文摘

药物与血浆蛋白结合限制他们的自由和活跃的浓度,从而影响他们的药代动力学性质。血浆蛋白水平的物种差异复杂的种间药效学和毒理学效应的理解。mbx - 102酸/ JNJ39659100 PPAR -是一个小说受体激动剂在治疗2型糖尿病的发展。研究进行了评价血浆蛋白结合到mbx - 102酸和评估物种不同程度的免费药物。平衡透析研究表明mbx - 102酸高(> 98%)绑定到人类,老鼠和老鼠白蛋白和自由mbx - 102酸在啮齿动物比人血浆水平更高。种间的差异使用PPAR -免费药物水平进一步研究transactivation化验和新开发的PPAR -辅阻遏物位移(生化)测定。PPAR -transactivation和辅阻遏物位移mbx - 102酸在大鼠和小鼠血清高于人类的血清。这些结果证实了种间差异的相关性在自由mbx - 102酸水平。

1。介绍

mbx - 102 / JNJ39659100化合物在治疗2型糖尿病的发展。halofenate的它是一个单一对映体药物临床试验在1970年代作为降血脂药和hypouricemic代理(1- - - - - -6]。虽然为脂质降低,开发研究与halofenate糖尿病患者还演示了显著影响血浆葡萄糖和胰岛素在单一疗法(7,8),结合其他口服降糖药物9- - - - - -11]。二十年后,他们发现halofenate和mbx - 102 / JNJ39659100选择性部分PPAR -γ受体激动剂(12,13对其抗糖尿病的特性),从而提供了一个解释。

转化医学研究行动是重要的和安全的药物。研究动物允许介入程序不适合人类。解释这些研究的关键是理解药物活性的关系形式,(即。,免费的药物)的药效学影响每一物种的研究。

连接临床前药理学和安全性研究不同物种的人类经验可能因此需要了解药物的作用在目标从这些不同种类以及自由的关系、药物活性形式总这些物种中的药物浓度。

药物血清蛋白结合高这是特别重要的。高血清蛋白绑定似乎PPAR的共同特征γ受体激动剂罗格列酮、吡格列酮,和其他人14- - - - - -16),以前的数据表明,它也可能是一个功能halofenate [17,18),因此,也mbx - 102 / JNJ39659100。准确地确定自由水平的高血浆蛋白结合的药物在技术上具有挑战性,使这些药物对比物种极其困难的。结果报道,方法,允许用于对比老鼠,老鼠,和人血浆蛋白绑定。这允许适当的解释药理学和潜在的风险对人类mbx - 102 / JNJ39659100。这项研究提供了一个方法,可以应用于其他PPAR激动剂转化医学和安全评估。

2。材料和方法

(³H] mbx - 102酸(740 GBq /更易,20 Ci /更易)被Amersham合成生物科学(英国白金汉郡)。mbx - 102酸合成IRIX制药(美国SC佛罗伦萨)。mbx - 102酸的结构如图1完整的受体激动剂相比,罗格列酮和吡格列酮。放射性标记绑定研究混合的冰冻血浆从雄性sd大鼠中,cd -老鼠,或者人类从Bioreclamation购买,Inc .(美国纽约落后的地方)。竞争均衡的透析实验,新鲜混合的混合性别血浆从cd -鼠标,Sprague-Dawley老鼠,或者人类从Bioreclamation, Inc .(死气沉沉的地方,纽约)。人类、老鼠和老鼠血清白蛋白,和人类alpha-1-acid糖蛋白买来σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。木炭剥夺和delipidated血清从人类男性,cd -雄性老鼠,或者雄性sd雄性大鼠中购买从生物化学(美国弗吉尼亚州温彻斯特)。FDG (di -荧光素β-D-galactopyranoside)从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。Lanthascreen TR-FRET共激活剂测定γ- ppar装备和荧光标记NCOR肽(Fluor-DPASNLGLEDIIRKALMGSFDDK)从英杰公司购买(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。稳定如果试剂购买从Promega(美国威斯康星州麦迪逊)。DMEM培养基、Lipofectamine Optimem, Penicillin-Streptomycin从英杰公司购买(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。牛胰岛素、isobutylmethylxanthine和地塞米松买来σ(圣路易斯,密苏里州)。HEK 293 t细胞获得写明ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。从Cambrex Pro 293 -文化定义的媒体购买(美国,新泽西东卢瑟福)。

