文摘

的过氧物酶体proliferator-activated受体- (PPAR )在脂质代谢中起着关键作用和能源燃烧。慢性激活PPAR 在啮齿动物中会导致肝细胞癌的发展。PPAR的能力 诱导其目标基因的表达取决于中介,一个复杂的进化代数余子式,特别是这个复杂的亚基1 (Med1)。在这里,我们报告PPAR的识别和表征 交互代数余子式(PRIC) -295 (PRIC295),一本小说共激活剂蛋白质,表明它与Med1交互和Med24中介复杂的子单元。PRIC295包含10 LXXLL签名主题促进核受体结合和与PPAR交互 和五个核受体超家族的其他成员ligand-dependent的方式。PRIC295提高transactivation PPAR的函数 ,PPAR ,呃 。这些数据表明,PRIC295 PPAR等与核受体相互作用 和功能作为一个转录共激活剂在体外条件和可能在中介的影响起着重要的作用在活的有机体内作为一个成员与Med1 Med24 PRIC复杂。

1。介绍

在哺乳动物脂类代谢是一个复杂的过程受不同的因素,包括核受体亚科的成员被称为过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)。有三种亚型的PPAR称为PPAR ,PPAR / ,PPAR (1- - - - - -3]。PPAR ,最初的同种型识别,是集中参与效反应诱导大鼠和小鼠肝脏治疗过氧物酶体扩散者(4- - - - - -7]。过氧物酶体扩散结构多样的化学物质,包括化合物如安妥明、苯扎贝特,nafenopin,和其他人一起邻苯二甲酸酯增塑剂、某些除草剂、农药、工业溶剂,白三烯D4受体拮抗剂(8,9]。多效性的反应诱导治疗后血清脂质过氧物酶体扩散国包括降低,肝过氧化物酶体的增殖,协调参与线粒体脂肪酸氧化诱导基因和酶 氧化和微粒体 氧化途径(10]。另外,大鼠和小鼠长期暴露于过氧物酶体扩散发展肝细胞癌的发生率高,即使这些化合物nongenotoxic和被认为是一种范式的表观遗传致癌作用(5,6,11]。PPAR 炎症过程中也发挥了重要作用[12- - - - - -15]。所有这些反应,包括肝细胞癌的发展,受体介导,通过选择性PPAR的激活 (16- - - - - -18]。

与类维生素a X受体- PPARs二聚化 (RXR )和过氧物酶体扩散国反应元素绑定(ppr)出现在目标基因的启动子区域19- - - - - -22]。没有同源的配体,目标基因的转录是由辅阻遏物蛋白质如沉默压抑的中介的视黄酸和甲状腺激素受体(SMRT) [23),核受体辅阻遏物(NCoR) [24,25),和受体相互作用蛋白140 (RIP140) (26)绑定到PPAR-RXR形成。配体结合后,PPARs进行构象变化导致辅阻遏物蛋白质的分离,然后允许策划招聘共激活剂的蛋白质(27,28]。这些通过各种途径增强转录辅激活蛋白质包括组蛋白乙酰转移酶的活动,甲基转移酶活动或调解的交互激活PPAR-RXR异质二聚体与基底细胞的转录机械(29日- - - - - -35]。

辅活化因子和coactivator-associated蛋白质参与PPAR 介导transactivation包括三个成员的SRC(类固醇受体共激活剂)/ p160家族的蛋白质(29日,32,36],CBP (CREB-binding蛋白质)/ p300 [35,37,38),PBP (PPAR 绑定蛋白)/ MED1 / TRAP220 / DRIP205 [30.,39- - - - - -45),PRIP / NCoA6 ASC2 / RAP250 / TRBP / NRC (46- - - - - -50),PIMT / NCoA6IP [31日],CARM1 [51],PRIC285 [33),PRIC320 / CHD9 CReMM [34,52),PGC-1 (53),PGC-1 ,和其他54,55]。每一个共激活剂蛋白质包含一个或多个守恒LXXLL ( , 所必需的)主题互动激活函数二(AF-2)域出席核受体(c端结束的56]。尽管一些代数余子式已经被证明与PPARs和函数作为转录监管机构在体外条件,有有限的数据在活的有机体内这些分子在PPAR-regulated目标基因的转录功能。迄今为止,删除Med1在肝脏被证明废除PPAR的能力 激活靶基因的转录以及阻止其他受体激活的多效性的影响,包括肝再生和肝细胞癌的发展57]。此外,Med1删除也会影响PPAR 调节脂肪生成在小鼠胚胎成纤维细胞和PPAR引起的脂肪形成的脂肪变性 超表达在肝脏58,59]。使用PPAR Med1首次克隆 酵母2台混合动力系统作为诱饵,随后PPAR检测 交互代数余子式(PRIC)复杂的大约25蛋白质分离大鼠肝脏核提取物(30.,33]。蛋白质在PRIC复杂的身份33]显示几个辅活化因子等酵母二者混合屏幕发现Med1 [30.),海关与边境保护局(35],SRC-1 [29日),Med24 / TRAP100 [60],PIMT [31日],PGC-1 [53]。PRIC复杂还包括一些新颖的蛋白质包括PRIC285等(33]。随后,这个方法被修改使用环丙贝特,合成PPAR 受体激动剂,从老鼠拉下来一个复杂的蛋白质的核提取,这导致识别PRIC320 / CHD9和其他一些高分子量的蛋白质(34]。在这项研究中,我们报告的数据显示,迄今为止无特征的高分子量蛋白质,指定PRIC295,包含10 LXXLL共激活剂图案,与PPAR交互 ligand-dependent的方式。PRIC295显著增强PPAR的转录活动 在体外。我们进一步证明PRIC295与Med1交互和Med24子单元的中介复杂表明PRIC295可能重要的核受体信号在活的有机体内。

