慢性阻塞性肺疾病患者血清IL-17水平及α-1抗胰蛋白酶PiZ等位基因检测

摘要

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种多因素疾病，其特点是气流受限，可由遗传因素引起，包括携带蛋白酶抑制剂（Pi）基因PiZ等位基因，编码α-1抗胰蛋白酶（A1AT）。纯合和杂合PiZ等位基因携带者均可发展为COPD。最近发现正常A1AT调节细胞因子水平，包括参与COPD进展的IL-17。本研究的目的是确定纯合或杂合PiZ等位基因携带是否导致COPD患者IL-17和其他促炎细胞因子水平升高。材料和方法。血清样品和临床数据是从44名COPD患者，谁包括6 PiZZ组，8合子PiMZ和30层皮姆A1AT表型的载体获得的。IL-17，IL-6，IL-8，IFN-γ的血清浓度γ和TNFα通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行测定。所有A1AT的表型是由窄的pH范围等电聚焦选择性A1AT染色验证。用于定量A1AT测量的比浊法。结果. 伴有PiZZ和PiMZ表型的COPD患者IL-17升高，IFN降低-γ与A1AT的PiMM表型患者相比的水平。此后，IL-17/IFN比值-γ在PiZZ组和PiMZ组大大超过了PiMM组的值。纯合PiZ等位基因携带者IL-6水平显著升高，IL-8水平显著降低，IL-6水平与A1AT浓度呈负相关。结论. 在纯合子和杂合子状态下，PiZ等位基因的存在与血清细胞因子水平的改变有关，包括IL-17、IL-17/IFN的升高-γ比率，和IL-6（仅PiZZ），但IFN较低-γ还有IL-8。

一。介绍

慢性阻塞性肺疾病(COPD)目前是世界第四大死亡原因，是慢性发病率和死亡率的主要原因[1]. 当前的病理生理学概念认为COPD是一种多因素背景的复杂疾病，是基于环境和遗传因素的相互作用[2]. 研究最多的COPD易感因素是α-1抗胰蛋白酶缺乏症（A1ATD），这是Pi基因（SERPINA1，蛋白酶抑制剂）致病等位基因携带的结果[3.]. 最常见和功能正常的A1AT等位基因是PiM，而最丰富和临床意义最大的病理等位基因是PiZ。约95%的临床表现为A1ATD是由PiZZ表型引起的[4]. 同时，杂合子PiMZ表型导致所谓的中间A1ATD[5]，并与慢性阻塞性肺病的风险增加有关，但主要是在不断吸烟者[6]. 蛋白酶/抗蛋白酶假说解释了肺气肿的发生是由于A1AT抑制中性粒细胞蛋白酶（主要是中性粒细胞弹性蛋白酶）的能力丧失[7]。近年来，多种免疫调节和抗炎A1AT功能被发现，除COPD外，还有多种肺和肺外病变与A1ATD相关。特别是，A1AT抑制了NF-kβ激活[8]，TNF-α减少了α表达式[9,10]，并调节TNF-α发信号[11]。此外，A1AT能够调节IL-1的产生β、IL-6及IL-8 [12]，并通过结合和灭活IL-8来降低中性粒细胞趋化性[13]。

气道中性粒细胞炎症被认为是COPD发病机制的核心，无论临床表型、疾病严重程度、肺功能下降速度和发病年龄如何[14]. 结果发现，促炎细胞因子IL-17在COPD进展中起着重要作用[15,16]。此促炎细胞因子是在COPD的急性期必不可少的，它介导COPD恶化和引发支气管高反应性[17和皮质类固醇抵抗[18]。吸烟患者表现出较高水平的IL-17 [15]。

IL-17是由17型T辅助细胞（Th17）产生的一种关键细胞因子，它将T细胞的活化与中性粒细胞的活化和活化联系在一起[19]。IL-17诱导组织炎症主要是通过刺激几种促炎细胞因子，包括表达IL-6，TNF-αα，白介素-1β，及IL-8 [20]。这导致了炎症病灶中性粒细胞的扩张和积累，例如，在吸烟引起的损伤中[21- - - - - -23]. Th17细胞亚群的形成是由转化生长因子（TGF-）引起的β以及IL-6的强制性存在[24]。IFN-抑制Th17的产生γ，是一种具有抗炎作用的促炎细胞因子，可能参与炎症的解决[24- - - - - -26]. IL-17/干扰素-γ比建议作为炎症性疾病的预后和严重程度[标记25,27]. 与IFN相比，A1AT还可以减少Th17细胞的形成，增加CD4+FoxP3+Treg细胞的数量-γ，刺激Th1的形成[28]。

