逐渐增加的高机动组蛋白B1在肺部后急性特发性肺纤维化的恶化

文摘

急性恶化的发病机理的特发性肺纤维化(IPF)仍有待阐明。评估的角色在急性加重炎症介质,高流动性的浓度组蛋白B1 (HMGB1),急性肺损伤的主要中介,和18炎性细胞因子测定的支气管肺泡灌洗液,连续采样从7 IPF患者发病后急性恶化。HMGB1逐渐增加肺泡液体后急性恶化,在正相关与单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1),一个强有力的纤维发生的中介。8 IPF患者解剖后肺组织的急性恶化,激烈的HMGB1细胞质染色观察肺泡上皮细胞在肺泡毛细血管病变,增强毛细血管内皮细胞的显著减少thrombomodulin的表达,一种内在的HMGB1的拮抗剂。这些结果表明致病性角色HMGB1与MCP-1 IPF的急性恶化的后期阶段。

1。介绍

特发性肺纤维化(IPF)是一种最耐火材料的肺部疾病缺乏有效治疗(1]。不仅进步肺纤维化,而且急性恶化,定义为临床显著恶化的无法辨认的原因,是由于穷人生存患者(2]。IPF患者的肺部病理发现患有急性恶化,弥漫性肺泡损伤,,结果是一致的观察从各种原因(急性肺损伤后2),是最潜在特性通常的间质性肺炎。然而,IPF的急性恶化的病因尚未阐明。

高机动组蛋白B1 (HMGB1)最初被确定为核非组蛋白的蛋白质与dna结合域和涉及作为一种重要的内源性危险信号分子(3)以及中介系统性炎症后期在脓毒性休克4,5),因此有一个假定的角色在急性肺损伤的发病机制6,7]。此外,几项研究已经确定的变数寄存器域HMGB1作为重要的促炎HMGB1的性质,包括细胞因子释放(8,9]。释放HMGB1被动地由几乎所有细胞在细胞坏死细胞核和信号邻近细胞的持续伤害(5]。然而,HMGB1也分泌积极通过免疫细胞如单核细胞,巨噬细胞和树突细胞(4,10,11]。高级糖化受体的终端产品(愤怒)是第一个受体证明绑定HMGB1 [12愤怒,HMGB1信号通过发现促进趋化性细胞因子的生产过程中涉及到的激活转录因子核因子-κB (NF -κB) (13,14]。然而,HMGB1的贡献IPF发病急性恶化的尚未确定。

我们以前报道的异构重塑cd34多IPF患者的肺部肺泡毛细血管15]。肺泡毛细血管减少纤维损伤,但在nonfibrotic增加肺泡隔在纤维化病变,VEGF和引发,强有力的血管生成因子,增强[15]。自从VEGF也是一种有效的血管通透性诱导物(16),这些毛细血管密度病变nonfibrotic肺泡隔被认为是漏水的,因此容易引发的肺泡浸润炎症介质在急性肺损伤17]。thrombomodulin我们也感兴趣,一个内皮抗凝代数余子式,肺泡毛细血管中高度表达在正常控制肺但少所以在IPF肺(15]。这是因为thrombomodulin结合HMGB1的n端结构域,以防止其与愤怒,从而抑制促炎的感应事件(18]。

在这种背景下,我们调查了支气管肺泡灌洗液连续采样后从IPF患者急性恶化,以及肺组织标本,活检,从稳定的IPF患者和解剖IPF患者死于急性恶化,探讨炎症介质参与急性恶化IPF的发病机理。

2。材料和方法

临床样本
被诊断为急性恶化的特发性肺纤维化诊断标准根据日本成立于2004年(19),本质上是与标准兼容的特发性肺纤维化的临床研究网络调查在2007年(2]。支气管肺泡灌洗液是采样Tosei总医院后七IPF患者从急性恶化的两到四个实例每个病人,以便诊断排除感染,和样本存储在−80°C度。十稳定IPF患者的手术活检,和八IPF患者的解剖肺急性恶化去世后,获得东北大学医院。无病肺组织解剖从三个病人没有任何慢性肺疾病也检查控制。这些肺组织固定在10%的缓冲福尔马林和嵌入石蜡。从患者获得书面知情同意使用这些临床样本被东北大学的伦理委员会批准。