2。材料和方法

2.1。亲和力肝脏核提取物和Ciprofibrate-Sepharose珠子的准备活动

从男性5 f - 344肝组织老鼠牺牲1小时后胃内的剂量的环丙贝特(250毫克/公斤体重)。核分离和提取准备其他地方描述(33,34]。环丙贝特是固定化AH-Sepharose 4 b碳化二亚胺反应如前所述[61年]。动物被安置在12小时光/ 12小时黑暗周期和维护在单独的笼子里用标准啮齿动物食物和水随意。综述了所有动物程序用于这项研究和批准的机构动物保健和使用委员会(IACUC)西北大学。

2.2。亲和力下拉和Matrix-Assisted激光解吸/电离时间飞行

Ciprofibrate-sepharose珠子被封锁脂肪酸1%免费的牛血清白蛋白和缓冲区包含0.5%生理盐水洗。核提取( 10毫克的蛋白质)获准与琼脂糖珠固定化在4环丙贝特在一夜之间 c .洗后,蛋白质从珠子和沸腾的解决筛选了sds - page Tris-acetate凝胶3% - -8%或4% - -20%丙烯酰胺凝胶(如前所述34]。凝胶与硝酸银染色形象化解决蛋白质和选定的乐队被切割和加工matrix-assisted激光解吸/电离时间飞行(MALDI-TOF)分析使用“航行者”号西北大学职业IMSERC实验室。观察到的山峰被确定使用MS-FIT(蛋白质探勘者,加州大学,旧金山)。隔离PRIC295相互作用蛋白,核提取物被允许与GST - (F2)蛋白质和结合蛋白受到MALDI-TOF分析。

2.3。PRIC295克隆和质粒结构

人类的全长cDNA (KIAA0219)购买从Kazusa DNA研究所,日本千叶。完整的表达载体是由限制消化的cDNA和结扎pcDNA3.1(+)表达载体(表达载体)。小的cDNA片段使用高保真放大rTth聚合酶(应用生物系统公司)和结扎成pcDNA3.1 (+), pGEX-5X-1(通用电气医疗集团),或点(Clontech)向量指定地点给质粒pcDNA-Δ (Fragment1-F1) pcDNA - (F2)和pcDNA-Δ (F3)。这些碎片也被结扎成pGEX-5X-1和点。所有最终向量经测序的基因组学核心设施在西北大学。在体外蛋白质翻译是使用TnT T7 quick-coupled转录/翻译工具包Promega根据制造商的协议,与L -放射性标记的35S-methionine(珀金埃尔默)。其他质粒包括pGEX-PPAR ,pCMX-PPAR ,pGEX-PPAR ,pCMX-PPAR ,pGEX-ER ,pcDNA-ER 、pGEX-CAR pGEX-TR ,pGEX-RXR ,pCMX-RXR ,pGL3-3xPPRE-LUC CMV-RL PGL3-3xERE-LUC GST-Med1,克隆的片段Med1融合销售税都以前描述(30.,33,62年]。

2.4。Northern和定量实时PCR

人类PRIC295 Northern mRNA表达了使用多个组织污点从Clontech购买和3 终端1 kb的PRIC295 cDNA探针。总RNA定量PCR分离使用试剂盒试剂(英杰公司)根据制造商的指示。定量PCR是使用ABI 7300(应用生物系统公司)。测试样本一式三份和规范化18 s核糖体RNA。特定PCR产品被融化曲线分析和测量使用比较测量相对基因表达的变化 方法, 。PRIC295 qPCR引物设计从外显子27和28。

2.5。GST-Pulldown PRIC295和核受体

销售税和GST-fusion蛋白质纯化使用谷胱甘肽琼脂糖4 b珠子(通用电气医疗集团)和孵化在体外合成PRIC295贴上35PRIC295 S-methionine(或碎片)。绑定被允许发生在温柔的在4瓶 C 2小时,然后绑定蛋白被筛选了,通过sds - page来解决和分析了放射自显影法如前所述30.,46]。量化执行绑定使用ImageJ软件可以从美国国立卫生研究院。