因此，IL-17和A1AT都是参与COPD发病的重要分子，A1AT对IL-17分泌的调节作用已被证实。但纯合或杂合PiZ等位基因携带是否改变了COPD患者A1AT的免疫调节特性及对IL-17水平的影响尚不清楚。

本研究的目的是评估纯合子或杂合子PiZ等位基因携带是否会改变COPD患者IL-17和其他促炎细胞因子的水平。

2.材料和方法

收集44例COPD加重期男性患者的血清及临床资料。研究设计得到了当地大学伦理委员会的批准。所有研究患者均获得书面知情同意。这些患者包括14个PiZ等位基因携带者：6个PiZZ和8个PiMZ A1AT表型。其他30例患者的PiMM表型正常，作为对照组。所有患者的平均年龄 很多年了，他们中的大多数都是前吸烟者。他们都展示了FEV₁下降低于预测值的50%。

所有A1AT表型通过等电聚焦鉴定，在超薄琼脂糖凝胶中进行，含有0.9%琼脂糖IEF（美国GE Healthcare）、8.7%甘油（美国MP Biomedicals）和7.8%D-山梨醇（美国Sigma Aldrich）。通过向凝胶溶液中添加两性电解质（pH 4.2-4.9）（GE Healthcare，USA）产生狭窄的pH梯度，冷却至60°C。电泳分离采用Multiphor II电泳系统（Pharmacia Biotech，瑞典）。血清样品用3 μl治疗探头。预聚焦步骤设置在以下参数：450 V、30 mA、15 W和380 V/h。A1AT分子的聚焦在1050 V、28 mA、21 W和1700 V/h。分离完成后，蛋白质被转移到Hybond-C额外膜（GE Healthcare，（美国）在2 kg的压力下进行10分钟的western印迹。进一步的步骤包括在2.0%BCA溶液中通过膜培养进行阻断，在盐水缓冲液中洗涤，以及用辣根过氧化物酶结合的山羊抗人A1AT抗体进行选择性染色（Bethyl Laboratories，瑞典）。以3-氨基-9-乙基咔唑为显色底物，在过氧化氢存在下进行染色反应，观察所得免疫复合物。

用比浊商业试剂盒（Sentinel Diagnostics，意大利）对样品进行A1AT定量测量。血清IL-17、IL-6、IL-8、IFN浓度-γ和TNFα采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和商用试剂盒（OOOcitokin，俄罗斯）进行测定。

结果如下 四分位范围（IQR）。非参数数据用Kruskal-Wallis单因素方差分析进行比较。采用Dunn配对多重比较后测对各组进行比较。用Spearman秩相关检验评价各参数之间的相关性。两组之间的差异在值< 0.05。统计分析采用GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc.， version for Windows 6.01)进行。

3.结果

对以下COPD患者亚组进行了分析：6例PiZZ、8例PiMZ和30例PiMM表型携带者。慢性阻塞性肺病（COPD）患者的临床和实验室参数显示为PiZZ、PiMZ和PiMM表型1。

The median IL-17 level in patients with the PiZZ phenotype was 57.86 pg/ml (44.76-71.01 pg/ml), which was significantly higher than that in the normal PiMM phenotype: 1.44 pg/ml (1.24-1.81 pg/ml). The IL-17 level in PiMZ individuals was also elevated up to 82.39 pg/ml (37.87-121.8 pg/ml) ( ).图中显示了不同A1AT表型COPD患者IL-17水平的比较1。

相反，IFN的中位水平-γPiZZ组（15.52 pg/ml（1.57-62.34 pg/ml））和PiMZ组（15.98 pg/ml（5.67-22.0 pg/ml））均低于PiMM组（62.29 pg/ml（36.29-199.5 pg/ml））。

IFN的比较-γ图中显示了不同A1AT表型的COPD患者的水平2。

因此，IL-17的比率/ IFN-γ作为疾病严重程度的综合生物标志物。在PiZZ组和PiMZ组中，IL-17/IFN-γ比率超过皮姆组的值。中位数IL-17 /干扰素-γPiZZ显型患者的比值值为3.65(2.38-36.6)，显著高于正常的PiMM显型患者的比值值0.026(0.004-0.53)。IL-17 /干扰素-γPiMZ患者的比例也上升到6.81（3.68-26.9）。

IL-17/IFN的比较-γCOPD患者具有不同的表型A1AT比率呈现于图3.。

PiZZ患者的中位IL-6水平也升高到74.58 pg/ml（63.15-84.66 pg/ml），而PiMM患者的中位IL-6水平为47.0 pg/ml（27.42-73.28 pg/ml）。PiMZ组无明显升高（63.38 pg/ml（50.20-82.59 pg/ml）。图中显示了不同A1AT表型COPD患者IL-6水平的比较4。

