文摘

PPAR -αPPAR -β和PPAR -γ,RXR结合PGC-1α和SIRT1激活氧化代谢基因决定的胰岛素敏感性。在子宫内缺氧,通常在宫内生长受限(IUGR),并降低胰岛素敏感性往往是观察到这些婴儿和成人。我们试图调查氧张力的变化如何直接影响肌肉PPAR氧化基因的调控。在文化1%的氧气八天之后,C2C12肌肉肌母细胞减少PGC-1显示αPPAR -α,RXRα信使rna,以及CPT-1b UCP-2 mRNA。SIRT1和PGC-1α蛋白质减少,PPAR -γ蛋白增加。的PPAR -β受体激动剂(L165,041) 1%的最后24小时治疗导致UCP-2信使rna和蛋白质含量增加而罗格列酮诱导SIRT1, PGC-1αRXR -αPPAR -α、CPT-1b UCP-2 mRNA和SIRT1的蛋白质。在缺氧,白藜芦醇诱导SIRT1 RXR -αPPAR -α信使rna, PPAR -γ和UCP-2蛋白质。这些发现表明,缺氧改变组件的PPAR通路参与肌肉脂肪酸氧化基因转录和翻译。这些结果对理解产生影响选择性缺氧适应和它如何影响长期肌肉氧化代谢和胰岛素敏感性。

1。介绍

流行病学研究强调低出生体重之间的关联(激光焊)和宫内生长受限(IUGR)和增加代谢综合征的风险,或X综合症,在出生后的生活<一个href="#B1">1)由于胰岛素抵抗[的早期发展<一个href="#B2">2,<一个href="#B3">3]。降低胰岛素敏感性、胰岛素抵抗存在代谢综合症的明显特征明显,之前被认为是一个重要的病理生理事件在成人疾病过程的早期(<一个href="#B4">4]。胰岛素敏感性主要是由骨骼肌对胰岛素的响应,因为90%的胰岛素刺激葡萄糖吸收发生在这个组织。在胰岛素抵抗个体,通常显示改变骨骼肌脂肪酸运输和氧化、intramyocellular脂质积累,并降低线粒体耗氧量(<一个href="#B5">5,<一个href="#B6">6]。核受体家族,过氧物酶体Proliferator-Activated受体(PPARs) PPAR -αPPAR -β/δ和PPAR -γPPARs的义务cotranscription因素,视黄素X受体(RXR)和转录辅激活PPAR -γ,coactivator-1α(PGC-1α),被认为是必不可少的在生成正常骨骼肌纤维类型分布、脂肪酸氧化代谢和胰岛素敏感性<一个href="#B7">7- - - - - -<一个href="#B10">10]。此外,sirtuin蛋白,SIRT1,提出了说谎的中心监管循环调节PGC-1的行为αPPARs,最终控制肌肉脂肪酸氧化(<一个href="#B11">11,<一个href="#B12">12]。

PGC-1α水平与综合氧化能力直接相关,维持大量的线粒体活性和氧化蛋白质,从而增加胰岛素敏感性(<一个href="#B13">13]。减少骨骼肌PGC-1α与胰岛素抵抗和2型糖尿病的发展(<一个href="#B14">14]。肌肉PGC-1α表达式是依赖PPAR -β/δ活动(<一个href="#B9">9),连同PPAR -α直接和间接地调节基因参与脂肪酸运输和氧化<一个href="#B15">15- - - - - -<一个href="#B17">17]。两个特别重要的是肉碱palmitoyltransferase 1 (CPT-1b),参与线粒体转移和长链脂肪酸氧化<一个href="#B18">18],解偶联蛋白(UCP-1、2和3)家庭负责调节线粒体电子通量和增强线粒体脂肪酸氧化的<一个href="#B19">19,<一个href="#B20">20.]。直接改变了这些基因的表达与胰岛素不敏感,通过脂肪酸氧化障碍,intramyocellular脂质积累,和线粒体损伤(<一个href="#B21">21- - - - - -<一个href="#B23">23]。

潜在的改变上述信号通路在胰岛素抵抗的发展强调IUGR研究[<一个href="#B2">2,<一个href="#B3">3]。低出生体重和IUGR婴儿在胰岛素敏感性指标显示显著差异早在2和7岁(<一个href="#B2">2,<一个href="#B4">4)和外周胰岛素抵抗在成年早期临床结果一致(<一个href="#B3">3,<一个href="#B24">24]。IUGR动物模型进一步研究报告改变胎儿和下游基因在肌肉脂肪酸氧化,如CPT-1b和跟单信用证的家庭(<一个href="#B25">25),和永久改变身体成分,包括增加肥胖(<一个href="#B26">26]。这些研究表明,在子宫内程序改变肌肉氧化代谢可能表现在产后生活。