2.6。Transactivation化验

的能力PRIC295 PPAR增强转录激活介导 ,PPAR ,或者呃 用适当的质粒是衡量使转染海拉细胞使用Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的协议。质粒用于这些化验pCMX-PPAR ,pCMX-PPAR ,pcDNA-ER ,pCMX-RXR 、pGL3-3xPPRE-Luc pGL3-3xERE-Luc, pcDNA3.1-PRIC295。实验一式三份和荧光素酶表达评估使用dual-luciferase记者从Promega分析系统根据制造商的协议。配体用于这些实验(王寅PPAR - 14643 罗格列酮,PPAR ,17 - 雌二醇对ER )的浓度增加了100 m .转录活性PRIC295进一步检查使转染与pM-Δ海拉细胞 (F1), pM-Δ (F2)或pM-Δ (F3)表达嵌合蛋白质与dna结合域包含融合PRIC295的碎片(aa 1 - 147)酵母Gal4转录因子(63年]。这些细胞也与Gal4-TK-Luc转染质粒含有c端部分Gal4蛋白质和胸苷激酶启动子荧光素酶报告基因的上游。嵌合Gal4-PRIC295蛋白质的转录激活的荧光素酶报告基因分析相比之下与Gal4-TK-luc细胞转染空点向量(64年]。

2.7。免疫荧光、免疫印迹和Coimmunoprecipitation

海拉癌细胞与pCMX-PPAR转染 并使用lipofectamine pcDNA-PRIC295-3xFLAG 2000试剂。细胞和4%多聚甲醛固定48小时posttransfection anti-PPAR 20分钟,染色 (圣克鲁斯生物技术公司- sc - 9000)和anti-FLAG单克隆抗体M2(σ)。荧光显微镜和数码图像获得的照片是使用Eclipse E600尼康显微镜配备现货RT滑块数码相机和图像分析软件(诊断仪器)。免疫印迹进行确定PPAR的存在 、Med1或Med24 / TRAP100 PRIC复杂蛋白质的分离使用ciprofibrate-Sepharose和蛋白质绑定PRIC295 GST-pulldown化验。coimmunoprecipitation,海拉细胞转染pcDNA3.1-PRIC295-3xFLAG和pCMX-PPAR 表达向量如前所述。核提取和相互作用的蛋白质纯化后采用树脂与anti-FLAG M2抗体共价结合(σ)。受到蛋白质sds - page,然后使用anti-FLAG免疫印迹,anti-Med1(圣克鲁斯生物技术公司- sc - 5334),或anti-PPAR 。

2.8。统计分析

统计学意义的区别转染组细胞中使用荧光素酶化验被单侧学生的计算t以及使用Microsoft Excel 2007中的可用功能

3所示。结果与讨论

3.1。识别PRIC295

确定大鼠肝脏蛋白质与过氧物酶体扩散者我们最初使用了一种亲和层析的方法,涉及环丙贝特固定化AH-Sepharose 4 b的碳化二亚胺反应(61年]。这个过程导致了隔离的过氧物酶体proliferator-binding蛋白质范围在明显,31000 - 79000 (61年),但他们仍无特征由于有限的可用性和适用性当时MALDI-TOF技术(65年]。的一般可用性MALDI-TOF近年来质谱技术分析了肝脏核蛋白质绑定到GST-fused长篇PPAR (33),或者AH-Sepharose-ciprofibrate亲和矩阵(34]。在目前的研究中,我们描述的一员的身份从ciprofibrate-bound PRIC复杂蛋白质(图1(一)),被指定为PRIC295基于分子质量。质谱分析的高分子量蛋白质乐队透露一些肽片段匹配人类KIAA0219蛋白质(加入D86973数量,参考序列NM_006836)(图1 (b))。人类PRIC295股票94%同源性大鼠和老鼠orthologues和93%的同源性。其他蛋白质被MALDI-TOF PRIC复杂包括PRIC285 CREB-binding蛋白质(解旋酶CBP), PRIC250,甲状腺receptor-interacting蛋白230 (TRIP230)(图1 (b))。在这个复杂的,我们还发现了先前已知的PPAR 代数余子式的蛋白质包括PRIC285和PRIC320(数据没有显示)。

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图1
PRIC295环丙贝特绑定蛋白复合物。(a) Ciprofibrate-binding蛋白复合物分离大鼠肝脏核提取分析3% - -8% Tris-acetate银染色凝胶。巷1标记;结合蛋白2 BP巷。选择高分子量乐队(箭头)切除的凝胶,用胰蛋白酶消化。MALDI-TOF分析进行标记乐队产生peptide-matching蛋白质的身份,在降序从分子量最高到最低,PRIC295, PRIC285, CBP, PRIC250, TRIP230。(b)质谱和有限的蛋白质序列分析数据被MALDI-TOF与它们相关的肽片段序列,m / z比率和加入相应的数字。
3.2。PRIC295的分子特征