2.1。制定mbx - 102酸

放射性标记的mbx - 102酸制备1 50毫升乙醇溶液的浓度μ1米(mCi)。股票mbx - 102酸计量解决方案(最终浓度100倍)准备与无标号mbx - 102酸二甲亚砜(DMSO)和上升1μL /毫升(0.05μ米)的³H]标记mbx - 102酸,因此最后评估mbx - 102浓度酸共400名μ米、600μ米、1000μ米、1500μ米,2000μm .最后溶剂浓度总量的1%。

2.2。测定血浆蛋白结合的mbx - 102酸平衡透析

等离子体是储存在−20^°c使用之前,解冻和旋转约2000 rpm 5分钟删除任何沉淀物质。pH值调整pH值7.4,小心不₂阿宝₄。1毫升飙升血浆样本由直接稀释的³H] mbx - 102酸原液成等离子体,然后添加到一个平衡透析室的一侧。另一室是满1毫升的0.01米磷酸缓冲盐(PBS)。透析设备放置在一个浴缸在37岁^°在20 rpm C和旋转。初步研究表明,在5小时内达到平衡(数据没有显示)。一旦建立了平衡,细胞室被移除的内容,分析了液体闪烁计数。钱伯斯是取样一式三份。等离子体的非特异性结合,在没有确定为5.3 + /−3.9% (+ /−SD,的意思是复苏= 3)。³H] mbx - 102酸是一式三份取决于取样的透析室在每个mbx - 102酸的浓度。恢复被发现比例不随mbx - 102酸浓度。均值+ /−SD %恢复所有mbx - 102酸浓度为每一个物种都是83.9 + /−6.7%,84.4 + /−2.4%,2.6%和85.8 + /−人类,老鼠,分别和鼠标等离子体。

2.3。测定蛋白质绑定mbx - 102酸选择人血浆蛋白

股票的解决方案的人类血清白蛋白和alpha-1-acid糖蛋白在PBS缓冲准备。人类血清白蛋白(40毫克/毫升,~ 600μ和人类alpha-1-acid糖蛋白(22.5 M)μ米)上升了(³H] mbx - 102酸。飙升的蛋白质溶液(175μL)被添加到一个平衡透析室的一侧,和同等体积的PBS缓冲被添加到其他房间。透析被允许达到平衡和结合蛋白是由液体闪烁计数的样本参众两院如上所述。复苏的百分比³H] mbx - 102酸与血清蛋白在95.7%和98.5%之间。

2.4。mbx - 102测定酸结合白蛋白的表面等离子体共振(SPR)

绑定的表征mbx - 102酸对人类、老鼠,鼠白蛋白进行使用SPR-based生物传感器(生物传感器工具、盐湖城犹他州,美国)。分析方法用于评估mbx - 102酸对人体的绑定,老鼠,和鼠白蛋白前面描述的(19]。简而言之,每个白蛋白固定到CM5传感器芯片使用标准胺耦合。固定化密度是000至000年13俄文。系列测试化合物是运行在一个双重的稀释浓度最高的200μ每个16 m .不同浓度在重复测试。运行缓冲区包含53毫米Na₂HPO₄,12.5毫米KH₂阿宝₄70毫米氯化钠在pH值7.4,5% DMSO溶液。所有绑定数据收集37^°c .绑定响应mbx - 102在三个不同的酸的白蛋白表面是评估和高亲和性网站绑定常量使用two-independent-site模型决定的。转换从%如前所述执行绑定(19]。

2.5。确定物种的差异蛋白质绑定mbx - 102酸的竞争平衡透析

比较不同物种的等离子体的绑定是通过下面描述的方法本质上完成的。简单地说,(³H] mbx - 102酸血浆样品制定如上所述除了pH值没有调整到7.4,最后DMSO浓度为0.6%。1毫升的尖刺人血浆样本用于透析膜的一侧和1毫升的飙升动物等离子体应用于另一方。样品被旋转20 rpm透析120小时37^°C孵化器。免费药物的比例计算等离子体根据方程:比免费的药物(动物和人类)=(总在人血浆cpm) / (cpm在动物血浆总)。

2.6。细胞培养

HEK 293 t细胞(写明ATCC)培养subconfluence(约15厘米的盘子。细胞密度为14 000 /厘米²)在DMEM(高葡萄糖),10% (v / v)胎牛血清(的边后卫)和1% (v / v) Penicillin-Streptomycin补充。所有的细胞都维持在37岁^°C在湿润的气氛中8%的有限公司₂在空气中。