短期内,IUGR孕妇通常显示减少氧气和其他营养供给胎儿(<一个href="#B27">27,<一个href="#B28">28),由于慢性衰竭胎盘气体和营养(葡萄糖和氨基酸)和功能(即交换。胎盘功能不全),相应的减少胎儿生长。研究关于全球胎盘机能不全在胎儿肌肉发展的影响和可能的产后结果正在崛起,但直接影响单个组件的胎盘机能不全,如缺氧、缺乏。缺氧是胎儿生长的关键调节器,独立于其他营养物质(<一个href="#B29">29日,<一个href="#B30">30.),和分子氧能量稳态中起着至关重要的作用,为调制基因表达提供了线索。此外,产前的影响,如在子宫内缺氧导致组织氧气供应减少,已经建议一样重要基因和生活方式因素导致当前成人肥胖和2型糖尿病的“流行”,或代谢综合征<一个href="#B1">1]。然而,在SIRT1 / PGC-1缺氧的影响α/ PPAR信号通路和下游靶基因特征并不好。进一步,提高肌肉的胰岛素敏感性在肥胖和糖尿病的人类和动物模型,通过使用胰岛素增敏剂,如PPAR -β/δ受体激动剂(和SIRT1调节器,如白藜芦醇,已经成功地恢复骨骼线粒体监管和胰岛素敏感性(<一个href="#B31">31日- - - - - -<一个href="#B33">33]。的影响在低氧诱导的情况下改变相关的机械调节胰岛素敏感性不记录。本研究的目的是确定特定PPARs氧张力变化的影响,他们的监管机构以及下游基因,探讨监管程序被PPAR -激活β受体激动剂,L165041 PPAR -γ受体激动剂罗格列酮和积极的SIRT1调制器,白藜芦醇,减少氧张力环境。

2。方法和材料

2.1。实验设计

C2C12成肌细胞细胞系是购自写明ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)。C2C12细胞株是研究建立PGC-1 / PPAR交互以及氧化能力(<一个href="#B34">34,<一个href="#B35">35和之前一直利用缺氧研究<一个href="#B36">36,<一个href="#B37">37]。细胞在DMEM培养补充10%胎牛血清的大约70%和融合之前通道或分化诱导。C2C12细胞诱导分化与2%的成年马血清DMEM补充(DM)。缺氧研究细胞被放置在两个(5%或1%的氧气)减少氧气政权长达八天每48小时与介质变化。控制样本孵化21%的氧气。在厌氧缺氧是获得通过将合适的文化孵化器(模块化孵化室(mic - 101) Billups-Rothberg,德尔,CA)刷新和充满了预定的氧混合物,O 1%或5%2(5%的有限公司2、平衡N2)。5%和1%氧气政权被选为代表的胎儿动脉氧合正常生长情况下(5% ~ 38托)和缺氧胎儿生长受限情况(1% ~ 8托)(<一个href="#B28">28,<一个href="#B38">38]。而在活的有机体内胎儿肌肉细胞张力会在较低的浓度,使用相对浓度被认为是适合强调改变氧张力微分的影响(<一个href="#B36">36]。细胞收获之前治疗或天零(D0),然后在两个(D2)、五(D5), 8 (D8)天之后开始具体氧气政权信使rna和蛋白质分析。

额外的实验中,七天之后设置氧气政权;差异化的肌管受体激动剂治疗,疗程PPAR -β(l - 165041;10μ米,EMD生物科学,德国)<一个href="#B39">39),PPAR -γ(Rosiglitozone;10μ化学)[M,开曼群岛<一个href="#B34">34),SIRT1激活,白藜芦醇(50μ米,EMD(生物科学)<一个href="#B40">40),或车辆,DMSO溶液。受体激动剂和调制器的治疗根据先前的报道与C浓度测定2C12准备工作(<一个href="#B34">34,<一个href="#B39">39,<一个href="#B40">40]。细胞然后回到各自的控制(21%氧气)或低氧(5%或1%的氧气)条件下,信使rna和蛋白质样本收获24小时后。