人类染色体基因编码PRIC295位于12 q23.24,由58个外显子。PRIC295的核苷酸序列数据中可用的第三方注释部分DDBJ / EMBL的基因库数据库下加入TPA数量:BK006575。8666个基点长记录有8013个基点的开放阅读框编码2671 aa蛋白质约295 kDa(加入NP_006827.1数量)。PRIC295包含10 LXXLL共激活剂图案位于aa L1,465 - 469;l2,1160 - 1164;l3,1461 - 1465;l4,1499 - 1503;l5,1596 - 1600;l6,1839 - 1843;l7,1926 - 1930;l8,2045 - 2049;l9,2330 - 2334;l102594 - 2598(图2(一个))。LXXLL图案是重要的在共激活剂和活化剂(受体)的相互作用。在PRIC295这些图案是进化保存在许多不同的物种(图2 (b))。这些保守序列侧翼LXXLL图案也被证明是最具影响力的决定辅活化因子和催化剂之间的相互作用的特异性。三个LXXLL图案,即L2,我7L,10、现在在PRIC295拥有保守脯氨酸在2的位置相对于第一个亮氨酸LXXLL图案(图2 (b))。脯氨酸的存在在这个职位类似于生物重要LXXLL图案与PPAR交互 如发现Med1 [30.]。

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图2
PRIC295结构特点。(a)的示意图表示PRIC295蛋白质表明LXXLL图案的位置红色和热在紫色重复域。(b)对齐的同源PRIC295选定的物种的基因组序列位点的所有10个LXXLL图案中包含人类PRIC295蛋白质。L LXXLLs屈指可数1到L10开始从氨基地区:L1aa465 - 469;l2aa1160 - 1164;l3aa 1461 - 1465;l4aa1499 - 1503;l5aa1596 - 1600;l6aa1839 - 1843;l7aa1926 - 1930;l8aa2045 - 2049;l9aa2330 - 2334;l10aa2594 - 2598。每个序列的生物模型对应显示在左边的序列。守恒的脯氨酸的位置在2 L2,我7L,10用一个箭头表示。

除了LXXLL图案,PRIC295序列也揭示了24热量重复(见表 在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2010/173907),可能扮演一个角色在蛋白质-蛋白质之间的关系以及能源生产和转换(NCBI-Conserved域Database-COG1413)(图2(一个))[66年]。热量重复域是由大约50疏水性和带电氨基酸保守在主题内特定位置(67年]。这些主题被认为是重要的调节蛋白质-蛋白质之间的关系虽然这发生的确切机制还不清楚。热的存在重复PRIC295地方在一个类的热量重复已知蛋白质参与基因转录和翻译,但也有其他功能(67年]。可能重复的热量在PRIC295可能重要的中介PRIC内的不同转录辅因子之间的相互作用复杂。

3.3。组织分布PRIC295记录

北部污点分析表明PRIC295 mRNA转录是长度8.5 kb,表示在许多不同的人体组织最高的表达式中观察到大脑,心脏、骨骼肌、胎盘(图3(一个))。在胸腺、脾脏、肝脏和小肠PRIC295表达明显而在肺癌和结肠癌成绩单几乎没有检测到。PRIC295的表达在不同的老鼠被qPCR评估,组织数据显示,表示对睾丸强劲,白色脂肪组织,大脑,心脏,肾脏(图3 (b))。在老鼠胚胎PRIC295 mRNA的表达也是评估使用qPCR方法和数据显示更高水平的表达在发育阶段E15.5 E16.5。通过E18.5表达水平很低(补充图 )。原位杂交数据PRIC295 mRNA在鼠标定位在不同的发展阶段应该提供线索表达组织在不同的发展阶段。

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图3
表达在人类和小鼠PRIC295组织。(a)北部的污点分析PRIC295 mRNA表达使用人体多种组织污点(Clontech)。污点包含2 克每车道聚(RNA从组织表示。PRIC295成绩单( 8.5 kb)表达在几乎所有的组织。定量PCR (b)数据显示PRIC295 mRNA的表达在几个不同的老鼠组织。引物设计放大的外显子27 - 28日地区cDNA序列。与18 s RNA样本归一化。RNA从5个不同的C57B6 / J男性集中,经营样本一式三份。标准偏差。
3.4。交互的PRIC295核受体

