) increased divalent metal transporter-1 (DMT1) and hepcidin and decreased ferroportin 1 (Fpn1) level, whereas pretreatment with EGCG counteracted the effects. The increased 55Fe (by 96%, ) cell uptake confirmed the iron burden by 6-OHDA and was reduced by EGCG by 27% (), supporting the DMT1 results. Pretreatment with EGCG and 6-OHDA significantly increased () TH+ cell count (~3-fold) and neurite length (~12-fold) compared to 6-OHDA alone in primary mesencephalic neurons. Conclusions. Pretreatment with EGCG protected against 6-OHDA-induced neurotoxicity by regulating genes and proteins involved in brain iron homeostasis, especially modulating hepcidin levels. "> EGCG防止6-OHDA-Induced神经毒性细胞培养模型 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果
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帕金森病
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帕金森病/2015年/文章

研究文章|开放获取

体积 2015年 |文章的ID 843906年 | https://doi.org/10.1155/2015/843906

丹•陈Anumantha g . Kanthasamy Manju Reddy, ”EGCG防止6-OHDA-Induced神经毒性细胞培养模型”,帕金森病, 卷。2015年, 文章的ID843906年, 10 页面, 2015年。 https://doi.org/10.1155/2015/843906

EGCG防止6-OHDA-Induced神经毒性细胞培养模型

丹•陈,1 Anumantha g . Kanthasamy,2 和 Manju b Reddy1

1食品科学与人类营养学系,爱荷华州立大学,220年麦凯大厅,埃姆斯IA 50010,美国

2爱荷华州立大学生物医学科学系的艾姆斯,IA 50010,美国

学术编辑器:彼得Hagell
收到了 2015年7月20日
接受 2015年11月09
发表 2015年12月06

文摘

背景。帕金森病(PD)是一种进行性神经退行性疾病,导致严重的大脑多巴胺耗竭。铁代谢的干扰可能参与帕金森病的进展。客观的。测试的保护作用(−)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG)对6-hydroxydopamine - (6-OHDA)诱导神经毒性在N27细胞通过调节铁代谢。方法。保护的EGCG N27细胞被SYTOX绿色分析评估,麻省理工,caspase-3活动。铁调节基因和蛋白表达是用rt - pcr和免疫印迹。细胞内铁吸收测量使用55菲。EGCG保护的进一步测试是在初级中脑多巴胺神经元免疫细胞化学。结果。EGCG防止6-OHDA-induced细胞毒性。6-OHDA治疗显著( )增加二价金属transporter-1 (DMT1)和hepcidin和减少1 (Fpn1)运铁素的水平,而与EGCG预处理中和的效果。增加55铁(96%, )细胞吸收证实了铁6-OHDA负担,降低了EGCG的27% ( ),支持DMT1结果。与EGCG预处理6-OHDA显著增加( TH)+细胞计数(~三倍)和神经突的长度(~ 12)相比6-OHDA独自在初级中脑的神经元。结论。与EGCG预处理保护6-OHDA-induced神经毒性通过调节基因和蛋白质参与脑铁体内平衡,尤其是调制hepcidin水平。

1。介绍

铁中起着至关重要的作用在许多生理功能包括DNA合成、氧运输和线粒体呼吸(1- - - - - -3]。铁也是许多酶的辅因子,如酪氨酸羟化酶,它参与了大脑的功能。重要的是调节细胞内铁吸收、运输和存储保持体内平衡铁因为低和高铁水平可以损害大脑功能。non-protein-bound铁的积累在细胞可以诱导氧化损伤细胞细胞器通过产生自由基通过芬顿反应(4),导致慢性神经系统疾病,包括帕金森病(PD) (5,6]。

