有了窝的怀孕的水坝,这表明FLR发生在怀孕早期。大坝将体重增加,术语,但它不能由我们的协议是否这些幼崽死亡之前交货或交货后不久。怀孕率,插入小鼠的子宫移植,治疗是降低KO组(P 措施),但不是在WT组,表明当PPAR PFNA可能干扰注入没有功能。

3.2。小狗的生存、发展和体重

幼仔出生时的生存能力在WT 1.1和2毫克/公斤一直持续到产后。生存的WT幼崽从出生到断奶(患产后抑郁症的21)在1.1(大大减少P . 05)和2 (P 毫克/公斤PFNA(图措施)1)。由患产后抑郁症的21岁的幼崽的生存WT 1.1和2.0毫克/公斤组降低36%和31%,分别。相比之下,生存不是KO在任何剂量的影响。

眼睛打开被用作产后发展的标志。平均一天的眼睛打开控制患产后抑郁症的13.70.3 WT和患产后抑郁症的13.90.2在KO。天的眼睛打开均值显著延迟2毫克/公斤PFNA WT的两天,至15.8患产后抑郁症0.2 (),但是没有在任何其他剂量。相比之下,眼睛的意思是天在KO开并不在任何剂量的影响。百分比的眼睛打开导航仪的13、14、15、16也显著降低在WT 2毫克/公斤PFNA KO(图而不受影响2)。

小狗出生体重是不受任何剂量的PFNA WT或KO,无论是在雄性或雌性(表2)。虽然小狗出生时体重并不是不同的组间,小狗在男性和女性的体重减少WT小狗2毫克/公斤组在几个时间点在产后时期,开始患产后抑郁症的7和包括断奶(图3)。体重增加在此期间在WT雌性幼崽从8.52 g降低控制在2毫克/公斤6.35 g组(),而不是男性。相比之下,体重和体重增加不影响在任何年龄任何剂量水平在KO(图3)。

3.3。在PND21肝脏重量和体重

绝对的肝脏重量增加剂量依赖性的方式在所有PFNA-treated组WT成年女性,无论怀孕之前的状态。然而在KO成年女性,肝脏重量不是PFNA大坝,但影响是增加了1.5和2.0毫克/公斤组妊娠的成人(表3)。此外,妊娠的成年人,肝脏重量较低的剂量依赖性增加KO WT(相比通过回归分析)。同样,相对肝脏重量增加剂量依赖性的方式所有治疗组的血压在WT (),不管怀孕的历史,在1.1毫克/公斤和更高的剂量在产仔KO(图4)。KO成年人已经怀孕,肝脏相对重量是不受影响。体重在验尸(表通常不受剂量影响或压力3)。绝对所有PFNA剂量组肝脏重量增加在KO WT幼崽,但不受影响。在所有剂量组肝脏相对重量增加WT小狗但只有最高剂量组,2毫克/公斤,在KO(图4)。体重没有减少在任何剂量KO幼崽。小狗在WT体重减少了2毫克/公斤(表3)。

3.4。血清PFNA水平

PFNA血清中检测到的所有的动物(表4)。PFNA水平明显高于PFNA-treated老鼠在每一个剂量水平相比,控制()和水平增加剂量依赖性的方式。血清PFNA水平高于成年女性没有住幼崽(无论怀孕)相比,成人生活幼崽P 。001 (KO)和P 。005 (WT)。PFNA水平也高于幼崽相比他们的大坝,根据大坝的一个子集匹配现有的幼崽在断奶(KO,P 。;WT,P .005)。在所有大坝与护理小狗,PFNA水平低KO WT(相比P 措施),在幼崽,PFNA KO WT(相比更高水平P 。;表4)。

4所示。讨论

Perfluorononanoic酸(PFNA)最近被证明能够诱导小鼠的发育毒性和肝肿大(21),其他全氟烃基酸。当前研究的目的是确定是否依赖PPAR这些影响129年代,使用/ SvlmJ PPAR击倒(KO)小鼠模型。妊娠期暴露于PFNA减少新生儿生存和体重断奶期,延迟眼睛打开,绝对的肝脏重量增加剂量WT后代的低至0.83毫克/公斤/天。相比之下,这些影响并不在KO的后代。这些发现表明,PFNA发育毒物及其影响是依赖PPAR的表情。

