文摘

帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病,和机制PD发病机制并不完全理解。越来越多的证据表明,小分子核糖核酸(microrna) PD的发病机制中发挥重要的监管作用。本研究旨在探讨PD miRNA-mRNA监管网络。microrna(黛米)和基因表达的差异(度)之间的PD患者和健康的捐赠者GSE16658 microrna的数据集的筛选和信使rna从基因表达数据集GSE100054下载综合(GEO)数据库。选择目标基因的黛米时预测的三个或四个在线数据库和重叠GSE100054度。基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)通路富集分析为注释,然后由数据库可视化和综合发现(大卫)和Metascape分析工具。之间的关联筛选基因和PD与在线工具评估比较Toxicogenomics数据库(CTD)和蛋白质交互(PPI)网络平台建造的字符串。我们进一步研究了基因的表达在miRNA-mRNA监管网络从PD患者和健康的捐赠者通过收集血液样本中存在。我们确认1505调节和1302度使之抑制,和77年调节和112年下调黛米从GEO数据库初步筛选。进一步进行功能富集分析确定10透析相关中心的基因,包括RAC1、IRS2 LEPR、PPARGC1A CAMKK2, RAB10, RAB13, RAB27B RAB11A,JAK2,这主要是参与Rab蛋白信号转导,AMPK信号通路,并通过瘦素信号。miRNA-mRNA监管网络基因,然后采用10中心及其交互microrna与黛米重叠,包括miR-30e-5p, mir - 142 - 3 - p, mir - 101 - 3 - p, miR-32-3p, mir - 508 - 5 - p, mir - 642 A - 5 - p, miR-19a-3p, miR-21-5p。分析临床样本验证的重要upregulationLEPR的差别,对这些mir - 101 - 3 - p和miR-30e-5p PD患者与健康的捐赠者。因此,miRNA-mRNA监管网络最初构造和有潜力为PD的发病机制和治疗提供新的见解。

1。介绍

帕金森病(PD),全球第二最常见的神经退行性疾病,特点是逐步退化在黑质致密部多巴胺(DA)神经元(SNpc) [1,2]。据估计,大约两个1000所有年龄段的人最终会遭受这种疾病(3,4]。PD的发病机制涉及多个系统的复杂故障,通过运动障碍,以及其他nonmotor症状(3]。帕金森病的运动症状包括震动特点(手,胳膊,腿,下巴,或者头),刚度(四肢和躯干),动作迟缓(运动),和姿势不稳定(3,5,6]。帕金森病是一种慢性进行性疾病,这表明它存在和恶化随着时间的推移4,7]。遗传似乎在PD的发病机制中发挥作用,因为遗传因素,包括杂合的GBA突变、a-synuclein变异和τ变体(3,8,9),发生在多达5%到10%的PD患者(10]。环境因素,例如吸烟和酒精,也参与了PD的发病机制(3]。然而,精确的机制PD并不完全理解。最近,表观遗传调控,如小分子核糖核酸(microrna),已经成为一种很有前途的PD病理因素(11,12]。

miRNA-short,单链RNA组成的20 - 25 nucleotides-belongs非编码RNA的家庭,不翻译任何蛋白(13]。microrna与3′未翻译区(3′utr)的mRNA,扰乱翻译或加速信使rna降解[14]。在过去的几十年中,它已经表明,microrna参与多种疾病的发病机制通过调节多种生理过程,如细胞增殖、分化和细胞凋亡15]。最近的研究表明microrna在PD发病机制的参与12]。例如,mir - 124,负责监管NF -κB, STAT3, AMPK和ERK信号和随后的细胞凋亡、自噬、氧化损伤、神经炎症,据报道是一个潜在的诊断和治疗PD的生物标志物16]。吴等人涉及几个microrna,包括miR-30 let-7, mir - 485,与PD发病机理(12]。这项研究强调了有前途的microrna的治疗帕金森病的治疗作用。

在过去的十年中,生物信息学分析的发展不仅允许评估与疾病相关的遗传和表观遗传调控途径,但也为战略旨在提供证据有效的诊断和治疗疾病的17,18]。在最近的研究中,我们采用了集成的生物信息学方法分析microrna的信使rna从基因表达数据集收集综合(GEO)数据库。从这一分析,我们构建了一个与PD发病机制相关的潜在miRNA-mRNA监管网络。我们验证这miRNA-mRNA监管网络的作用在PD评估这条通路的表达在血液样本收集的PD患者和健康的捐赠者通过定量实时PCR(存在)。我们的工作提供了新的见解的致病机制和治疗帕金森病。