HMGB1测量和细胞因子
HMGB1在BALF高度敏感和特定的ELISA测定方法(Shino-test、神奈川、日本)20.],先前报道[6,7]。总之,黑人聚苯乙烯微量滴定板(康宁实验室科学、康宁、纽约)被涂上一层anti-HMGB1磷酸盐(PBS)多克隆抗体,与PBS含有0.05% Tween-20洗3次,被PBS - 1%牛血清白蛋白为2小时。洗后,100μl 8稀释的标准和样品,1:1稀释0.2 mol / l三羟甲基氨基甲烷(pH值6.5)液,0.15 mol / l氯化钠含有1% BSA被添加到井和孵化24小时在室温下。洗后,反人类的HMGB1 peroxidase-conjugated单克隆抗体增加,孵化在室温下30分钟。另一个洗涤步骤后,PS-atto (Lumigen,位于MI)补充道,和它的发光测量9000 d微型板块发光读者(DIA-IATRON、东京、日本)。17这些BALF中细胞因子的浓度样本,包括白介素(IL) 1β2、il - 4 IL-5, il - 6, IL-7,引发,il - 10, IL-13, IL-17,粒细胞集落刺激因子(g - csf)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(gm - csf)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1β干扰素(IFN)γ和肿瘤坏死因子(TNF -α),确定使用Bio-Plex (Bio-Rad实验室Inc .)后,制造商的协议。总TGF -β1 BALF样品也用产生的酶免疫测定(EIA) MBC实验室、公司(日本东京)。

病毒隔离
每个BALF样本由微型板块受到病毒隔离方法(21]病毒研究中心在全国医院组织(仙台日本)。简而言之,标本是放置在传输介质组成的鹰的最低基本培养基(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)有0.5%的明胶含500单位/毫升的青霉素G和500毫克/毫升的链霉素,离心机在4°C 4000克,持续15分钟。浮在表面的分数是人类胚胎成纤维细胞接种到培养细胞,使用细胞系,HEp-2;维罗;HMV-II、MDCK LLC-MK2细胞,可以支持很多病毒的生长,包括呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒病毒、肠道病毒、腺病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、鼻病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、人类冠状病毒229 e,和人类metapneumovirus。接种后,细胞病变效应进行连续两周,每天,此外,当没有发现CPE,盲人通过另一个两个星期进行一次同样的系统。rt - pcr也表现了人类metapneumovirus病毒隔离(22]。

免疫组织化学
组织部分3μ米厚度deparaffinized和治疗peroxidase-blocking试剂(DAKO Carpinteria, CA) 10分钟前在室温下孵化与主抗体。抗体和本研究中使用的最佳稀释如下:人类HMGB1单克隆抗体(1:3000年,Shino-test),相同的抗体用于ELISA,愤怒(MAB5328, 1: 50, CHEMICON国际公司,泰梅库拉,CA), thrombomodulin (TM1009 1: 100年,DAKO有限公司,斯特鲁普,丹麦),CD34 (4 a1, 1: 100年,Nichirei有限公司东京,日本),和反人类的血管性血友病因子(vWF)单克隆抗体(F8/86, 1: 1000年,Nichirei)。组织孵化了一个主要的抗体在潮湿室在4°C的过夜,进一步反应聚合物试剂(ENVISON设备;DAKO Carpinteria, CA)在室温下为60分钟。双重免疫组织化学染色的抗原抗体复合物与矢量可视化红(向量实验室,伯林盖姆,CA)或1毫米3.3′-diaminobenzidine (DAB),如前所述[15]。

的形态学评价
分布面积的百分比的细胞免疫反应性的thrombomodulin那些对CD34免疫反应性的估计来自30个随机选择的彩色图像的放大400在每种情况下使用数字图像分析系统(流明愿景,Mitani公司,福井县,日本)。