这种模式生存,减少体重,延迟发展,增加肝脏重量是常见的大多数全氟烃基酸(PFAAs)研究迄今为止。这些影响对全氟辛酸及其盐类(PFOA)已报告在啮齿动物(30.,34),卵圆孔未闭,31日,35,36],PFNA [[21,37,Das, 2010年# 389),一些具体的差异,可能是由于紧张,药物剂量,链的长度和PFAA的官能团。这样的研究也获得了影响后代在剂量水平不从母体毒性(30.,31日,34,35,38),如下所示。也常见到当前和先前的研究,肝脏是最敏感的靶组织,与影响肝脏重量WT大坝和使用的最低剂量水平的PFNA小狗在这项研究中,0.83毫克/公斤,高。生存,降低体重,和延迟的眼睛在幼崽也敏感的端点,诱导效应在下次更高的剂量水平,1.1或2.0毫克/公斤。生存和数量的活幼崽出生时被破坏在1.5毫克/公斤,但值没有达到统计学意义。这一发现还不清楚的原因。血清PFNA浓度和幼崽在这个剂量组肝脏重量是在预期的范围内线性剂量反应曲线,表明适当的剂量和管理准备1.5毫克/公斤。此外,““12窝在这个治疗组与其他剂量组,因此,结果似乎不太可能与一个较低的统计力量。因此,缺乏一致的对生存的影响无法解释,可能只是反映了生物多样性。尽管如此,所有的发展显然是PPAR端点α相关的。的依赖PPAR PFNA发育的影响α并不是唯一的,因为这也被证明对全氟辛酸及其盐类(PFOA)之前(30.]。然而,并不是所有PFAAs取决于PPAR诱导发育的影响。卵圆孔未闭的发展影响,例如,没有发现PPAR依赖(31日]。这可能是由于磺化头组卵圆孔未闭,因此PPAR依赖可能perfluorocarboxylic酸的一个特征。

作用方式不同全氟羧酸,PFOA和PFNA,磺酸盐的卵圆孔未闭在新生儿损失的模式也可以明显观察到接触这些化合物。PFNA暴露在WT老鼠导致数量急剧减少的可行的幼崽出生时持续亏损的幼崽在头几天,随后逐渐丧失,直到患产后抑郁症的10。同样,全氟辛酸及其盐类(PFOA)诱导的突然丧失可行的幼崽在生命的最初几天,逐渐丧失了10天的cd -老鼠(3814天),在129年代/ SvlmJ应变[30.]。与我们的研究相比,PFNA cd -小鼠诱导逐渐失去幼崽在出生12天没有重大损失(21]。这种差异可能是由于129年代/ SvlmJ应变敏感性增加。尽管对全氟辛酸及其盐类(PFOA)生存曲线和PFNA可以遵循一个10 - 14天,在子宫内暴露在卵圆孔未闭导致突然丧失生存能力幼仔出生后最初几个小时内通过产后第二天老鼠(35,36]。这些幼崽被观察到肺的呼吸窘迫并显示可怜的通货膨胀(36,39尽管确切机制尚未被发现。这两天失去幼崽在暴露于129年代观察卵圆孔未闭/ SvlmJ应变,且仅在KO几个死直到患产后抑郁症的10 (31日]。因此,在新生儿中,PFNA可能使用相同的作用机制与其他全氟羧酸盐而磺酸盐,如卵圆孔未闭利用另一个。