2。材料和方法

2.1。临床样本

外周血样本收集来自23个PD患者和26个健康的捐赠者heparin-covered管,严格遵循协议和预防措施。所有PD患者诊断根据社会运动障碍诊断标准在2015年提出(19),Hoehn和Yahr 2到4阶段。所有的健康的捐赠者是年龄,准确性和免费的疾病,如痴呆、风湿病、肿瘤。所有试验程序进行了指导方针经伦理委员会批准后,中国人民解放军总医院,北京,中国。所有PD患者和健康的捐赠者提供的书面知情同意。捐赠者是补充表中列出的信息1。

2.2。PBMCs隔离

PBMCs(外周血单核细胞)被孤立Ficoll-Paque + (Haoyang科技、天津、中国)离心肝素化的血迹。红细胞完全隔离在这个孤立的过程。隔离PBMCs所需的时间为1 - 2小时的主题,和样本中存在分析冻结在−80°C。

2.3。中存在

从孤立PBMCs总RNA提取试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)后,制造商的协议。存在是通过快速SYBR®绿色主人混合散装(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。小内源性核U6核内小rna和GAPDH被用作内部控制规范化的microrna mrna,分别。(2基因表达水平进行了计算−ΔΔCt)方法。在这项研究中使用的意义和反义引物如下:GAPDH:意义,5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,反义5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′U6:意义,5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反义,5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′LEPR:意义,5′-TGGGATTAGGTGGGATTT-3′,反义5′-CCGCTCCTACCAATCTAA-3′IRS2:意义,5′TTGACTTCTTGTCCCACCACTTG应承担的3′,应承担的反义,5′必经GCTGAG CGTCTTCTTTTAATGATACT 3′JAK2:意义,5′-TCTGGGGAGTATGTTGCAGAA-3′,反义5′-AGACATGGTTGGGTGGATACC-3′miR-30e-5p:意义,5′-GGGTGTAAACATCCTTGAC-3′,反义5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′mir - 101 - 3 - p:意义,5′-GCCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3′,反义5′-AATTGAAAAAAGTGATTTAATTT-3′

2.4。微阵列数据

GSE16658 miRNA-expressing数据集和数据集mRNA-expressing GSE100054从网上下载GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。所有收集的样本PBMCs PD患者和健康的捐赠者。GSE16658数据集由32个样本,其中19个来自PD患者和13是来自健康的捐赠者。GSE100054数据集包含19个样本,包括10从PD患者和9健康的捐赠者。GSE16658和GSE100054数据集被人类v2 MicroRNA表达BeadChip Illumina公司平台和Illumina公司HumanHT-12 V3.0表达式BeadChip平台(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国),分别。

2.5。识别差异表达基因(度)和microrna(黛米)

为了获得差异表达基因(度)和microrna(黛米)从PD患者和健康的控制,原始数据从GSE16658 GSE100054 GEO2R数据集进行分析,一个GEO-provided分析工具。的| log2FC |≥1和 介绍了截止条件。度和黛米被火山可视化情节。

2.6。预测的microrna的目标

目标选择的调节和表达下调黛米从GSE16658预测四个在线数据库,包括miRDB (https://mirdb.org/miRDB/index.html),TargetScan (https://targetscan.org/vert_72/),miRWalk (https://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/),miRTarBase数据库(https://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw)。的目标,同时预测了至少三个数据库和重叠度从GSE100054,选择深造。

2.7。miRNA-mRNA监管网络建设

miRNA-mRNA监管网络成立和可视化Cytoscape版本3.7.2章软件(https://www.cytoscape.org/)[20.使用选定的microrna和重叠的目标基因。

2.8。功能富集分析

我们进行基因本体论(去)分析(生物过程、分子功能,细胞组件)和京都基因和基因组的百科全书(KEGG)分析识别的生物功能和预测目标基因的途径丰富黛米。使用在线功能富集分析是由生物信息学工具,数据库的注释,可视化和综合发现(大卫,https://david.ncifcrf.gov/)。与调整 值< 0.05。

丰富的功能方面也由Metascape在线分析工具(https://metascape.org/gp/index.html /主/步骤1)基于几个数据库,比如,KEGG Reactome,乔鲁姆。前20名丰富条款可视化作为浓缩条形图。

2.9。比较Toxicogenomics数据库(CTD)

筛选基因之间的相关性和PD被在线工具供评估(https://ctdbase.org/)、得分和显示为条形图。

2.10。蛋白质相互作用网络(PPI)

(PPI)蛋白质相互作用网络的在线平台搜索工具是由交互检索基因(字符串,https://string-db.org/)(11.0版)(21]分析目标基因的黛米的连接。相互作用对信心得分≥0.4被Cytoscape保存和可视化软件(20.]。