统计分析
两个未配对样本,分析的非参数Mann-WhitneyU测试使用。被定义为一个重要的区别。所有的值被表示为±SEM手段。

3所示。结果

3.1。BALF中细胞因子在急性恶化

的支气管肺泡灌洗液(BALF)在这项研究中,我们检查后连续采样两到四次从每个IPF患者急性加重()。尽管所有这些患者接受类固醇治疗后急性恶化的诊断(第一天),这些患者机械通气治疗。我们测量HMGB1的浓度和另外18名炎性细胞因子,il - 1组成β2、il - 4 IL-5, il - 6, IL-7,引发,il - 10, IL-13, IL-17, g - csf, MCP-1, gm - csf, MIP-1β干扰素-γ肿瘤坏死因子-α,TGF−β。这七个病人的发现在两个(数字1(一)和1 (b))。尽管BALF中HMGB1的浓度很低的早期阶段急性恶化,HMGB1,和MCP-1继续增加甚至在类固醇治疗。汇集数据(16 7例)样本BALF中HMGB1浓度的这七个病人还透露HMGB1急性恶化后的逐渐增加(图1 (c))。在这些BALF中炎性细胞因子检查样品,只有MCP-1 HMGB1的正相关(增加数据1(一)和1 (d))。

我们尝试在病毒隔离BALF标本采样急性恶化后没有发现任何常见的致病细菌或病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒病毒、肠道病毒、腺病毒、鼻病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、冠状病毒、腮腺炎病毒、或metapneumovirus(数据没有显示)。

3.2。HMGB1产生肺组织细胞

HMGB1在肺组织的免疫组织化学表现18 IPF患者两组之间的比较:患者的解剖肺组织8个病人死于急性恶化后的手术活检肺组织十IPF患者稳定。在解剖肺组织,强烈的胞质染色观察HMGB1在大多数的肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞有或没有核染色(图2(一个))。双免疫染色HMGB1及CD34标记肺泡毛细血管内皮细胞(15),清楚地揭示了这些细胞的分布,强烈表达HMGB1附近没有明显纤维化的毛细管增强肺泡隔(数字2 (b)和2 (c))。相比之下,只有核染色观察HMGB1外科肺活检的患者稳定的IPF(图2 (d))。

HMGB1的平均比例的细胞免疫反应性的%(平均±SEM)解剖肺组织的IPF患者急性恶化后(图3)。在稳定的IPF患者的手术活检,%的细胞阳性HMGB1与尸检相比没有显著差异();然而,大多数的这些细胞HMGB1免疫反应性的手术活检展出核染色(图2 (d))一起罕见的胞质染色(%)明显不同与核染色尸检的比例(%,)(图3)。

3.3。表达MCP-1、愤怒和Thrombomodulin

细胞免疫反应性的HMGB1的分布与MCP-1和愤怒,HMGB1的主要受体之一,IPF患者的尸检肺组织和急性恶化。细胞生产MCP-1恰逢细胞胞质HMGB1表达(数字4(一)和4 (b)),而强烈的愤怒的表达主要是观察在上皮细胞和毛细血管内皮细胞在较小程度上(数据4 (c)和4 (d))。

的肺泡毛细血管对CD34免疫反应性的表达式(图5(一个))和thrombomodulin(图5 (b))被显示在连续的部分典型案例的手术活检。thrombomodulin几乎总是持续的免疫反应性cd34多肺泡毛细血管。相比之下,内皮表达thrombomodulin显然是减少在IPF患者的解剖肺组织的急性恶化(数字5 (c)和5 (d))。使用数字图像分析仪系统的形态学分析清楚地揭示了免疫反应性的降低thrombomodulin相比CD34 IPF患者死亡后解剖肺组织的急性加重(%,与控制(相比)%,),甚至与活检,从稳定的IPF患者肺组织(%,)。没有发现显著差异之间的稳定的IPF患者和正常对照组thrombomodulin反应对CD34(图5 (e))。

