文摘

多囊肾疾病(PKD)是一种遗传性疾病,其特征是充满液体的囊肿生长主要在肾小管和肝脏胆管。目前,PKD仅限于囊肿的临床管理愿望,手术切除或器官移植。基于一个PPAR的观察 受体激动剂如吡格列酮和罗格列酮的mRNA水平降低 运输蛋白质,雌性生殖道(囊性纤维化跨膜电导调节),和 培养肾细胞分泌抗利尿激素反应,它是PPAR假设 受体激动剂会抑制囊肿生长。目前的研究表明,一个7 -或尽早吡格列酮喂养方案抑制肾和肝脏胆管囊肿增长PCK鼠啮齿动物模型对人类PKD同源。这些研究提供的证据概念PPAR的作用机制 受体激动剂和表明,这类药物可能有效控制肾和肝囊肿PKD的增长和纤维化。

1。介绍

过氧物酶体扩散国的受体激动剂激活受体(PPARγ 对中间代谢)多效性的影响。两个代理,罗格列酮和吡格列酮批准临床使用insulin-sensitizing代理治疗II型糖尿病。PPAR的主要副作用之一 液体潴留,可以治疗,在某些情况下,导致明显的水肿(1- - - - - -3]。一个肾收集duct-specific PPAR的淘汰赛 在动物模型中废除了药物带来的液体潴留,暗示效应源自改变电解质和/或液体运输在远端肾单位4,5]。研究的主要细胞类型的细胞培养模型PPAR的远端肾单位展示了 受体激动剂抑制cAMP-stimulated离子运输和囊性纤维化跨膜电导调节的mRNA表达(雌性生殖道,Cl- - - - - -通道中发现的顶端膜细胞类型(6]。

多囊肾病(PKD)是一种与常染色体显性遗传性疾病(ADPKD)和常染色体隐性(ARPKD)形式7,8]。ADPKD是更普遍的形式,大约1 1000年在成年人和呈现缓慢增长,充满液体的囊肿形成主要在肾。进步囊肿增长和周围组织的纤维化通常妥协中年后器官功能,导致终末期肾病后第五个十年。ARPKD影响新生儿期和儿童特点是管状扩张。两种形式的PKD肝脏参与源于cholangiocytes囊肿,肝胆管上皮细胞衬。

PKD编码蛋白质的基因突变在初级纤毛,胞质囊泡,内质网,信息和cell-extracellular矩阵联系。这些蛋白质是瞬时受体电位Ca2 +频道或蛋白质调节这类Ca2 +渠道(7,8]。变异减少细胞内Ca2 +浓度调节胞内信号通路包括调节营和Cl−频道。

人们普遍认为离子液体的分泌cyst-lining上皮细胞导致囊肿扩张。十年前进行的一些研究表明,肾囊肿形成PKD是由阴离子(Cl−或HC )分泌9- - - - - -11),最近的研究表明一个非常类似的资料刚孤立胆管上皮细胞(12]。抑制剂和电生理学的分析研究表明,雌性生殖道Cl- - - - - -频道负责分泌肾和胆管囊肿(10,12]。基于先前的发现PPAR 受体激动剂抑制雌性生殖道表达式(6),当前的研究是为了测试PPAR的功效 吡格列酮受体激动剂,抑制囊肿的生长。

PKD的几个啮齿动物模型中,我们选择使用PCK鼠模型,因为基因突变在这个动物是人类ARPKD同源,而动物也表达的许多人类ADPKD的表型特征(13,14]。动物发展肾和肝纤维囊性的疾病和长寿到足以促进长期的治疗方案。这个模型被用于临床前测试肾V2受体拮抗剂和生长激素抑制素受体激动剂作为PKD的治疗方案(15- - - - - -17]。

2。对象和方法

2.1。动物

PCK老鼠从查尔斯河实验室购买,Inc . (MA)威尔明顿或被饲养在殖民地印第安纳大学医学院(IUSM)或梅奥诊所。机构的动物保健和使用委员会在每个机构批准所有协议程序。吡格列酮的量添加到食物是基于估计动物消费的基本饮食。