2.7。PPAR -γ报告基因分析

hek - 293 t细胞培养的如上所述。在使用之前,细胞使胰蛋白酶化使用0.25%胰蛋白酶/ 1毫米EDTA在DMEM resuspended, 10% (v / v)的边后卫缺乏Penicillin-Streptomycin。池足以供应100口井,600万个细胞被稀释到媒介9毫升的总量。2000年DNA-Lipofectamine混合物准备按照制造商的指示。池足以供应100井,5克加4-Mouse PPAR -γ小黑裙),5g pFR-Luciferase, 500 ng Lac-z质粒与40涨跌互现L 2000 Lipofectamine Optimem介质总量的1毫升。的细胞悬液混合1毫升DNA-Lipofectamine 2000混合物。混合物被镀成96孔板和孵化时间为4小时,转染中被删除,取而代之的是100年L DMEM, 10% (v / v)的边后卫和培养过夜。盘子的培养基被删除,取而代之的是50L Pro293A媒介。化合物和木炭剥离/ delipidated血清或血清白蛋白,或alpha -酸性糖蛋白股票的解决方案准备在2 x最终浓度Pro293A中、混合在一起之前的50L转染细胞和孵化的一个额外的24小时。测量荧光素酶和荧光活动执行根据制造商的指示。简单地说,媒体移除后,细胞在100年孵化10分钟μL Steady-Glo试剂。一个80L溶解产物整除被转移到不透明的白色盘子和发光测量。80年L整除又转回原板。荧光发射(励磁485海里,发射535海里)测量后的100年μL (10μ米迪-荧光素β在分析缓冲区(2.1毫米KH -D-galactopyranoside₂阿宝₄氯化钠,310.3毫米,5.9毫米Na₂HPO₄7小时₂MgSO O, 20毫米氯化钾2毫米₄,0.2% triton-X100)。每个实验条件评估一式四份。数据归一化对每个除以发光荧光测量的测量。剂量反应曲线生成和电子商务₅₀值计算使用棱镜Graphpad 5.1版。

2.8。Lanthascreen辅阻遏物位移分析

化验进行根据制造商的指示。简单地说,GST-PPARγ小黑裙(5海里),Tb-labeled anti-GST抗体(5海里),和fluorescent-peptide(125海里)被稀释在工具箱分析缓冲5毫米德勤和10信用证的这个解决方案添加到384 -黑色板块(合演,康宁公司生命科学,洛厄尔,质量,美国)。配体被准备为股票的解决方案在DMSO浓度100倍最后紧随其后的是稀释在装备试验2 x浓度缓冲与5毫米德勤包含2 x的血清白蛋白浓度或木炭剥夺/ delipidated血清前10L /试验板。板上覆盖和孵化4小时在室温下。时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)使用Pherastar荧光信号测量计数器(BMG labtech, Offenburg,德国)。受体的排放强度的比值(荧光素:λ= 520海里)除以捐赠者的排放强度(结核病:λ= 490海里)然后计算来确定NCOR绑定的程度。每测量一式四份。剂量反应曲线生成和集成电路₅₀值计算使用棱镜Graphpad 5.01版。

2.9。统计数据

比较logEC50(或logIC50),使用随机区组设计的方差分析模型。如果块效应(实验效果)并不重要,重新分析了减少方差分析模型的数据。图基的测试被用于多重比较(SAS)。差异被认为是重要的在一个值< . 05。

3所示。结果

3.1。种间蛋白质绑定mbx - 102酸

mbx - 102是一种选择性部分PPAR -γ调制器的结构不同于完整的PPAR -γ受体激动剂罗格列酮和吡格列酮(见图1)。为了理解免费药物之间的关系水平和选择性部分PPAR -的功效γ受体激动剂mbx - 102酸在不同物种中,等离子体mbx - 102酸测定的绑定属性。池,混杂性等离子体从人类,获得雄性sd大鼠中,cd -老鼠飙升mbx - 102酸和% mbx - 102酸结合蛋白是由平衡透析。数据表所示1表明mbx - 102酸99.5% - -100%会从人类血浆蛋白,老鼠和老鼠。绑定的高度观察也独立于mbx - 102酸浓度。识别潜在的mbx - 102酸结合蛋白在人类中,平衡绑定使用提纯人血清白蛋白和人类进行了研究α1-acid糖蛋白。高水平的mbx - 102酸绑定(> 98%)人类观察血清白蛋白。相比之下,人类α1-acid糖蛋白结合很低(< 5%)(数据未显示)。这些研究表明,选择性偏PPAR -γ兴奋剂mbx - 102酸是高度蛋白结合的等离子体在不同的物种和确定血清白蛋白蛋白质结合mbx - 102酸。