2.2。制备的RNA和实时PCR程序

总细胞溶解产物收集相对mRNA量化。总RNA制备试剂盒试剂,使用上标生成和互补(安大略省生命技术公司Burlington)和低聚糖dT底漆。实时PCR进行使用20 ng的稀释cDNA,每个引物200海里,SYBR绿色PCRmix (BioRad、大力神、钙、美国))在CFX384实时PCR检测系统(Bio-Rad)。集中的相对标准曲线C2C12互补脱氧核糖核酸生成(6系列标准准备4倍稀释),用于未知样本的量化表达式。结果调整核糖体蛋白的相对水平地级(RL7) mRNA,表示相对于对照组的平均值为每一个基因。特定的引物集和PCR条件鼠标液态氧,SIRT1, PGC-1αRXR -αPPAR -α,β/δ,γ、CPT-1b UCP-2详细表<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/tab1/" target="_blank">1,特定PCR产品排序来确认他们的身份。目标cDNA水平量化利用智商SYBR绿色主人混合(Bio-Rad)根据制造商的指示。所有结果规范化RL7 RNA(表<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/tab1/" target="_blank">1)。相对表达式显示为一个相对折叠目标基因的变化为零使用Pfaffl方程[<一个href="#B41">41]。

表1
基因,加入数字,正向和反向引物序列,用于实时PCR分析和计算效率。
2.3。免疫印迹分析

总收集细胞溶解产物蛋白质的决心。蛋白质数量决定使用洗涤剂兼容分析工具包(Bio-Rad)。20微克的总蛋白与4 x混合样本缓冲区,煮一分钟和加载到4% - -12% sds - page梯度凝胶。足够的蛋白质分离后,他们转移到PVDF膜(通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)。西方墨迹图进行了使用抗体购自圣克鲁斯生物技术(美国圣克鲁斯,CA)来确定SIRT1的水平(sc - 15404, 1: 200)或PGC-1α(sc - 13067, 1: 200)或PPAR -γ(sc - 7196, 1: 200)和从Abcam(美国Cambridge, MA)来确定UCP-2 (Ab67241(1: 500),一夜孵化在4°C。墨迹孵化一小时有一种辣根过氧化物酶共轭驴antirabbit二级抗体(711-035-152,1:10000;杰克逊ImmunoResearch实验室有限公司西树林,PA)和特定的蛋白质被发现使用ECL化学发光底物(美国热费希尔科学,罗克福德,IL)。加载控制,墨迹reprobed使用一种多克隆抗体β微管蛋白(ab - 5046, 1: 10000)。免疫印迹分析执行的标准方法使用增强化学发光,按照生产厂家的说明书(热费希尔科学)和量化使用数量一个软件(Bio-Rad)。

2.4。统计分析

密集的文化实验,褶皱的差异从零感兴趣的基因的mRNA生成和规范化RL7 mRNA和0设置为1。相应的蛋白质数据规范化β微管蛋白样品和天0样本设置为1。常态的信使rna和蛋白质数据与小动物——一张长有F检验测试,然后分析使用一维方差分析和图基期末测验。数据给出平均值±和SEM和代表3 - 5个独立的实验 - - - - - - v 一个 l u e < 。 0 5 被认为是具有统计学意义。PPAR -β/δ,γ受体激动剂和白藜芦醇试验,褶皱差异相对感兴趣的特定基因mRNA的表达规范化RL7信使rna被报道。在不同氧政权的影响治疗(L165,041、罗格列酮和白藜芦醇)被学生的评估 以及,给出平均值±SEM和代表3 - 5个独立的实验。一个 - - - - - - v 一个 l u e < 。 0 5 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。减少氧张力和PPAR表达的标记

确认的有区别的肌管经历缺氧条件下,表达赖氨酰化氧(LOX) mRNA, HIF-1α全身的分子标记(<一个href="#B42">42)确定。在1%的氧气,液态氧信使rna是显著增加控制权在第五天(D5)和第八天(D8)(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig1/" target="_blank">1)。有趣的是,当液态氧水平似乎在D8居高不下的1%文化、LOX mRNA拒绝控制在D8文化的5%水平。这些数据证实长期缺氧环境的存在1%的文化系统,HIF-1α感应等目标基因的液态氧发生,尽管一个微分反应是观察到5%的治疗。


图1
LOX mRNA控制(21%氧气),5%或1%的氧气在一天收集点0,2,5,8。值代表的意思是3 - 4实验。 。方差分析,∗控制之间的重要时间点和相应的缺氧时间点( )。