2.2。研究设计和协议
2.2.1。IUPUI

断奶后,在四周的年纪,啮齿动物被随机分为治疗和控制组。治疗组是美联储上贴。5002年与吡格列酮Labdiet补充计算提供20毫克/公斤BW当提供随意。控制啮齿动物喂养unsupplemented上贴。5002 Labdiet。在18周,啮齿动物麻醉与腹腔注射戊巴比妥钠100毫克/公斤。血液通过心脏内的穿刺收集和分析等离子体化学反应的号角印第安纳大学医学院的病理学实验室。剖腹手术后,器官和生理盐水冲洗,左肾和肝右叶收集,在液态氮冷冻。剩下的肾脏和肝脏灌注4%多聚甲醛,移除,并存储在4%多聚甲醛组织学。肾脏和肝脏分段嵌入在石蜡和横向(4 米的部分)。

2.2.2。梅奥

吡格列酮治疗开始时断奶或三周的年龄。吡格列酮(武田化学工业)添加到食物浓度估计提供4到20毫克/公斤/天。控制动物收到unsupplemented饮食。在每个研究中,老鼠与氯胺酮麻醉60毫克/公斤和甲苯噻嗪10毫克/公斤,IP。血液通过心脏穿刺测定血浆肌酐,包子,电解质、胆红素、肝酶和葡萄糖。的右肾,部分肝脏,胰腺,脾脏被放入preweighed瓶含有10%甲醛在磷酸缓冲(pH值7.4)。这些组织是嵌入在组织学研究石蜡。左侧肾脏和肝脏的一部分就在液态氮冷冻。

2.3。组织学分析
2.3.1。IUPUI

内侧横向肾部分与苏木精染色,分析了曙红和囊肿卷使用点估算体视学方法鉴定部分(18]。肾和肝纤维化评估与picrosirius红染色。肾纤维化分级在1 - 4(正常,2-slight 3-moderate, 4-severe)大脑皮层和juxtamedullary地区的肾脏。同样,肝纤维化评估在1 - 4(少1 1%纤维化纤维化少2 5%,小3 20%纤维化和4个比它大的超过20%纤维化)。所有得分是由训练有素的科学家蒙蔽的身份部分。

2.3.2。梅奥

四个 m横向肾的组织部分,包括皮质、髓质,和乳头,肝脏是沾染了hematoxylin-eosin和picrosirius红色。整个横向组织部分沾hematoxylin-eosin被用来衡量囊肿卷。肾和肝纤维化是得分使用picrosirius红染色。没有知识的图像分析程序进行作业使用Meta-Morph软件组(通用成像,西切斯特,PA)。彩色部分是可视化,数字图像是获得使用一个高分辨率的尼康数码相机并显示在监视器上。定义感兴趣的结构和排除的字段也受损分析是通过交互式应用技术的提高。彩色阈值分别应用于水平从noncystic囊肿组织。肾和肝纤维化分级。

2.4。电子显微镜研究

小块的肾脏灌注固定被加工的电子标签然后微观电镜下观察电子显微镜中心(IU医学院http://www.anatomy.iupui.edu/corefac/emcenter.php)使用标准postembedding标签技术。肾脏部分可见囊肿被削减 段在Unicryl脱水和嵌入式(电子显微镜科学,哈特菲尔德,PA)。薄片(70 - 90 nm)安装在Formvar /碳包覆镍网格,用PBS冲洗,网格放在阻止缓冲区(冷水鱼明胶BSA的2%,0.1%,0.1%的渐变PBS) 30 - 45分钟。网格被放置在主要的抗体(596年鼠单克隆抗体anti-CFTR, 1: 5,请由约翰·r·赖尔登北卡罗莱纳大学)在一夜之间 在一个潮湿的室。网格被冲洗PBS和提出适当的二次抗体的滴在10纳米胶体金(AURION,哈特菲尔德,PA)在室温下2小时,用PBS冲洗。更坚定adfix抗体绑定,网格被安置在0.1 2.5%的戊二醛磷酸缓冲15分钟。在蒸馏水冲洗后,电网与醋酸双氧铀染色。样品被认为与Tecnai生物双透射电子显微镜(范、Hillsboro或)。初级和二级抗体稀释在孵化缓冲区包含0.1% BSA-c (AURION), 0.05%在PBS渐变。