PRIC295和PPAR之间的相互作用 和其他一些核受体超家族的成员被GST-pulldown化验分析。这些都是使用bacterially-expressed执行GST-fusion核受体蛋白在体外翻译pcDNA-PRIC295(图4(一))。全身PRIC295绑定在体外对PPAR ,PPAR RXR 、汽车,呃 ,TR 和特定的受体配体(10 M - 100 米)增强这个绑定(图4(一);补充图 )。每个受体配体用于pirinixic PPAR酸(王寅- 14643) 罗格列酮,PPAR ,为RXR 9-cis-retinoic酸 TCPOBOP汽车,17 - 雌二醇对ER TR和三碘甲状腺氨酸(T3) 。PRIC295没有绑定到单独销售税,如预期(图4(一))。

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图4
PRIC295核受体的相互作用。(一)在体外交互的放射性标记的长篇PRIC295 PPAR核受体 RXR ,PPAR ,TR 、汽车,ER 。PRIC295放射性标记的使用35S-methionine(珀金埃尔默)和孵化GST-pulldown测定受体融合蛋白。( )-表示在体外绑定交互没有同源的配体和(+)+表示期间针对受体配体的存在在体外绑定交互。配体:王寅PPAR - 14643 ;为RXR 9-cis-retinoic酸 ;罗格列酮对PPAR ;三碘甲状腺氨酸(T3) TR ;1,4-Bis [2 - (3 5-dichloropyridyloxy)]苯(TCPOBOP)汽车;17 - 雌二醇对ER 。配体都是使用100的浓度 m (b)交互的放射性标记的PRIC295Δ碎片 (F1),Δ (F2)和Δ (F3) GST-fusion核受体蛋白。加载每个车道表示每个面板的底部。巷1输入;巷2销售税独自没有配体;巷3销售税仅针对受体配体;巷4 GST-receptor融合没有配体;巷5针对受体配体的存在。如前所述在使用的所有配体(a)。

进一步调查的地区PRIC295蛋白可能参与受体相互作用,进行更多的GST-pulldown化验使用GST-fusion受体蛋白质和在体外翻译PRIC295指定Δ碎片 (F1),Δ (F2)和Δ (F3)(图4 (b))。片段F1包含1 LXXLL (L1),片段2包含4 LXXLLs (L2- l5),片段3包含5 LXXLLs (L6- l10)(图2(一个))。片段Δ (F1) 1 LXXLL (L1)强烈束缚GST-PPAR ,GST-RXR ,GST-TR ,而Δ (F2)绑定GST-PPAR强烈 、GST-CAR GST-ER 。一般来说,F1和F2比F3更热衷于这些受体。尽管PRIC295碎片F1和F2 PPAR ,令人惊讶的是,没有可察觉的交互与片段Δ这种受体 (F3)虽然F3包含5 LXXLLs(数字2(一个)和4 (b))。相对绑定数字量化(补充图 )。这些观察表明,PRIC295可能发挥的作用在调节目标基因的转录的几个核受体超家族的成员。因为不同的核受体表现出不同的亲和力与PRIC295的3种不同的片段,进行交互可能不同的LXXLL图案可能确定绑定到给定的核受体。在这方面,片段1 (F1)只有一个LXXLL (L1)可能是重要的生物,因为这片段结合更容易比其他两个片段。还需要更多的研究来修改第一个LXXLL特异性和选择其他绑定。

3.5。PRIC295增强PPAR ,PPAR ,呃 在哺乳动物细胞介导的转录

为了检查的功能相关性PRIC295和核受体蛋白之间的相互作用,我们是暂时性coexpressed PRIC295 pCMX-PPAR / pCMX-RXR (图5(一个)),pCMX-PPAR / pCMX-RXR (图5 (b)),或者pcDNA-ER (图5 (c)在海拉细胞)。这些细胞与荧光素酶同时转染记者pGL3-3xPPRE-LUC PPAR 和PPAR 或pGL3-3xERE-LUC ER 为了测量PRIC295 transactivate受体介导转录的能力。PRIC295显然增加了荧光素酶报告基因的转录激活ligand-dependent方式与pCMX-PPAR cotransfected时 ,pCMX-PPAR ,或者pcDNA-ER (数据5(一个)- - - - - -5 (c))。PRIC295也增强PPAR / RXR 介导的转录激活pGL3-3xPPRE-LUC剂量依赖性的方式(图5 (d))。PRIC295也增强PPAR / RXR 介导的转录RXR的存在 配体9-cis-retinoic酸(补充图 )。这些结果证实PRIC295函数作为核受体PPAR共激活剂 ,PPAR ,呃 。

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图5
PRIC295函数作为核受体的转录共激活剂。PPAR的数据显示 (一),PPAR (b), ER (c), pGL3-3xPPRE-LUC作为PPAR的记者 和PPAR 而3 xere是用作ER记者 。海拉细胞转染100 ng pcDNA-PRIC295, pCMX-PPAR ,pCMX-pCMX-PPAR ,pCMX-ER ,pCMX-RXR pGL3-3xPPRE-LUC(或空pGL3-LUC向量),50 ng CMV-RL表示(+或质粒 )。每列所示是一式三份的意思是相对荧光素酶单位价值的实验。开酒吧代表活动没有在相应的配体的存在和暗酒吧(见图4)。所有的实验都是归一化的表达Renilla荧光素酶(CMV-RL)作为内部控制。统计学意义( 价值)是显示面板的底部和计算通过比较转染组使用一个标记 。(d) PPAR的转录激活 通过添加PRIC295的越来越多。所有其他质粒转染使用相同的数量表示。