进一步描述mbx - 102酸白蛋白的绑定,我们使用表面等离子体共振(SPR),一种label-free技术,可用于提供信息的复杂形成药物动力学和亲和力是高度绑定到白蛋白(19,20.]。绑定常量(KD)和百分比为人类,小鼠,大鼠白蛋白被发表在表2。在完全赞同上面的研究报道中,mbx - 102酸结合白蛋白> 98%。这种高度蛋白结合杜绝任何进一步分析的微分绑定mbx - 102酸血浆蛋白跨物种因为绝对绑定不能准确的确定所使用的两种方法。因此,竞争均衡透析(CED)被用来解决不同的问题结合mbx - 102酸物种之间的血浆蛋白。清洁能源利用等离子体的两个物种之间的竞争透析准确地确定自由药物的比例分数在这些物种21]。使用这种技术,免费的比例分数负相关褶皱积累总量的药物在每个物种的等离子体等离子体平衡。rat-to-human的比率和mouse-to-human自由分数测定几个mbx - 102酸的浓度。数据表所示3表明自由mbx - 102酸在大鼠血浆是1.7到2.3折高于人类的等离子体和自由mbx - 102酸浓度在小鼠血浆比人类高出2.3到10.5折等离子体。有趣的是,rat-to-human和mouse-to-human免费药物比例被发现与总药物浓度降低可能是由于饱和软弱的人类结合蛋白结合位点。这些研究结果预测,以固定总药物mbx - 102酸水平,相对自由药物水平跨物种的顺序将鼠标>鼠>人类。

3.2。激活PPAR -γ免费的药物在人类血清的存在

发现部分PPAR -γ受体激动剂mbx - 102酸不同绑定到血浆蛋白跨物种表明自由水平,推定地负责药效学mbx - 102酸的影响,可能会导致一个不同的依赖药物总水平在不同的物种。为了充分解释的影响,不同层次的自由mbx - 102酸物种之间,必须确认免费药物受体负责行动和知道如果有任何内在PPAR -种间差异γmbx - 102酸的活性。PPAR -γ报告基因分析表明,没有内在差异的能力mbx - 102酸激活人类、老鼠,老鼠或PPAR -γ(数据没有显示)。理解的影响血清激活的PPAR -γ由mbx - 102酸的能力mbx - 102酸transactivate PPAR -γ确定细胞试验中增加的人类血清浓度的存在。如图2(一个),mbx - 102酸诱导PPAR -γ活动在没有血清剂量依赖性的方式。人类血清浓度的增加,有明显的和血清浓度的剂量反应曲线向右移mbx - 102酸。的褶皱变化意味着电子商务₅₀值相对于没有血清3,19岁,和交易量的2%,10%,和20%的人类血清,分别。在更高的人类血清浓度,降低窗口的激活从而排除分析血清浓度在20%以上。类似的研究进行完整的PPAR -γ受体激动剂罗格列酮和吡格列酮(见图2 (b)和2 (c))。两个化合物,作为mbx - 102酸被认为,一个向右的PPAR -的剂量反应曲线的转变γ激活是人类血清中观察到10%的存在而无血清。罗格列酮,有电子商务增加了14倍₅₀吡格列酮,增加电子商务有一个8倍₅₀。血清蛋白绑定PPAR -因此影响程度γ在细胞环境中可以激活受体激动剂。所有三个PPAR -进行类似的研究γ受体激动剂在人血清白蛋白。正如预期的那样,欧盟₅₀年代的激活PPAR -γ向右转在人类血清白蛋白的存在对所有三个PPAR -γ受体激动剂(见图3(一个),3 (b),3 (c))。血清白蛋白的浓度大于0.08%引起干涉记者分析从而排除分析更高和更多的生理相关白蛋白浓度的影响。为了进一步确认白蛋白效应的选择性,欧共体₅₀激活的PPAR -γ也评估α1-acid糖蛋白的存在。正如预料的那样,没有电子商务的转变₅₀发现即使在最高浓度的存在α1-acid糖蛋白测试(0.14%,数据未显示)。