PPARs, PPARs义务cotranscription因素RXRα,PGC-1α,被认为是必不可少的在促进正常的胰岛素敏感性通过调节氧化基因(<一个href="#B15">15]。在21%的氧气,PGC-1α和PPAR -α信使rna上升而RXR)α保持不变。然而,PGC-1α和PPAR -α信使rna在1%和5%显著降低氧气控制时间点相比D5(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig2/" target="_blank">2(一个)和<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig2/" target="_blank">2 (b))。RXRα密集mRNA水平保持不变在21%政权(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig2/" target="_blank">2 (c)),而水平也降低了作为PGC-1观察α和PPAR -α相比,各自控制水平(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig2/" target="_blank">2 (c))。相反,SIRT1和PPAR -β和- - - - - -γ信使rna被氧化的水平(数据未显示)。

(一)PGC1-α
(一)PGC1-α
(b) PPAR-α
(b) PPAR-α
(c) RXR-α
(c) RXR-α
图2
褶皱的变化PGC-1α(一),PPAR -α(b)和RXR -α(c) mRNA在第0天、2、5和8下三氧政权:控制21%,5%和1%。值代表的意思是4 - 5实验。 。方差分析,#和# #重要从0天内21%的氧气( 和 );*各自21%的氧气之间的重要时间点和相应的缺氧时间点( )。

PPAR目标基因包括肌肉脂肪酸代谢的监管机构,如CPT-1b和UCP-2 [<一个href="#B15">15]。类似于PGC-1上升α和PPAR -α信使rna在为期八天的文化下21%的氧气,CPT-1b UCP-2信使rna也增加。虽然两种缺氧政权(5%和1%),CPT-1b mRNA在D8显著降低(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig3/" target="_blank">3(一个)),UCP-2 mRNA减少D5和D8(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig3/" target="_blank">3 (b))。这些数据表明,在低氧的情况下,PPAR目标mrna在成肌细胞分化减少。

(一)CPT-1b
(一)CPT-1b
(b) UCP-2
(b) UCP-2
图3
褶皱的变化CPT-1b (a)和UCP-2 (b) mRNA在一天收集点0,2,5,8下三氧政权:控制21%,5%和1%。值代表的意思是4 - 5实验。 。方差分析,# #重要从0天内21%的氧气( );*各自21%的氧气之间的重要时间点和相应的缺氧时间点( )。
3.2。缺氧改变SIRT1, PGC-1α和PPAR -γ蛋白质

PGC-1的主要监管机构α活动是脱乙酰作用SIRT1酶(<一个href="#B12">12]。控制21%的氧气,SIRT1蛋白质水平显著上升时期的8天的文化,而PGC-1α蛋白质水平是一致的。然而,在1%的氧气SIRT1蛋白质相比显著降低控制D5和D8收集点(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig4/" target="_blank">4(一)),尽管一成不变的mRNA表达,暗示诱导SIRT1的转译后的修改。

(一)SIRT1
(一)SIRT1
(b) PGC-1α
(b) PGC-1α
(c) PPAR-γ
(c) PPAR-γ
图4
PGC-1蛋白质SIRT1 (a)水平α(b)和PPAR -γ(c)规范化β微管蛋白在第0天、2、5、8三氧政权:控制21%,5%和1%。值代表的意思是4 - 5实验。 。代表墨迹图所示。方差分析,#和# #重要从0天内21%的氧气( 和 ),*各自21%的氧气之间的重要时间点和相应的缺氧时间点( )。

此外,SIRT1调节细胞能量代谢的另一个途径,控制PPAR -γ扮演一个关键的角色在系统脂质和葡萄糖稳态(<一个href="#B7">7]。SIRT1压制PPAR -γ活动,促进脂肪酸动员和减少脂肪堆积<一个href="#B43">43],PPAR -γ压制SIRT1 [<一个href="#B44">44]。结合SIRT1蛋白质减少,PPAR -γ蛋白质增加5%和1%氧气,它是在缺氧的治疗在D8显著升高(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig4/" target="_blank">4 (c))。这些结果表明,在缺氧发生SIRT1蛋白质水平降低与增加PPAR -γ蛋白质的水平。