相反，PiZZ（117.5 pg/ml（87.38-143.2 pg/ml））和PiMM（319.0 pg/ml（196.9-927.2 pg/ml））中位IL-8水平显著低于PiMM（319.0 pg/ml）。PiMZ患者IL-8的中位水平为162.8 pg/ml（142.8-231.7 pg/ml），无显著性差异。图中显示了不同A1AT表型COPD患者IL-8水平的比较5。

IL-17和IL-17/IFN-γ比率与A1AT浓度无关。

然而,干扰素,γ水平显示出与A1AT水平的直接相关性，而IL-6水平与A1AT浓度呈负相关。IL-8显示出与A1AT弱的正相关。A1AT浓度和促炎细胞因子水平之间的相关性分析的结果呈现在表2。

血清肿瘤坏死因子-α除两种PiZZ和PiMM表型载体外，所有个体水平均低于本试验的下限(1pg /ml)。

4.讨论

A1AT的免疫调节和组织保护特性在过去十年中被许多研究者描述。已经证明，PiZ等位基因携带减少了A1AT与中性粒细胞弹性蛋白酶和其他蛋白酶的粘附，导致肺泡表面活性物质、弹性蛋白和细胞外基质降解[29]。在免疫调节特性方面，也有报道称A1ATD的COPD患者有更高的TNF-α，IL-6，IL-1β和IL-8的产生相比，COPD患者无A1ATD [12,13,三十]。同时，我们没有发现任何关于IL-17和IFN-的数据γ慢性阻塞性肺病A1ATD患者与A1AT皮姆表型患者的比较。

本研究旨在研究PiZ等位基因携带是否影响COPD患者IL-17等促炎因子血清水平。对以下COPD患者组进行分析:6例PiZZ, 8例PiMZ, 30例PiMM A1AT表型携带者。PiZZ表现型患者年龄较轻，FEV较强₁/ FVC比值下降，导致更快的发展受阻。也有人指出，PiZZ组患者有较高的血红蛋白和红细胞压积值（ ),其指示因为在COPD的呼吸衰竭的继发性红细胞增多。患者，谁是合子PiMZ载体，展示略低A1AT水平和较低的FEV₁/与对照组相比，FVC比率。

慢性阻塞性肺病患者以及A1AT的PiZZ和PiMZ表型患者的IL-17血清水平显著升高，IFN-水平下降γ与皮姆患者比较。IL-17和IFN-γ是促炎细胞因子，但只有IFN-γγ也表现出一些抗炎性质[31]可能与炎症的解决有关。当炎症消退时，IFN的表达-γ虽然其他促炎细胞因子的表达显著下降，但仍维持在较高水平[26]. 这可能与Th17将IL-17转化为IFN的能力有关-γ(25]. 因此，我们计算了IL-17/IFN-γ比率，被一些研究者认为是炎症疾病进展的不利标志[25,27]. 在这项研究中，IL-17/IFN-γ纯合和杂合PiZ等位基因携带者的比例均显著升高。

PiZZ组IL-6水平明显高于PiMM组，但升高不明显。此外，IL-6与A1AT浓度呈负相关。这一发现证实了一个假说，即在炎症中A1AT负性调节IL-6的表达，而A1AT水平低则导致IL-6水平升高。IL-6是促炎细胞因子和急性期介质，对Th17的分化至关重要，IL-17的表达增加了IL-6的进一步合成[24]。此外，TNF-α与IL-6一起α被认为是系统性COPD效应（恶病质、骨骼肌功能障碍、心血管疾病、抑郁、乏力和骨质疏松）的介质，导致不良结果[32]。

纯合PiZ等位基因携带者血清IL-8水平低于PiMM表型携带者。然而，许多研究者报告PiZZ和PiMZ表型携带者痰中IL-8活性增加[13,三十]. 这种局部而非全身性IL-8浓度的升高可能是由于循环IL-17刺激IL-8的高消耗和局部气道产生所致[33]。

无法检测到的肿瘤坏死因子α在大多数研究患者中发现了这种水平。Vernooy等人也报告了类似的结果。谁提出了肺部和全身炎症的不同规律[34]。

5。结论

COPD患者纯合子和杂合子状态PiZ等位基因的存在可能影响A1AT的免疫调节特性，导致IL-17和IL-17/IFN-升高γ比和较低的IFN-γ。纯合的PIZ等位基因携带者也有了更高的IL-6水平，却降低IL-8。这些变化预测的不利结果，并可以识别用于治疗COPD患者新的潜在目标。

数据可用性

支持本研究结果的数据可根据要求从通信作者处获得。

的利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

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