2.11。统计分析

数据被当作平均值±标准偏差(SD)。学生的t以及和单向方差分析被用来评估两组之间的差异和多个组,分别。 被认为是统计阈值。

3所示。结果

3.1。度和黛米在PD的识别

为了确定关键基因和microrna参与帕金森病的进展,我们分析了PBMC信使rna样本数据集GSE100054 GSE16658和microrna的数据集。我们获得1505显著调节度和1302度使之抑制在PD患者比健康的捐助者(图1(一))。此外,77调节黛米和112下调黛米在PD患者(图确定1 (b)),其中十大(表被选中作进一步分析1)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
之间的识别度和黛米PD患者和健康对照组。(a)火山块1505调节度和1302度使之抑制PD患者(a)和77年调节黛米和112年下调黛米被确定在PD患者(b)与对照组相比。 作为一个阈值。蓝点代表调节基因或microrna,红点显示调节的,和灰色的点代表没有意义。横坐标轴代表log2 | |褶皱变化,和纵轴代表−log10 | ( )值|。
3.2。目标预测的黛米

确定十大黛米后,我们试图确定他们的目标基因。四个在线工具,即,miRDB TargetScan, miRWalk,和miRTarBase数据库,利用预测的潜在目标。预测的目标基因的调节黛米至少三个数据库被重叠的表达下调GSE100054数据集的度,以及这些重叠之间的共享基因进一步选择建立一个潜在的监管网络(图2(一个))。类似的筛选进行下调黛米和调节度(图2 (b))。这种分析提供了一个初步筛查PD的预后miRNA-mRNA监管网络。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
microrna的目标预测和选择。每个microrna的目标预测进行了使用miRDB TargetScan, miRWalk, miRTarBase数据库。(a)的目标基因调节黛米一般预测的3和4的数据库,同时重叠度使之抑制GSE100054数据集选择构建监管网络。(b)的监管网络表达下调黛米和目标基因选自调节之间的重叠度GSE100054数据集和预测目标的3和4的数据库。
表1
10个调节microrna和10个表达下调microrna在GSE16658数据集筛选。
3.3。功能富集分析PD的度

为了优化的关键基因和microrna与PD的发展有关,我们进行功能富集分析筛选重要的生物过程和信号通路和选择的基因参与这些过程。我们首先介绍了两个生物信息学工具,大卫和Metascape数据库,进行功能富集分析预测目标的黛米(上面提到的图2)。如图3从大卫数据库,结果揭示了代表去计算,其中包括生物过程(图3(一个)(图),细胞组件3 (b))和KEGG信号通路(图3 (c))。通过执行另一个浓缩分析Metascape网站透露的重要功能流程的基础上,KEGG, Reactome,和乔鲁姆数据库,和前20项的条形图(图所示3 (d))。

(一)
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(b)
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(c)
(c)
(d)
(d)
图3
通过大卫和Metascape数据库功能富集分析。去分析目标基因的黛米,和最重要的是丰富了生物过程(a)和分子功能条款(b)作为酒吧图表。KEGG信号通路富集目标基因的黛米(c),丰富目标基因的功能方面丰富了黛米测定Metascape在线分析工具基于等数据库,KEGG Reactome,乔鲁姆。前20名丰富条款可视化作为浓缩条形图(d)。

随后,我们优化透析相关条款从大卫和Metascape浓缩的结果分析通过搜索每一项一起“帕金森”一词在PubMed网站上。列在表2为进一步分析,确定了四项,包括Rab GTPase绑定,AMPK信号通路,Rab蛋白信号转导,并通过瘦素信号。

表2
四项与帕金森病有关。
3.4。选择中心PD发病相关的基因

在基因选择的四个功能项,10以前在PD的研究报道,包括RAC1、IRS2 LEPR、PPARGC1A CAMKK2, RAB10, RAB13, RAB27B RAB11A,JAK2。确认他们在PD的功能角色,我们使用数据库,供确认通过评估疾病与神经系统疾病的相关性得分。基因与PD得分> 20被确定为显著相关基因和标记为橙色酒吧在图4。在这10个基因,JAK2(图4(一)),CAMKK2(图4 (b)),RAB27B(图4 (c)),LEPR(图4 (d)),RAC1(图4 (e)),IRS2(图4 (f)),PPARGC1A(图4 (g))得分为22.71,24.17,27.91,32.18,34.51,42.85,和81.08,分别和透析相关基因被认为是至关重要的。RAB10, RAB13,RAB11A被排除在外,由于他们的低分数(补充图吗1)。