3.3。PPAR -βPPAR -γ,SIRT1调节器改变低氧诱导的改变

PPAR的管理β/δ受体激动剂(GW501516和L165041)已被证明能够促进骨骼肌脂肪酸氧化,改善胰岛素敏感性在高脂肪饮食的情况下<一个href="#B39">39,<一个href="#B45">45]。符合D8缺氧文化数据RXR -α减少(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig2/" target="_blank">2(一个)和<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig5/" target="_blank">5(一个)),孵化的C2C12与L165,041肌管(10μ米)24小时D7分化后导致显著抑制RXR -α信使rna低于21%氧气(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig5/" target="_blank">5(一个))。没有明显L165,041影响SIRT1, PGC-1αPPAR -α或PPAR -β/δ信使rna虽然RXR——有增加趋势α(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig5/" target="_blank">5(一个))和PPAR -γ与L165,041 mRNA在1% ( < 。 0 8 和 < 。 1 、职责)。L165,041刺激增加UCP-2 mRNA的表达在减少氧气疗法(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig5/" target="_blank">5 (b))。在5%或1%的氧气,CPT-1b信使rna是增加,尽管这并不重要(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig5/" target="_blank">5 (c))。此外,蛋白质含量为SIRT1是减少和PPAR -γ升高,正如前面演示了在缺氧。然而,治疗L165,041引起蛋白质在21%和5%的氧气没有改变,尽管UCP-2蛋白质高在1%的氧气当L165,041处理( < 。 0 6 )。

(一)RXR-α
(一)RXR-α
(b) UCP-2
(b) UCP-2
(c) CPT-1b
(c) CPT-1b
图5
PPAR -的影响β/δ受体激动剂(L165,041 10μ米)治疗24小时,7天之后分化相对氧政权下,21%,5%,1%。褶皱的表达RXR -α(一)UCP-2 (b), CPT-1b (c) mRNA(+)和(−)L165,041。值代表的意思是4 - 5实验。 。L165,041的影响在每个氧政权被学生评价 以及,* ,* * ,* * * 。

PPAR -γ刺激,通过感应(包括)1α,促进线粒体生物起源和胰岛素敏感性在几个周组织包括肌肉组织(<一个href="#B13">13,<一个href="#B46">46]。后七天的区别在缺氧条件下,PPAR -γ受体激动剂罗格列酮(10μ米),诱导SIRT1的强劲增长,PGC-1α和PPAR -α信使rna在1%的氧气(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig6/" target="_blank">6(一),<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig6/" target="_blank">6 (b),<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig6/" target="_blank">6 (c)),在21%或5%氧气的影响不大。同样,RXR -α信使rna低于1%氧气增加(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig6/" target="_blank">6 (d)),如PPAR -γ,但这是不重要的(数据未显示)。CPT-1b mRNA用罗格列酮治疗时增加1%(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig6/" target="_blank">6 (e))是UCP-2 ( < 。 0 1 数据未显示),虽然没有效果在21%和5%。罗格列酮治疗没有影响PPAR -γ蛋白质,SIRT1蛋白质与罗格列酮(图下增加1%的氧气<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig6/" target="_blank">6 (f))和UCP-2蛋白质表现出一种增加的趋势( < 。 0 6 )。

(一)SIRT1
(一)SIRT1
(b) PGC-1α
(b) PGC-1α
(c) PPAR-α
(c) PPAR-α
(d) RXR-α
(d) RXR-α
(e) CPT-1b
(e) CPT-1b
(f) SIRT1
(f) SIRT1
图6
PPAR -的影响γ受体激动剂(罗格列酮,10μ米)治疗24小时,7天之后分化相对氧政权下,21%,5%,1%。PGC-1褶皱SIRT1的表达(a)α(b), PPAR -α(c) RXR -α(d), CPT-1b (e) mRNA, SIRT1蛋白质(f)(+)和(−)罗格列酮。值代表的意思是3 - 4实验。 。罗格列酮的影响在每个氧政权被学生评价 以及在氧气政权,* ,* * 。

SIRT1的活动,如白藜芦醇的药理调节器天然多酚化合物以其胰岛素敏化和抗氧化性能<一个href="#B35">35,<一个href="#B47">47),显著提高SIRT1的活动在体外和在活的有机体内(<一个href="#B48">48]。SIRT1 mRNA在控制和显著增加缺氧条件下氧(5%和1%),白藜芦醇治疗(50μ米)(图24小时<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig7/" target="_blank">7(一))。白藜芦醇也有刺激影响RXR -α(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig7/" target="_blank">7 (b))和PPAR -α信使rna在1%的氧气,但后者不显著(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig7/" target="_blank">7 (c), < 。 1 ),而对PGC-1没有影响α或PPAR -β/δ缺氧下被观察到。这些变化发生在协会PPAR -显著下降γ信使rna低于5%氧气和1%氧气治疗(图下一个趋势<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig7/" target="_blank">7 (d), < 。 1 )。有趣的是,孵化与白藜芦醇肌管24小时,低于5%或1%的氧气,显著减少恢复CPT-1b mRNA表达5%氧气和增强CPT-1b mRNA为1%(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig7/" target="_blank">7 (e))。白藜芦醇诱导显著上升在UCP-2 mRNA在控制氧气条件下,低氧诱导抑制UCP-2信使rna也不恢复缺氧治疗。尽管没有改变或减少mRNA, PPAR -γ白藜芦醇和UCP-2蛋白质增加1%(数据<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig8/" target="_blank">8(一个)和<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig8/" target="_blank">8 (b))。