二价金属transporter-1 (DMT1)是负责细胞铁吸收的蛋白质之一。DMT1可以调节神经毒素,如6-hydroxydopamine (6-OHDA),导致过量的铁涌入和神经退化7- - - - - -9]。然而,目前还不清楚是否铁涌入和随后的自由基的形成是一个主要或次要的事件在神经退行性PD的过程。Hepcidin表达在一些器官,如肝脏、大脑和脊髓,和是一个关键的铁调节蛋白负责正常的铁体内平衡。Hepcidin可以绑定铁出口国1运铁素(Fpn1),导致其内化和退化,从而促进铁保留在细胞10]。Hepcidin表达式是受细胞内铁浓度和氧化应激(11]。因为6-OHDA已被证明改变DMT1表达和诱导氧化应激(7),有可能6-OHDA可能发挥其神经毒性通过hepcidin打断铁内稳态,因此,可能会导致更多的氧化损伤。它已经表明,6-OHDA也可以从铁蛋白释放铁,可引起氧化应激,导致神经细胞死亡(12,13]。然而,具体机制尚不清楚。

绿茶多酚已被证明提供有利影响对癌症、炎症和神经紊乱。(−)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG)是最丰富的绿茶多酚和已被证明能够防止神经毒性在几个细胞培养模型由于其清除自由基的能力和螯合铁(14,15]。几个在体外研究表明,EGCG减少6-OHDA神经毒性,但保护的机制还不清楚。我们假设6-OHDA破坏脑铁代谢通过改变iron-related蛋白质,EGCG政府将规范化这些不利影响。我们使用永生化大鼠中脑多巴胺能神经元细胞系(N27细胞)以及主要中脑多巴胺神经元对6-OHDA确定EGCG的神经保护作用。我们还确定EGCG的保护引起的破坏的铁代谢正常化6-OHDA DMT1监管,Fpn1, hepcidin。

2。材料和方法

2.1。试剂

EGCG、6-OHDA和噻唑基溴化四唑蓝(MTT)从Sigma-Aldrich购买(密苏里州圣路易斯和SYTOX绿色核酸染色是购买的分子探针(尤金,或者)。caspase-3衬底,acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-AFC (Ac-DEVD-AFC)从议员获得生物医学(梭伦,哦)。鼠标TH+抗体是获得微孔(泰梅库拉,CA);Alexa 680 -共轭anti-mouse二级抗体,rpmi - 1640中,胎牛血清,谷酰胺、青霉素、链霉素和neurobasal介质,B27补充,杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)获得表达载体(CA)卡尔斯巴德。兔子anti-rat DMT1多克隆抗体(目录:NRAMP21A),兔子anti-rat MTP1多克隆抗体(目录:MTP11-A)和兔anti-rat hepcidin多克隆抗体(目录:HEPC-11A)从α诊断购买国际(圣安东尼奥,德克萨斯州)β肌动蛋白老鼠anti-mouse单克隆抗体购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。二级山羊anti-rabbit IgG-HRP(目录:sc - 2004)和山羊anti-mouse IgG-HRP(目录:sc - 2005)获得圣克鲁斯生物技术(达拉斯,TX)。SuperSignal西方毫微微化学发光底物为西方墨点法是来自热科学(罗克福德,IL)。55铁是购自PerkinElmer(沃尔瑟姆,MA)。Scintanalyzed ScintiVerse BD鸡尾酒是购自费舍尔科学(宾夕法尼亚州匹兹堡)。

2.2。细胞培养

棚N27细胞被好心的天才博士n·普拉萨德(丹佛市科罗拉多大学健康科学中心),生长在rpmi - 1640中含10%胎牛血清,2毫米谷酰胺,50 U青霉素,50μg / mL链霉素和维持在37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司2先前的研究中描述(16]。

我们也使用主要中脑多巴胺能神经元文化对TH确定EGCG的神经保护作用+细胞。所有的程序涉及动物处理机构使用动物保健委员会批准(IACUC)爱荷华州立大学。腹侧中脑的主要文化准备妊娠14-day-old黑色C57小鼠胚胎如前所述[17]。中脑的组织解剖,在冰冷的Ca2 +无汉克斯平衡盐溶液。细胞被分离在汉克斯平衡盐溶液含有胰蛋白酶0.25% EDTA为30分钟37°C。细胞悬浮在neurobasal中有2% neurobasal补充(B27)后10%的边后卫灭活酶活性在DMEM培养基。细胞被镀的密度 细胞12毫米盖玻片和1毫克/毫升poly-D-lysine预镀。细胞培养在500年维护μ谷酰胺,100国际单位/毫升的青霉素,和100单位的链霉素neurobasal中、在湿润孵化有限公司2孵化器(5%股份有限公司2和37°C)。一半的细胞媒体每2天更换一次,并在7天内使用文化进行了分析。主要文化受到6-OHDA (25μ米)24 h 2 h的存在与否与EGCG预处理(1、10和100μ米,职责)。细胞被固定为采用免疫分析。