2.5。统计分析

比较治疗和使用学生的性别群体进行 以及对未配对样本。双尾 值( )是用来表示统计学意义。

3所示。结果

下面给出的数据的结合研究在两个机构独立执行。七周喂养梅奥诊所的研究而尽早研究表现在印第安纳州立大学普渡大学印第安纳波利斯(IUPUI)。独立研究的结果合并完成后的一系列实验。轻微的差异的实验方法和测量参数的函数的独立性之间的研究设计机构。

PCK老鼠被喂食控制饮食或饮食补充与吡格列酮断奶后开始。雄性和雌性动物是七周,尽早研究中使用的是在雌性老鼠进行的。数据分析了性别。政府的吡格列酮剂量20毫克/公斤体重在肾囊肿伴有明显降低负担后的雄性动物只有7周的吡格列酮治疗(表1;图1)。而雌性大鼠的肾囊肿减少负担没有喂养7周后达到统计学意义( ),有显著减少pioglitazone-fed女性14周后(表1;图1)。吡格列酮也有效减少肝囊肿负担7或14周后雌老鼠,但没有检测到轻度的肝囊性疾病影响7周后观察到的雄性老鼠。

表1
吡格列酮的效果(20毫克/公斤体重)PCK的乳腺纤维囊性疾病大鼠模型。

图1
吡格列酮对肾囊肿的影响PCK鼠模型。肾脏的图像显示横向部分动物喂了7、14周正常食物与吡格列酮(控制)或食物补充,近似的日常治疗4到20毫克/公斤BW表示图。

自从PPAR 受体激动剂表现出剂量依赖性,多晶的影响,我们也决定的功效较低剂量的吡格列酮(4毫克/公斤体重)囊性疾病的发展。有趣的是,这个剂量是一样有效的高剂量减少肾囊肿负担在雌性和雄性动物(表2)。低剂量也减少了肝脏重量的百分比雄性和雌性动物的体重。

表2
吡格列酮的效果(4毫克/公斤体重)PCK的乳腺纤维囊性疾病大鼠模型。

有一个趋势吡格列酮减少肾和肝纤维化。可能是因为纤维化是温和在疾病的早期阶段在这种动物模型中,吡格列酮的antifibrotic效果不会持续观察和达到统计学意义只在某些群体。在七周的研究中,吡格列酮是有效的在肾脏疾病在男性低剂量和肝脏疾病在女性在高剂量,在14周研究受体激动剂是影响肾皮质而不是雌性老鼠骨髓纤维化(表1和2)。

表3表明血清分析的结果进行的雌性动物美联储为14周。没有发现血清参数的变化除了提高血清白蛋白。又发生了类似的概要文件在7周时间点(数据没有显示)。

表3
血清概要文件从PCK女性mice-20毫克/公斤BW 4-18吡格列酮周。

阐明吡格列酮的作用机制在囊肿形成,雌性生殖道的顶端膜表达上皮细胞周围囊肿是596年检查使用单克隆抗体(19]。图2说明了雌性生殖道免疫反应性cholangiocytes衬里的肝囊肿。的CFTR-positive顶端膜染色见pioglitazone-treated动物控制组织减少。雌性生殖道不足存在于肾切片明确检测光级的变化虽然雌性生殖道频道显然是目前基于功能研究(6,9- - - - - -11]。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
疣状肝雌性生殖道的控制和pioglitazone-treated PCK老鼠经过14周的药物治疗。控制(a)或20毫克/公斤BW pioglitazone-treated (b)肝脏部分应用了雌性生殖道使用马伯596。两个面板所示是雌性生殖道染色(布朗)的顶端膜cyst-lining胆道上皮细胞。1000 x放大。

提供一个更好的定量方法,gold-labeled immunoelectron显微镜是用来评估雌性生殖道的密度表达式的顶端质膜胆管囊肿(图3)。部分从7药物治疗和6控制老鼠如图3所示的受到分析通过计算数量的黄金粒子绑定到顶端膜表面和表达这个量每线性粒子数 m顶端表面。36.24线性 米的顶端表面检查治疗动物和35.08 m是检查从控制动物。pioglitazone-treated组织表现出显著降低( )数量的水、局部CFTR immunolabeled检测抗体的粒子。1 gold-labeled粒子的胆管囊肿显示平均每0.23线性的 m顶端表面的动物控制饮食和平均每6.04 1 在动物与吡格列酮治疗。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
疣状肝雌性生殖道的控制和pioglitazone-treated PCK老鼠经过14周的药物治疗。控制(a)或20毫克/公斤BW pioglitazone-treated (b)肝脏部分应用了雌性生殖道CFTR马伯596检测抗体gold-labeled二级抗体紧随其后。所示面板是雌性生殖道染色(球面点)上皮细胞顶膜部分的周围胆管囊肿。49 000 x放大。