4所示。讨论

这是第一次报告的一个持续的海拔HMGB1和MCP-1后急性恶化的IPF患者的肺。这两种介质是由肺泡巨噬细胞和肺泡II型上皮细胞分布于capillary-increased肺泡毛细血管内皮细胞的损伤表现出减少thrombomodulin的表达,一种内在的拮抗剂HMGB1的18]。

HMGB1的逐渐增加,支气管肺泡灌洗液后急性恶化表明几个似是而非的IPF发病急性恶化的角色。HMGB1的角色之一是作为一个中介急性恶化,因为HMGB1的浓度很低的初始发病急性恶化。虽然未发现病原微生物或病毒在支气管肺泡灌洗液体检查在这项研究中,所有的这些患者流感样症状的发病前几天急性恶化,从而导致暴发性的炎症触发效果类似于急性肺损伤。HMGB1的逐渐增加在肺上皮衬里液体初始发病后肺损伤也报道,无论是在实验和临床急性肺损伤(6]。虽然可以通过巨噬细胞释放HMGB1在应对病毒感染(23],HMGB1的逐渐增加观察到在这项研究中被认为是被动释放坏死引起的肺泡II型上皮细胞(5),由肺泡巨噬细胞主动分泌TNFαil - 1,干扰素γ,没有证明分子机制(氧化应激24- - - - - -26]。这是因为HMGB1增加没有致命的病毒,因为HMGB1的胞质染色在这些细胞急性恶化后显著增加。

与促进作用严重的炎症,HMGB1报道促进组织修复和再生27]。重要的是,HMGB1诱导干细胞的迁移对发炎的地区促进修复和再生(28]。例如,在平滑肌细胞,HMGB1诱导增殖和细胞结构快速变化,导致细胞迁移(29日,30.]。有趣的是,许多这样的恢复效应是通过相同的受体介导的(例如,愤怒)调解的促炎属性分子(29日]。考虑最近的一份报告中,愤怒的损失导致肺纤维化(31日),HMGB1的增加肺泡液体本身可能通过其他诱导纤维形成HMGB1受体,如toll样受体家族(通常),TLR4、TLR2或TLR9识别(32,33]。MCP-1逐渐增加的正相关与HMGB1在肺泡液体后急性恶化也可能导致fibroproliferation [34,35),这被认为是参与HMGB1的再生效果。当然,我们不能否认这一点治疗的合理性,包括类固醇治疗,这些患者在医院后急性恶化可能会影响HMGB1的逐渐增加。此外,HMGB1的浓度的相关性和/或MCP-1急性恶化的疾病严重程度的BALF IPF已经离开的期望。

我们观察到的细胞胞质表达HMGB1分布在肺泡毛细血管病变增强[15)中内皮细胞显示减少thrombomodulin的表达,一种内在的拮抗剂HMGB1的18),后急性恶化。正如我们之前的报道,尽管中性粒细胞可以在急性肺损伤(HMGB1的起源7),除了肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞,毛细血管旁边HMGB1的浓度应该升高。这些毛细管增强病变IPF患者易患急性肺损伤,不仅因为这些毛细血管减少对抗HMGB1还因为VEGF的能力,这是提高(增强)这些病变(15),放松促使内皮细胞紧密连接的泄漏(36,37]。thrombomodulin的表达减少,这是一种抗凝剂(38),可能在这些毛细管增强病变容易诱发凝血,这经常发生在急性恶化IPF患者(39]。

我们从这些结果得出HMGB1 MCP-1增加肺的IPF患者急性恶化后,肺泡毛细血管病变增强thrombomodulin的表达减少,HMGB1的内在抑制剂,可能会加剧肺泡损伤和纤维发生。

确认

这项工作是支持的科研补助金日本促进社会科学(没有。22390164 m . Ebina)和由格兰特弥漫性肺部疾病研究小组来自卫生部、劳动和福利的日本政府(m . Ebina)。

引用

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