(一)SIRT1
(一)SIRT1
(b) RXR-α
(b) RXR-α
(c) PPAR-α
(c) PPAR-α
(d) PPAR-γ
(d) PPAR-γ
(e) CPT-1b
(e) CPT-1b
图7
SIRT1调制器(白藜芦醇,50的效果μ米)治疗24小时,7天之后分化相对氧政权下,21%,5%,1%。褶皱SIRT1的表达(a) RXR -α(b) PPAR -α(c), PPAR -γ(d)和CPT-1b (e) mRNA(+)和(−)白藜芦醇。值代表的意思是4 - 5实验。 。白藜芦醇的影响在每个氧政权被学生评价 以及在氧气政权,* ,* * 。
(一)PPAR-γ
(一)PPAR-γ
(b) UCP-2
(b) UCP-2
图8
SIRT1的影响调制器(白藜芦醇,50μ米)治疗24小时,7天之后分化相对氧政权下,21%,5%,1%。蛋白质水平的PPAR -γ(a)和UCP-2 (b)和(+)没有(−)白藜芦醇。值代表的意思是3实验。 。白藜芦醇的影响在每个氧政权被学生评价 以及在氧气政权,* ,* * ,* * * 。

4所示。讨论

在这里,我们表明,减少慢性紧张到5%和1%氧的八天引入SIRT1的水平下降,PGC-1αRXR -α和PPAR -α信使rna以及CPT-1b UCP-2 mRNA在C2C12肌肉细胞。伴随着这些下降的PPAR -β/δ和- - - - - -γ信使rna,但是减少了SIRT1 PGC-1α和高架PPAR -γ蛋白质的水平。在缺氧,这些变化在一定程度上可以预防、在体外,通过PPAR -β/δ和- - - - - -γ受体激动剂和SIRT1调制器干预。

4.1。PGC-1αPPAR / RXR和监管者,在缺氧受损

肌肉PGC-1α启动子/增强子序列包含一个守恒的过氧物酶体proliferator-activated受体响应元件(PPRE)结合PPAR -β/δ/ RXR -α在骨骼肌形成<一个href="#B9">9]。尽管PPAR -β/δ信使rna和蛋白质被缺氧机制不变,RXR -α信使rna是显著降低,结合PGC-1减少α信使rna和蛋白质。先前的研究已经表明,暴露于低氧减少PPAR / RXR-binding活动和失效PPAR活动减少的可用性专性合作伙伴RXR -α在心脏细胞(<一个href="#B49">49]。进一步,这失活似乎HIF-1监管通过减少DNA结合PPAR-RXR [<一个href="#B50">50,<一个href="#B51">51]。在我们的研究中,我们测量了LOX mRNA水平,这是一个行之有效的HIF-1目标α活动(<一个href="#B52">52]。缺氧下,液态氧mRNA显著升高,支持的概念提升HIF-1活动在我们的文化系统和可能减少PPAR / RXR -的主要机制α随后减少PGC-1α转录在缺氧肌肉肌管。

4.2。氧张力影响PGC-1α活化剂SIRT1

C2C12SIRT1 mRNA在慢性肌肉缺氧不变的文化,虽然SIRT1的蛋白质明显沮丧。这改变了SIRT1的转译后的修改已经观察到以前,在长期缺氧克服了SIRT1在脱去乙酰基的作用HIF-1αHIF-1 normoxia和导致激活α结合了SIRT1蛋白质在缺氧<一个href="#B53">53]。长期缺氧诱导氧化还原电势的改变(<一个href="#B53">53,<一个href="#B54">54),这导致减少SIRT1表达式通过增加绑定C-terminal-binding蛋白1 (CtBP-1) [<一个href="#B55">55]。虽然有稳定的SIRT1 mRNA在缺氧在当前的研究中,整体蛋白质合成减少,可能通过HIF-1行动和磷酸化,抑制真核eIF2启动因素α和失活eIF4F mTOR激酶(<一个href="#B56">56]。SIRT1是一个强有力的河畔+端依赖蛋白脱乙酰酶和PGC-1中央监管机构α/ PPAR肌肉氧化过程(<一个href="#B12">12]。因此,低氧诱导减少SIRT1在PGC-1水平和可能的活动将进一步影响α活动状态和随后PGC-1α/ PPAR目标基因激活。