全面减少雌性生殖道摘要贴上EM的标签也观察到肾囊肿部分取自动物与吡格列酮治疗14周。然而,雌性生殖道的低丰度表达在肾囊肿的治疗和治疗动物杜绝统计评估变更的雌性生殖道免疫反应性的顶端膜。

4所示。讨论

各种各样的全部和部分PPAR 受体激动剂抑制vasopressin-stimulated Cl−通过雌性生殖道分泌物MDCK-C7 (Madin Darby犬肾、克隆7)细胞培养模型的主要细胞远端肾单位。受体激动剂抑制transepithelial Cl的剂量反应曲线- - - - - -运输的欧共体50为受体transactivation日志单元左倾趋势,这表明Cl−分泌非常敏感,体现在血清浓度达到或低于治疗胰岛素敏感性(6]。基于这些数据,这是PPAR的假设 介导的数量减少雌性生殖道通道线PKD的上皮细胞肾和肝囊肿会减少Cl的效果−分泌到囊肿腔,从而减少渗透动力流体积累。

先前的研究已经检查了PPAR 受体激动剂对PKD啮齿动物模型的影响。功能性PKD1基因敲除、基因编码polycystin 1蛋白,导致胚胎致死小鼠的表型出现积水,心脏conotruncal缺陷,和肾cystogenesis [20.]。原癌基因的胚胎心脏水平下降的显示,钙代谢异常和PECAM-1在肾小管和出血性素质,其中最严重的是出血性心包积液。母亲般地服用吡格列酮在高剂量(80毫克/公斤/天)胚胎的存活率提高的几天,改善心脏缺陷,降低了肾cystogenesis程度由一个未知的机制(20.]。在类似的研究中根据吡格列酮的抗肿瘤的性质,作者评估药物的效应PC-Pkd1-KO老鼠,ADPKD的迅速进步模型(21]。母亲喂养护理,然后是小狗,不改变肾脏功能,细胞增殖,凋亡,或囊肿形成。然而,PPAR 受体激动剂是提高生存和降压作用。戴和他的同事们使用了更多的慢慢进步,汉:SPRD鼠模型表明罗格列酮(10毫克/公斤体重/天)能够延缓肾囊肿和保护肾功能的恶化22]。作者暗示的作用机制可能是由于PPAR 的差别受体激动剂对这些基因的异常激活 连环蛋白信号通路以及抗炎和antifibrotic这类药物的影响。囊肿形成nonorthologous模型可能很难与人类疾病,因为肾囊肿主要是近端在起源和模型并不证明胆管囊肿形成,人类PKD是很常见的。

我们的研究,使用一个同源,慢慢进步大鼠模型,解决PPAR的影响 受体激动剂在病程早期治疗但在胚胎或新生儿期。这个临床前模型更紧密地模仿的情况时潜在的人类治疗的时机受体激动剂将是管理的本质和延缓疾病进展。数据表示两个独立的研究,结合回顾性分析。在实验协议虽然有差异,特别是关于喂养时间的长度,发现的力量在于最终结果的一致性。

PCK模型中只有7周的吡格列酮减少肝囊肿负担在雌性动物和雄性动物肾囊肿的负担。14周后pioglitazone-supplemented饮食,有显著的减少在男女两个肾脏和肝脏。肾脏的横断面图像同窝出生在饮食控制或pioglitazone-supplemented 14周表明,囊肿负担的减少主要是由于减少囊肿的大小。“减少”囊肿大小可能是由于经济增长放缓的囊肿吡格列酮的存在。

类似于人类ADPKD PCK鼠展览一些性别二态性肾和肝脏病理学的严重性23]。18周,病理改变在雄性和雌性都比较相似。在大约18周时开始,男性PCK老鼠加速肾脏囊性扩张导致更严重的肾功能障碍比女性(13,23]。然而,女性PCK老鼠开发更大的肝囊肿体积密度从18周(23]。在早期吡格列酮治疗功效的性别差异可能是由于微妙,性别差异在早些时候疾病进展。