进一步证实PRIC295 transactivational活动,进行Gal4-binding试验使用酵母Gal4-DBD PRIC295碎片融合,Δ (F1),Δ (F2)或Δ (F3)。这些嵌合蛋白也显示荧光素酶的转录能力显著提高记者的指导下胸苷激酶启动子融合Gal4 c端。细胞转染嵌合PRIC295-F1片段显示统计学意义( Gal4-DBD-F1和。001733年Gal4-DBD-F2)增加相对荧光素酶活性与细胞转染只有Gal4-DBD(图6)。Gal4-DBD-F3展出活动中只有适度增加(没有了)。这些数据清楚地表明PRIC295作为共激活剂的活性蛋白质虽然PRIC295施加这种影响的确切机制目前还不清楚。

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图6
PRIC295函数作为Gal4-binding共激活剂蛋白测定。转染嵌合Gal4-DBD-PRIC295-F1 (E)或Gal4-DBD-PRIC295-F2 (F)显著增强的荧光素酶报告基因的转录。转染嵌合Gal4-DBD-PRIC295-F3没有显著提高荧光素酶的转录记者(F3;不是说明)。海拉细胞转染100 ng pM-Δ (F1) (a), pM-Δ (F2) (b), Gal4-TK-Luc和50 ng CMV-RL(+或表示 )。每列所示是一式三份的意思是相对荧光素酶单位价值的实验。统计显著性计算相比,转染组使用一个标记 。
3.6。PRIC295约束力的合作伙伴

我们以前证明coactivator-binding蛋白质PIMT (NCoA6IP)与PRIP (ASC-2 / NCoA6), CBP, p300, Med1大概PIMT复杂(62年]。PRIP / ASC-2也与其他代数余子式形成一个稳定的复杂交互描述为ASCOM (ASC-2复杂)68年]。ASCOM含有组蛋白H3-lysine-4 (H3LK4)甲基转移酶MLL3或其paralogue MLL4 [68年]。ASCOM之间的交互和ATPase-dependent染色质重构复杂瑞士/ Snf也已经证明,这些交互促进这些核受体复合物的绑定目标基因(69年]。因为共激活剂和coactivator-associated蛋白质交互越来越频繁地承认,我们决定调查PRIC295同事是否与其他代数余子式。为了这个目的,我们选择使用Δ (F2)地区融合销售税在蛋白质的n端关联下拉潜在PRIC295约束力的合作伙伴从鼠肝脏核提取物(图7(一))。PRIC295-F2被选中,是因为这个片段4 LXXLLs通常绑定到所有核受体分析在这项研究中,我们也不可能成功地表达全长PRIC295 GST-fusion蛋白质。MALDI-TOF质谱分析,选定PRIC295 F2片段结合肽(图7(一))解决,sds - page显示PRIC285 [Q9BYK8] [33),Med12L Q86YW9, Med24 [Q99K74] [60),PRMT1 [Q63009] [70年],C / EBP [P17676] [71年),Med20 [Q9H944] [72年],ZNRD1 [Q6MFY5] [73年等(图7 (b))。确认这些潜在的相互作用,我们进行了免疫印迹分析PPAR的存在 、Med24和环丙贝特Med1绑定蛋白复合物(图7(一))。这些免疫印迹建立Med24和Med1蛋白质推倒使用ciprofibrate-Sepharose浆中出现形成PRIC295复杂(PRIC295COM)。

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图7
PRIC295-interacting蛋白质。(一)使用GST-ΔPRIC295-interacting蛋白质分离 (F2) (pGEX-Δ )拉下相互作用从大鼠的肝脏核提取蛋白质。选择乐队(巷2个基点;箭头)从4 - 20%切除Tris-HCl凝胶和胰蛋白酶消化释放肽片段。(b)肽片段来自切除乐队受到MALDI-TOF分析。身份匹配的蛋白质和肽片段显示一些匹配的肽序列,m / z比率,加入数字。在(a),免疫印迹ciprofibrate-binding蛋白质复合体揭示了PPAR的存在 (3)道,Med24 / TRAP100(巷4),和Med1(巷5)。
3.7。PRIC295定位之间的核和交互PRIC295和PPAR Med24, Med1完整的细胞