在肝脏,似乎PPAR独立以及PPAR为了应对PFNA端依赖事件。PFNA被发现增加相对和绝对WT成人肝脏重量,但程度不产仔KO,而不是在怀孕KO成人。缺乏影响怀孕KO的肝脏重量可能表明PFNA的影响在成人KO小鼠肝脏重量适中,掩饰了肝脏重量的增加是由于怀孕。KO的减毒反应肝脏相比WT肝脏是小狗更明显,可能意味着一个独立的,低效率的机制PPAR独立的。同样,那么健壮的影响肝脏重量KO WT老鼠相比,观察后接触PFOA [30.]。组织病理学检查肝脏组织学显示不同的对待KO肝脏(WT治疗相比40在KO小鼠),显示一个不同的机制。其他途径的建议包括本构雄烷受体(汽车)和孕烷X受体(PXR) [41- - - - - -43),它们都出现在人类。因此,PFNA可能主要是利用PPAR肝脏重量增加而缺乏PPAR依赖其他途径。PPAR的参与在肝脏可能利用其他PFAAs机制,自perfluorobutyrate也增加了肝脏重量和诱导肝细胞肥大PPAR依赖(44]。PPAR的相关性人类被批评机制主要基于低数量的这些受体在人类和小鼠的肝脏。然而,PPAR有牵连的PFNA发育的影响,和PPAR的病因其他组织的胚胎、胎儿和新生儿的人类和老鼠的总值参与发展尚未完全确定。因此,相关的PPAR的可能性一个人应对PFNA不容忽视。

PFNA的水平血清的幼崽,护理水坝,和成年女性没有小狗说明一些有趣的发现。首先,血清存在剂量依赖的相关性的PFNA组动物在大坝和幼崽反映存在剂量依赖的相关性影响。第二,影响观察WT小狗没有由于更高浓度的PFNA在他们的系统中,由于血清水平的PFNA实际上是低剂量WT比KO幼崽崽。相反,普遍缺乏发展效应KO幼崽并不是由于受损的药代动力学分布PFNA小狗。另一个重要的观察是实质性的可能性将PFNA从大坝通过牛奶的小狗。PFNA可以进入牛奶,牛奶的PFNA人类发现的(45- - - - - -47),大鼠(48),和老鼠49]。哺乳期水坝的降低血清PFNA水平相比,成年女性在断奶建议不会分泌乳汁的消除PFNA大坝通过胎盘转移和牛奶。此外,PFNA水平升高在幼崽相比,他们的母亲。对全氟辛酸及其盐类(PFOA)这也被报道,增加身体负担在幼崽从出生到出生后第八天(49]。然而,胎盘的贡献和授乳的转让PFNA不能确定本研究的设计。血清水平的PFNA小鼠模型是比人类更高的(7),但测量与观察到的生理效应,而不是人类的水平进行比较。

PFNA被发现在这个研究是肝脏和其他发育毒物堪PFAAs,不良反应是引起孕产妇剂量低至0.83毫克/公斤。在cd -鼠标,PFNA比PFOA似乎更有效。PFNA降低cd -小狗生存在5毫克/公斤/天,由全氟辛酸及其盐类(PFOA)到毫克/公斤/天相比,和延迟的眼睛打开在3毫克/公斤/天相比,由全氟辛酸及其盐类(PFOA)[5毫克/公斤/天21,34,37,38]。在体外分析PPAR激活显示PFNA比PFOA和更强有力的(28]。在当前的研究中使用的129年代应变作为动物模型为研究机制的行动,而不是相对效力,毒性和PBPK数据缺乏,这一毒株PFAAs似乎更敏感。同样清楚的是,PFNA比卵圆孔未闭的更有效。卵圆孔未闭诱导减少50%在cd -后代生存10毫克/公斤/天(35),在129年代的8.5毫克/公斤/天/ SvlmJ老鼠[31日]而PFNA减少生存在1.1毫克/公斤/天在当前的研究中在cd -老鼠或5毫克/公斤。考虑到降低活动的磺化PFAA羧酸盐相比PFAA PPAR在体外(28),较低的力量在活的有机体内可能会对其他磺化PFAAs。

5。结论

总之,PFNA小鼠发育毒物,PPAR的发展影响是依赖于表达。影响观察的一般模式在妊娠后鼠标PFNA接触镜的影响其他PFAAs PFOA的最密切。此外,微分反应肝脏的PFNA WT和PPAR KO成年女性建议α端依赖模式行动肝脏重量增加,尽管似乎涉及到额外的途径和机制。

确认

作者欣然承认艾米Delinsky,安德鲁·林德斯特伦和马克Strynar分析血清的PFNA女士/高效液相色谱;约翰·罗杰斯,杰森Stanko Kaberi Das帮助动物工作;珍妮花的种子和米奇·罗森的仔细审查。