喂养14周后血清资料表明,肾脏功能在这些动物相对完好尽管囊性负担。血尿素氮是在正常范围内,吡格列酮治疗没有显著改变。胆红素水平在正常范围内时,肝功能评估肝脏酶显示损害肝脏功能,这是证实了低水平的血清总蛋白和白蛋白。吡格列酮治疗不正确的肝酶的高水平,但血清白蛋白浓度增加。

吡格列酮对组织纤维化的影响更难以评估。在其他疾病,PPAR的使用 受体激动剂已经与减少炎症反应和组织纤维化,两个相关流程PKD导致器官功能下降。最近的研究表明,PPAR 受体激动剂可以减少纤维化等众多组织的表皮(24)、肺(25,26)、肾(27- - - - - -30.),和肝脏(31日- - - - - -34]。这些药物是有效的在多个纤维化疾病的药物靶点的共性。由于纤维化早期温和PKD的疾病进展的模型,也就不足为奇了关于PPAR的影响我们的结果 受体激动剂有些不一致。长期研究有必要澄清对纤维发展的潜在影响。

雌性生殖道活动的重要性在肾和胆管囊肿的形成是基于功能的研究。由于低丰度蛋白质的,很少有研究成功地检测了在本机肾囊肿的顶端膜蛋白免疫组织化学方法。PPAR的示范 受体激动剂减少雌性生殖道水平最初建立在培养细胞(6]。当前的研究能够扩展了以前的工作本地组织和证明在胆管囊肿,吡格列酮治疗结果在统计上显著的低数量的雌性生殖道的顶端膜蛋白cholangiocytes囊肿衬里。这些研究延长培养细胞实验和PPAR提供机制的原理 受体激动剂抑制囊肿的发展成长。

的想法使用雌性生殖道抑制剂治疗PKD并不新鲜。几组提出了这种方法(35,36]。最近发现,PPAR 使用药物受体激动剂抑制雌性生殖道合成提供了更多的可能性,已经经历了长期在人类身上测试。虽然PPAR 受体激动剂都有副作用,比如通过脂肪形成液体潴留和体重增加,这些都是相对温和的。然而,策略,减少不良事件是非常重要的在考虑PKD等慢性疾病的治疗方法。因为肾细胞培养的研究表明,受体激动剂浓度影响雌性生殖道发生在约一个数量级低于必要的稳定胰岛素作用[6),降低药物剂量以最小的副作用可能仍然是有效的。值得注意的是,低剂量的吡格列酮是有效的在我们的研究中剂量越高。

PPAR 受体激动剂改变等离子体膜的雌性生殖道的密度表达式但不干扰抗利尿激素的作用在水上运输或与抗利尿激素引起多尿症观察V2受体拮抗剂。此外,PPAR 不仅在肾脏受体激动剂似乎是有效的但在其他组织囊肿形成和增长依赖于CFTR-driven离子和液体分泌。因此,他们可能值,无论是单独或结合其他有希望的治疗方法,治疗PKD值得进一步考虑。

5。结论

研究表明,7 -或尽早吡格列酮喂养方案抑制肾和肝脏胆管囊肿增长PCK老鼠,直向同源人类PKD的啮齿动物模型。在胆管囊肿,影响是伴随着减少顶端的雌性生殖道的表达,表明行动的机制在活的有机体内比赛前细胞培养显示PPAR的数据 介导的减少雌性生殖道的表情。此外,在一些研究中,纤维化的程度是pioglitazone-treated动物的减少。这些研究提供概念验证PPAR的作用机制 表明受体激动剂,这些药物可以有效地控制肾和肝囊肿PKD的增长和纤维化。

确认

资金支持的研究在IUPUI IUPUI研究基金资助(b . l . Blazer-Yost)的支持,和发展基金的病理学和实验室医学(黄永发。陈)。梅奥诊所的研究是从武田制药提供资金支持的北美,Inc .作者感谢李安Baldridge(病理学和实验室医学系,印第安纳大学医学院)技术援助组织化学和免疫组织化学染色和卡洛琳•米勒与电子显微镜研究的专业协助。作者感谢John r .赖尔登(北卡罗莱纳大学)请提供雌性生殖道的单克隆抗体。