(一)
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(b)
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(c)
(c)
(d)
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(e)
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(f)
(f)
(g)
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图4
帕金森病得分取决于CTD。PD的起源和之间的相关性JAK2(一),CAMKK2(b),RAB27B(c),LEPR(d),RAC1(e),IRS2(f)PPARGC1A(g)是由在线评估的工具比较Toxicogenomics数据库(CTD),得分,显示为条形图。

确认中心与帕金森病相关的基因,我们还建立了一个基于PPI网络的目标基因黛米。有趣的是,PPI网络显示的四个七CTD-selected基因,JAK2 IRS2, LEPR,和PPARGC1A密切相关,表明PD开发(图中潜在的监管职能5)。


图5
PPI网络的建设。蛋白质相互作用(PPI)通过搜索网络构建工具检索Cytoscape基因(STRING)和可视化交互的软件。信心得分≥0.4被认为是标准。
3.5。确定和验证的关键miRNA-mRNA监管网络在临床PD样本

基于上述筛选和选择,我们终于建造了一个简化miRNA-mRNA监管网络组成的10透析相关基因及其交互microrna选择从黛米(图6),包括miR-30e-5p, mir - 142 - 3 - p, mir - 101 - 3 - p, miR-32-3p, mir - 508 - 5 - p, mir - 642 a - 5 - p, miR-19a-3p, miR-21-5p。我们下一个收集PD患者和健康的捐赠者的血液样本检查中心基因的表达及其相互作用的microrna。中心之间的基因及其相互作用的microrna的信使rna水平IRS2 LEPR,和JAK2调节,mir - 101 - 3 - p的表达和miR-30e-5p PD患者的表达下调。的变化LEPR、miR-30e-5p和mir - 101 - 3(图- p在统计学上不同7)。


图6
优化miRNA-mRNA监管网络。监管网络由10个优化基因,JAK2、CAMKK2 RAB27B、LEPR RAC1 IRS2,PPARGC1A及其对应的microrna miR-30e-5p, mir - 142 - 3 - p, mir - 101 - 3 - p, miR-32-3p, mir - 508 - 5 - p, mir - 642 a - 5 - p, miR-19a-3p, miR-21-5p。

图7
评估在临床PD miRNA-mRNA监管网络的样本。实时PCR进行检查miR-30e-5p的RNA水平,mir - 101 - 3 - p,JAK2, LEPR,IRS2在23 PD患者的外周血样本和26个健康的捐赠者。 , ,和 与控制(CON)。

4所示。讨论

帕金森病是一种常见的与年龄相关的神经退行性疾病的特点是进步在黑质致密部多巴胺能神经元的变性(SNpc) [3,22]。虽然机制PD发病机理仍然知之甚少(1,4),相信PD遗传和环境之间复杂的相互作用的结果影响因素众多基本细胞过程(10]。此外,表观遗传因素,如microrna,已经被证明是重要的生物分子参与PD的发病机制(11,12]。在这项研究中,我们使用microrna的信使rna从GEO数据库数据集,进行了多个生物信息学分析构建一个潜在miRNA-mRNA监管网络,确定几个信号通路和中心与PD开发相关的基因,并进一步验证这些中心基因通过血液样本中存在的PD患者和健康的捐赠者。我们发现的upregulationLEPR的差别,对这些miR-30e-5p / mir - 101 - 3 - p在PD患者比健康的捐赠者。

microrna已成为关键分子参与PD发病机理。先前的研究表明,mir - 425不足引发necroptosis的多巴胺能神经元,并针对mir - 425 PD小鼠模型恢复功能失调的多巴胺能神经退化和改善行为赤字(23]。此外,miR-27a和miR-27b被认为调节自噬清除受损的线粒体和PINK1基因的表达,这是常染色体隐性PD(最常见的原因24]。此外,microrna在我们的研究中,分析了包括miR-30e miR-21, mir - 101, miR-19a, mir - 142,表达下调,以前作为监管者的PD (25,26]。miR-30家族已经在多个研究和调查似乎发挥重要作用在PD (12,27,28]。生物信息学分析各种PD患者样本确认miR-30家族是潜在的发展上游监管者rate-related PD的生物标记物29日]。此外,据报道,miR-30e减弱炎性细胞因子的水平,如肿瘤坏死因子-α、cox - 2和进气阀打开,注射在改善神经炎症MPTP药物通过直接针对PD模型NLRP3inflammasome [30.]。此前曾报导过mir - 101 - 3 - p调解lncRNA Mirt2-suppressed炎症(31日]。我们的研究显示miR-30e-5p水平的降低和mir - 101 - 3 - p的PBMCs PD患者,在PD支持其负面的监管职责,与先前的研究一致。基于这些研究,包括我们自己的,在PD发病miRNA-mRNA监管网络的存在被认为。