4.3。缺氧损害PPAR脂肪酸氧化的目标基因

低氧诱导减少NAD+对应于减少SIRT1的活动(<一个href="#B55">55),PGC-1激活降低α和PPAR -α(<一个href="#B12">12,可能的转录脂肪酸氧化能力的关键组件。在慢性缺氧肌管文化、结合打乱了SIRT1 / PGC-1α/ RXR / PPAR通路,目标基因CPT-1b和UCP-2减少。同样,PPAR -差别缺氧对这些α和RXR -α在心脏的文化中,也涉及减少CPT-1b和ucp - 3表达(<一个href="#B49">49,<一个href="#B57">57]。观察到的减少C2C12CPT-1b UCP-2,可能通过诱导发生失活的PPAR -α通过减少其专性合作伙伴RXR的可用性。据报道,这是导致PPAR - dna结合活性降低α/ RXR缺氧细胞和随后的目标基因表达(<一个href="#B49">49,<一个href="#B50">50]。尽管没有改变肌管PPAR -β/δ表情,PGC-1αPPAR -α,RXRα转录抑制,表明PPAR -β/δ交互,孤独,不足以维持CPT-1b转录和UCP-2慢性缺氧。

除了PPAR -β/δ和- - - - - -α越来越明显的是,肌肉PPAR -γ对于脂质和碳水化合物代谢体内平衡是至关重要的<一个href="#B7">7,<一个href="#B10">10]。PPAR -γ信号激活大量的氧化和insulin-sensitizing基因的表达,包括跟单信用证(UCP-2和3),抵抗素,脂联素(<一个href="#B58">58,<一个href="#B59">59]。PPAR -γ活动是由磷酸化状态和磷酸化的丝氨酸残基273小鼠胚胎成纤维细胞导致大量胰岛素敏化基因的失调(<一个href="#B60">60]。进一步使用罗格列酮,PPAR -阻碍方面γ磷酸化、改善胰岛素敏感性指数(<一个href="#B60">60]。另一方面,有趣的是,其他PPAR -的突变γ磷酸化网站,112年丝氨酸,导致增加C的分化转移2C12细胞向脂肪细胞(<一个href="#B61">61年]。这些结果表明平衡磷酸化站点可以赋予微分PPAR -γ行动。在我们长期缺氧条件下,尽管高架PPAR -γ蛋白质UCP-2保持抑制,可能由于PGC-1减少α/ RXR -α活动和尚未确定低氧诱导改变PPAR -γ磷酸化状态,因此活动。

此外,监管PPAR -γ通过SIRT1的发生。它最近被报道,SIRT1与转录辅阻遏物交互NCoR,负调节PPAR -γ在白色脂肪。这可以促进动员的脂肪酸,而不是积累,发生在抑郁SIRT1的情况下<一个href="#B43">43]。如果这样的途径发生在慢性缺氧肌肉,会同SIRT1活动下降,这种互动可以负责删除SIRT1抑制PPAR -γ增加,导致观察到的PPAR -γ蛋白质。此外,据报道,PPAR -γ产生一个负面反馈循环影响SIRT1 [<一个href="#B44">44]。因此,在缺氧,肌肉PPAR——的变化γ蛋白质和活动和持续抑制SIRT1的相互作用可能导致增加脂肪形成的产能在脂肪酸氧化状态。

4.4。复苏的低氧诱导减少氧化基因

增强肌肉的代谢活动通过使用PPAR -β/δ和PPAR -γ受体激动剂,已经成功地恢复骨骼线粒体监管和胰岛素敏感性(<一个href="#B13">13,<一个href="#B34">34]。此外,insulin-sensitizing影响多酚,白藜芦醇,通过调制SIRT1 / PGC-1α活动,一直强调是有益的解决方面代谢性疾病(<一个href="#B31">31日]。

PPAR -β/δ受体激动剂延缓体重增加和促进骨骼肌脂肪酸氧化和胰岛素敏感性<一个href="#B45">45]。在缺氧,L165,041治疗虽然PPAR -的目标基因的影响最小β/δ激活的地方。类似于16种肌细胞的研究中,C2C12UCP-2 PPAR -可能是一个额外的目标基因β/δ通过L165,041激活(<一个href="#B39">39)和缺氧的情况下,增加UCP-2 mRNA和蛋白( < 。 0 6 )的结果。这个响应的延续下维持缺氧还有待确定。