确认PRIC295的亚细胞定位,pcDNA-PRIC295-3xFLAG转染到海拉细胞。免疫荧光显微镜显示的核本地化FLAG-tagged PRIC295(图8(一个);面板PRIC295-3xFLAG)。我们还与pCMX-PPAR cotransfected这些细胞 和使用anti-PPAR 抗体在细胞核中我们证实了这种受体的表达(图8(一个);面板PPAR )。当PRIC295和PPAR 图像合并大部分核颜色黄色表示高度重叠在这些细胞表达蛋白质(图8(一个);合并后的图像),但还需要进一步的高分辨率研究来确定这两个蛋白在细胞核与。几个细胞的分析表明,一些细胞表达当别人只有PPAR PRIC295 (图8(一个);一个红色,一个绿色核除了几个黄颜色的核)。使用DAPI染色细胞核(图8(一个)DAPI)。

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图8
PRIC295的胞内定位。(一)免疫荧光显微镜来可视化PRIC295-3xFLAG和PPAR的胞内定位 在海拉癌症细胞转染pcDNA-PRIC295-3xFLAG和pCMX-PPAR 。Anti-FLAG M2单克隆抗体用于PRIC295-3xFLAG(绿色)和anti-PPAR 抗体被用来PPAR弄脏 (红色)。DAPI核染色细胞的可视化。合并的形象PRIC295-3xFLAG(绿色)和PPAR (红色)揭示了黄颜色的核coexpress蛋白质。绿色和红色的细胞在合并后的面板是一个迹象表明这些细胞不太可能与这两个质粒转染。(b)免疫沉淀反应数据显示纯化PRIC295-3xFLAG蛋白质和PPAR coimmunoprecipitated蛋白质 Med24 / TRAP100, Med1。细胞转染pcDNA-PRIC295-3xFLAG只。

我们使用免疫沉淀反应免疫印迹建立紧随其后在活的有机体内互动与PPAR PRIC295 、Med24 Med1(图8 (b))。为此,我们与PRIC295-3xFLAG转染细胞与标记抗体和免疫印迹和免疫沉淀反应的沉淀抗体PPAR 、Med24 Med1(图8 (b))。显然,这种方法建立的存在coimmunoprecipitated PPAR 、Med24 Med1(图8 (b))。这些观察表明PRIC295交互在活的有机体内不仅与PPAR 但也有两个中介在活细胞复杂的成员。还需要进一步的研究来分析核蛋白质绑定到所有三个PRIC295片段,F1, F2, F3,充分描绘PRIC295COM。

3.8。地中海GST-Pulldown建立与Med1 PRIC295互动和24体外

进行进一步实验证实PRIC295与中介之间的相互作用复杂的蛋白质Med1和Med24在体外(数据9(一个)- - - - - -9 (c))。在体外翻译和放射性标记的长篇PRIC295获准与GST-Med1片段(图9(一个))。碎片覆盖Med1 aa 1 - 740(没有显示),740 - 860,860 - 980,980 - 1055,1055 - 1130,1130 - 1250,1250 - 1370,和1370 - 1470年未能结合全身PRIC295(图9(一个))。然而,PRIC295绑定与片段的c端Med1含有氨基酸1470 - 1570(图9(一个))。这些化验Coomassie-stained GST-Med1融合蛋白用于补充图所示 。分析该地区Med1显示缺乏任何已知的保守域或结合位点。这是没有任何LXXLL图案Med1片段。为了确定该地区的PRIC295 Med1 aa 1470 - 1570,结合GST-pulldowns进行使用在体外翻译PRIC295碎片F1、F2和F3,发现F1与Med1相互作用强烈,但其他PRIC295片段显示最小的绑定(图9 (b))。最后,GST-pulldowns还显示,PRIC295与Med24(图9 (c))。

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图9
PRIC295与Med1交互。(一)在体外翻译和放射性标记的PRIC295蛋白质与已知的PPAR交互 共激活剂,Med1 GST-pulldown评估方法使用GST-fusion PBP蛋白质的蛋白质片段。PRIC295和GST-Δ之间的互动 似乎很强劲。(b)的放射性标记的GST-pulldownΔ (F1),Δ (F2)和Δ 使用GST-Δ(F3),分别 显示强大的约束力Δ之间发生相互作用 (F1)和GST-Δ 。

在过去的15年里,几个蛋白质已确定与PPARs交互和其他核受体和作为转录辅因子/ coregulators [18,55,74年]。我们一直使用MALDI-TOF方法识别和PPAR的特点 或其配体结合蛋白被称为PRIC复杂(33,34]。使用这种质量spectrography-based技术,我们现在报告识别小说共激活剂,PRIC295。PRIC295透露一个强大的、不仅与PPAR ligand-dependent交互 ,但与其他几个核受体蛋白。相当大的兴趣,这种蛋白质包含几个LXXLL和热重复主题似乎重要的转录(蛋白质-蛋白质之间的关系和67年]。这可能表明PRIC295中介目标基因的转录作用几个核受体超家族的成员,虽然这种交互的进一步调查及其与受体蛋白的作用在活的有机体内是十分必要的。