传统上,microrna函数通过调节靶基因转录后的的方式和各种生物过程发挥了关键作用。我们进一步列出了这些丰富的成员功能角度,预测潜在的mrna互动,获得的重叠度,然后构造一个miRNA-mRNA监管网络。值得注意的是,四个基因之间的监管网络,JAK2 IRS2, LEPR,和PPARGC1A,被确定为中心的基因,这表明他们在PD发展至关重要的角色。三个调节基因,IRS2 LEPR,和JAK2、参与leptin-mediated代谢和炎症在PD调节,这是符合他们的角色在脂肪酸运输和糖质新生,进一步强调瘦素在PD信号恶化的重要作用[32,33]。此外,我们确认LEPR作为基因显著升高引起的PD患者与健康对照组相比。瘦素的蛋白质编码的基因LEPR作为监管机构的能量体内平衡和摄食行为34)和展品神经营养行动在围产期中枢神经系统的发展,到成年时35]。Ho等人表明瘦素保存细胞在神经元生存SH-SY5Y对MPP +细胞毒性(帕金森病模型)通过保持ATP水平和线粒体膜电位。的upregulationLEPR基因可能指示激活反馈保护神经元,这将在未来的研究调查与一个更大的PD组。的PPARGC1A基因编码转录共激活剂,PGC-1α,与神经退行性疾病的发病机制,发现压抑在PD (36),在我们的研究中表达下调。针对PGC-1α提出了PD(作为一个潜在的治疗方法37]。有趣的是,PGC-1α也报道规范IRS2水平在肝脏代谢38]。在我们的研究中,PPARGC1A与三个不同的microrna基因相互作用,因此,它的作用在PD发病机理可能比原来想象的要复杂得多。进一步的研究将调查的确切作用PPARGC1A基因在PD的发病机制。

通过功能富集分析,我们筛选出生物信号通路与PD密切相关,包括Rab蛋白信号转导,AMPK信号通路,并通过瘦素信号。中心的基因,JAK2 IRS2, LEPR,和PPARGC1A,主要是参与AMPK和瘦素信号通路。重要证据从PD模型支持在PD AMPK的参与,通过调节细胞新陈代谢,增强自噬,促进线粒体质量控制,抑制氧化,减轻炎症(39- - - - - -41]。的AMPK激活因此被视为治疗PD治疗目标(39]。此外,它已经表明,AMPK活化可能促进清除α-核蛋白,从而促进神经元生存改善PD (42]。瘦素信号传导异常也经常观察到神经退化疾病(43]。越来越多的证据提出了瘦素的作用在调节代谢体内平衡在PD (43,44]。干地亚等人也表明瘦素发挥了关键作用连接代谢失衡和损害神经系统(44]。此外,瘦素也参与PD患者的血压变化在直立的压力(45]。我们的研究和先前的证据表明,microrna的交互和mrna,建立监管网络和功能在不同的信号通路,参与PD的发病机制。

作为一个整体,我们的研究提供了一个全面研究microrna的角色和PD的mrna。我们发现了一个潜在的miRNA-mRNA监管网络与PD发病机制通过使用生物信息学工具和验证这个网络在PD病人收集的血液样本。这项研究的结果有可能提供新的见解PD的发病机制和潜在的治疗靶点。

5。结论

总之,基于生物信息学工具和血液样本验证,一个潜在的miRNA-mRNA监管网络与PD研究中被发现。这些发现铺平了道路识别新方法治疗帕金森病。

6。信息披露

早期版本的手稿已经作为预印本https://www.researchsquare.com(46]。

数据可用性

在当前的研究中使用的数据集是可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

XY设计研究和写文章的初稿;这款手表ZBG和ZFW监督其研究;而兆瓦、GS和永信收集临床样本和发达的主要方法,数据库,和实验;ZYJ导致了文献检索;WW TC审查和编辑文章。所有作者阅读和批准。

确认

作者感谢LetPub (https://www.letpub.com)的语言帮助在准备这个手稿。这项研究得到了国家自然科学基金青年科学家的中国(81701232)、中国人民解放军总医院苗族聚氨酯的基础(18 kmm30),和军事医学项目对于年轻的中国人民解放军总医院的医生(QNF19061)。

补充材料

补充图1。RAB帕金森病的RAB 10日13日和RAB 11 CTD的决心。补充表1。PD患者的临床信息和健康的捐赠者参与这项研究。(补充材料)