在缺氧罗格列酮治疗,另一方面,诱导强劲增加SIRT1 / PGC-1的成员α/ PPAR途径下1%的氧气,在21%或5%氧气的影响不大。这些变化导致增加目标CPT-1b和UCP-2 mRNA表达低于1%的氧气。Rosiglitazone-induced变化类似于缺氧下变化报道发生在拯救一个胰岛素抵抗状态与相关thiazolidinedione PGC-1吡格列酮,通过感应α活动(<一个href="#B13">13]。进一步说,这些数据表明,罗格列酮可能缺氧下以类似的方式报道在酒精性脂肪肝拯救胰岛素敏感性,通过增加药理SIRT1-AMPK信号的调制<一个href="#B62">62年]。

在正常氧氧化,5%和1%,与白藜芦醇SRIT1 mRNA表达增加,虽然蛋白质含量影响的时期。白藜芦醇专门增加SIRT1活动通过别构相互作用,导致增加SIRT1 NAD的亲和力+和乙酰化底物(<一个href="#B13">13,<一个href="#B48">48]。这可能促进一个提高效率的SIRT1在缺氧的目标基因激活通过增加CPT-1b UCP-2的转录和翻译。然而,有趣的是,PGC-1α信使rna并不像预期的恢复。根据微分目标基因活化,白藜芦醇的主要行动维护缺氧可能是促进脂肪酸氧化基因而非线粒体生物起源(选择<一个href="#B11">11,<一个href="#B31">31日]。在缺氧,先前表明,白藜芦醇抑制HIF-1促进复苏α活动和增加PPAR -α表达在氧气/葡萄糖剥夺神经元模型(<一个href="#B63">63年]。有趣的是,在1%的缺氧,白藜芦醇治疗促进增加C2C12RXR -α和PPAR -α信使rna。增加的可能机制可能是抑制hypoxia-mediated激活细胞外signal-regulated激酶1/2和Akt,导致HIF-1明显减少α,据报道,发生在白藜芦醇治疗癌症细胞(<一个href="#B64">64年,<一个href="#B65">65年]。虽然治疗低氧诱导改变PPAR激动剂和SIRT1调制器SIRT1 / PGC-1演示了改进α/ PPAR通路和脂肪酸氧化能力,进一步的工作是需要完全理解后的适应过程在持续缺氧或再氧化。

5。结论

我们目前的研究强调,监管机构的表达的肌肉氧化代谢减少氧张力下直接修改。总结,如图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2010/129173/fig9/" target="_blank">9和减少PPAR / RXR mRNA表达,低氧诱导HIF-1α活动损害RXR -α/ PPAR -αPGC-1转录α。结合低氧诱导PPAR -γ受损SIRT1翻译NAD和可能减少+可用性,SIRT1 PGC-1脱乙酰作用α减少了。此外,HIF-1α受损的PPAR -α/ RXR -αPGC-1αPPRE启动子下游SIRT1的变化/ PGC-1绑定结果α能力。结合改变PPAR / RXR交互,上述变化导致减少脂肪酸氧化基因表达的目标,如CPT-1b和UCP-2。有趣的是,在这些减少氧化条件下,看来低氧诱导的改变在一定程度上可以预防,在体外,通过药理干预(如L165,041,罗格列酮和白藜芦醇)。这些结果对理解产生影响选择性缺氧适应和它如何影响长期肌肉脂肪酸氧化代谢,最终的胰岛素敏感性。


图9
模型的缺氧诱导肌管脂肪酸氧化基因表达减少。低氧诱导HIF-1α导致受损RXR -α/ PPAR -α翻译PGC-1α,结合减少PPAR / RXR表达式(a)。进一步,PPAR -γSIRT1翻译和减少NAD受损+可用性,导致减少了SIRT1 PGC-1脱乙酰作用α和活动(b)。结合HIF-1成为可能α受损的PPAR -α/ RXR -αPPRE绑定和减少PPAR / RXR表达式,这进一步导致削减目标脂肪酸氧化基因表达如CPT-1b和UCP-2 (c)。在这些减少氧化条件下,看来低氧诱导的改变在一定程度上可以预防,在体外,通过PPAR -β/δ和- - - - - -γ受体激动剂和SIRT1调制器干预(虚线)。

确认

作者要感谢Drs b . de自由和l . Postovit慷慨援助的准备。这项工作是支持通过妇产科学系和Gynalecology,西安大略大学,学术浓缩基金2008/2009。方面,本文提出了在第56届科学会议上,在格拉斯哥Gyneaecology协会的调查,2009年3月,英国作为一个口头报告。