3.3。微分激活PPAR -γ跨物种

的基础上发现mbx - 102酸不同绑定到血清蛋白质从人类,老鼠,老鼠,确认免费药物水平确定的能力mbx - 102酸激活PPAR -γ,它是预测mbx - 102酸应该不同激活PPAR -γ在不同物种的血清的存在。如图4,这种情况被发现。在10%的人类、老鼠或老鼠血清,mbx PPAR - - 102酸激活γ与电子商务₅₀260年代μ米、196μ米,170μM,分别。这些差异在电子商务₅₀被发现具有高度统计学意义。类似的研究也进行完整的PPAR -γ受体激动剂罗格列酮和吡格列酮。总结如表4,mbx - 102酸激活PPAR -γ以不同的方式影响相比,10%血清来自不同物种的存在与罗格列酮和吡格列酮的影响。mbx - 102酸,欧共体₅₀在老鼠和老鼠的存在比人类血清血清发生在低浓度,而观察罗格列酮和吡格列酮相反的效果,即需要更高浓度的老鼠和老鼠血清。这些数据表明,血清的微分效应PPAR -γ激活观察与mbx - 102酸是mbx - 102酸的属性,而不是血清蛋白质。

3.4。从PPAR -微分辅阻遏物位移γ跨物种

基于单元的PPAR -γ记者分析负面影响小鼠血清浓度大于10%从而排除跨物种微分分析血清绑定在血清浓度接近生理水平。另一种体外试验开发,允许更高的评估效果和生理有关血清浓度mbx - 102酸行动。图中所示的数据5证明肽来源于辅阻遏物NCOR由绑定到观察配体结合域PPAR -γ可以完全取代mbx - 102酸IC₅₀11μm .增加造成的人类血清浓度的剂量反应曲线向右移位导致19-fold IC的转变₅₀人类血清40%。差动位移的NCOR mbx - 102酸是评估在40%血清对人类,老鼠,和鼠标(见图6)。集成电路的褶皱变化₅₀human-to-rat血清和human-to-mouse血清4和7,分别。这些数据是非常一致的相对自由药物比预测的竞争平衡透析的研究。

4所示。讨论

本文提供的数据表明,mbx - 102 / JNJ39659100高度蛋白结合的,作为与halofenate已经被先前的研究表明,这至少一个mbx - 102酸结合蛋白是血清白蛋白。我们的目标是了解mbx - 102酸跨物种的血清绑定属性,并使用这些信息在解释跨物种药效学和毒理学效应。竞争均衡的使用透析研究成功证明mbx - 102酸确实是不同绑定到等离子体与人类紧密的绑定>鼠>鼠标。研究使用细胞PPAR -执行γ记者分析证实,至少定性,我们假设的药效学影响mbx - 102酸是由自由药物水平,进一步,微分绑定mbx - 102酸血清蛋白质的跨物种也导致一个可预测的药效学和高度可再生的影响。从这些研究中,绑定的顺序mbx - 102酸血清跨物种预计人类>鼠>鼠标,这是与来自清洁能源研究的数据协议。虽然我们观察到很好的定性相关性与记者化验和分析促成,EC的大小变化₅₀在记者分析小得多比看到CED化验。这些记者分析研究的一个限制是无法调查的影响血清浓度高于10%这可能解释定量观察这两个分析之间的差异。为此,我们开发了一个新的测量PPAR -试验γ活动在体外能够容忍血清浓度高达40%。数据从这个试验证实了预测新秩序的绑定mbx - 102酸跨物种的血清人类>鼠>鼠标和也提供了定量的褶皱变化分析促成非常相似。的基础微分绑定mbx - 102不同物种的血清白蛋白是未知的。虽然在蛋白质水平,老鼠和老鼠白蛋白是高度保守的同源性(~ 90%),保护的程度是人类和小鼠之间低得多(~ 72%)和人类和老鼠(~ 73%)。这种差异可能至少部分负责微分绑定之间观察到的物种。

这里描述的方法将通常用于解释临床前药理数据在不同物种以及毒理学研究和这些将如何与人类经验。虽然最初限于PPAR -γ的方法可以很容易地改编成PPAR -α和PPAR -δ事实上几乎任何其他ligand-modulated受体。