本研究还利用MALDI-TOF过程描绘PRIC295绑定蛋白复合物(PRIC295COM)。分析显示PRIC295结合蛋白,包括PRIC285 Med12L, Med20, Med24表明PRIC295在转录中扮演一个潜在的重要的作用。例如,应该注意的是,PRIC285包含UvrD解旋酶前面展示的主题,增强转录激活由PPAR (33]。协会与Med12L PRIC295 Med12基因亚基的假定的同系物中介复杂,Med1, Med20,和Med24中介复杂表明PRIC295可能作为一个平台蛋白质参与大型转录复合体的形成(33,34,75年,76年]。虽然Med1也已经有了很广泛的研究(见[77年];Viswakarma et al ., PPAR研究出版社)Med24和Med20所知甚少77年]。Med24最初被确定为一个辅助因子重要调节转录的甲状腺激素和维生素D受体相互作用和定位一起Med1 / TRAP220 [60]。Med24也可能额外角色以外的基因调控其作为中介的成员复杂(78年]。Med20是首次发现人类的同系物果蝇TRF-proximal蛋白(hTRFP)和被证实能够提高RNA聚合酶II[的转录活动72年]。Med20和中介一起复杂的子单元Med8和Med18中发挥着重要作用的正确折叠形成一个中介复杂的子单元79年]。PRMT1是一个精氨酸甲基转移酶识别PRIC295-interacting复杂的蛋白质。PRMT1被确认的交互与TIS21 BTG1蛋白质和已被证明在RNA加工有重要作用和转录70年,80年]。PRMT1强化PGC-1的活动 ,已知的PPARs共激活剂81年]。PRMT1 RNA加工和转录的作用已被证明是重要组成部分在介导病毒感染(82年]。C / EBP 是一种转录因子,参与过程是由PPARs包括脂肪形成和诱导内质网应激(71年,83年,84年]。在这项研究中,我们已经识别出C / EBP 复杂的蛋白质与PRIC295交互。锌带domain-containing 1 (ZNRD1)也是PRIC295-interacting复杂的蛋白质。ZNRD1作用在调节ERCC1和bcl - 2重要的癌症进展虽然它的机制目前还不清楚(85年]。ZNRD1似乎也影响在艾滋病毒感染的进展86年]。

证据表明,某些辅活化因子是必不可少的有效的PPAR转录激活 目标基因(57,87年]。条件缺失的小鼠肝脏共激活剂MED1导致受损部分肝切除术后肝再生(57]。缺乏Med1 PPAR废除的结果 配体诱导的多效性的反应包括hepatocarcinogenesis [57,87年]。Med1不足也让acetaminophen-induced肝毒性(87年]。另一方面,没有SRC-1, SRC-2, PPAR SRC-3没有影响 信号(见[88年];Viswakarma et al ., PPAR研究出版社)。Med1的交互激活PPAR至关重要 / RXR 异质二聚体与RNA聚合酶II和基底细胞的转录机械(89年]。此外,带有删除Med1导致胚胎杀伤力说明共激活剂的重要作用的蛋白质可能在其他组织(90年- - - - - -92年]。鉴于这种信息,互动与Med1 PRIC295, Med24,一些中介的其他成员复杂的蛋白质是特别感兴趣的

4所示。结论

在最近的过去,许多新共激活剂的蛋白质参与转录调节PPAR的表达 目标基因被发现和研究。这些辅活化因子格兰特调节转录PPAR的能力的一种方式 和其他核受体组织和特异性的方式。我们的研究表明,PRIC295核受体共激活剂与PPAR交互 和其他几个核受体和可能发挥更大的作用通过核受体在靶基因的转录。协会的蛋白质如Med1、Med24 Med20,中介与PRIC295表明存在复杂的成员在活的有机体内一个复杂的蛋白质PRIC295COM指定。

确认

作者感谢西北大学化学系的IMSERC实验室提供培训和访问MALDI-TOF使用的仪器分析。PRIC295核苷酸序列数据中可用的第三方注释部分DDBJ / EMBL的基因库数据库下加入TPA数量:BK006575。这项工作得到了国家卫生研究院的基金DK083163 (j . k . Reddy)和DK054030。

补充材料

补充材料包括补充表和5补充数据。氨基酸的补充表包含一个列表的位置热PRIC295蛋白质序列中重复。整个鼠标的补充数据包含定量PCR数据胚胎表达PRIC295在几个时间点(补充图1),GSTpulldowns完整长度PRIC295与几个核受体配体浓度降低(补充图2),定量测量PRIC295片段之间的绑定和几个核受体(补充图3),RXRαtransactivation数据使用同源配体(补充图4)和coommassie彩色加载GST必经下拉控件使用Med1执行片段(补充图5)。

  1. 补充材料
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