2.3。SYTOX绿色分析

与500年N27细胞生长在24-well板块μL rpmi - 1640中与1:coincubated 1000 SYTOX绿色染料。确定剂量反应的保护作用EGCG的6-OHDA损伤,N27细胞用EGCG预处理浓度1,10、50和100μ米2 h, 6-OHDA(100紧随其后μ米)治疗6 h。细胞死亡的评估进行了使用SYTOX绿色核酸染色(17]。每次治疗后,SYTOX绿色荧光信号检测使用一个微型板块读者(Bio-Tek微型板块读者,VT)的激发波长485 nm和发射波长538 nm)。荧光的强度直接与死亡细胞的数量成正比,由尼康倒置荧光显微镜监控设备(te - 2000 U模型、诊断仪器、英镑高度,MI)。

2.4。细胞生存能力

100年N27细胞和cotreated预处理μM的EGCG 6-OHDA治疗6 h,并使用MTT测定细胞生存能力测量如前所述[18]。简单地说,细胞被洗治疗然后用无血清培养后与PBS RPMI中含0.25毫克/毫升的MTT试剂3 h在37°C。Isopropanol-HCl(0.04米)的解决方案是添加到溶解细胞内紫色甲瓒,和吸光度是阅读与参考波长570 nm 630海里使用标(分子器件、桑尼维尔CA)评估细胞的可行性。

2.5。Caspase-3活动

Caspase-3活动测量评估细胞凋亡(如前所述)(19]。简单地说,N27细胞使用100年μM的EGCG 2 h 100紧随其后μ米6-OHDA治疗6 h。然后,细胞悬浮在裂解缓冲(Tris-HCl 50毫米,1毫米的EDTA,和EGTA 10米)包含10毫米的洋地黄皂苷为20分钟37°C。上层清液治疗与fluorogenic衬底Ac-DEVD-AFC 1 h在37°C,和荧光测量在400 nm激发和发射使用标505海里。活动测量荧光单位每毫克的蛋白质。

2.6。免疫细胞化学

主要的中脑多巴胺神经元被用于分析的+细胞通过使用一种免疫细胞化学的方法(16]。细胞用4%多聚甲醛和permeabilized固定。非特异性的网站被封锁,5%正常山羊血清含有0.4% BSA和0.2% Triton-X 100在PBS为20分钟。细胞培养与抗体针对TH+(1:500)在一夜之间在4°C其次是孵化Cy3-conjugated(1: 1000)二级抗体在室温下1 h。二次抗体治疗随访10通过孵化μ33342克/毫升的赫斯特在室温下3分钟细胞核染色。然后,用PBS包含细胞被洗的盖玻片,安装在一个幻灯片,和在尼康倒置荧光显微镜;捕获的图像点数码相机(诊断仪器,英镑的高度,MI)。TH+细胞计数和神经突过程测量如前所述[16]。为测量的+细胞计数,MetaMorph图像分析软件使用。神经元数和体积测量阈值图像使用集成的形态测量学分析(IMA)。神经过程的长度是通过应用该地区和长度测量功能IMA (20.]。

2.7。定量实时聚合酶链反应分析

的mRNA水平DMT1、Fpn1 hepcidin,转铁蛋白受体(TfR),和H-ferritin量化使用实时PCR基因表达分析(21,22]。与100年N27细胞进行预处理μM的EGCG 25紧随其后μM 6-OHDA 24 h。我们使用低浓度的6-OHDA在这些实验,以防止严重的细胞死亡,这样我们能够探测到iron-related蛋白质的表达。总RNA使用绝对孤立的细胞RNA Miniprep工具包(Stratagene,圣克拉拉,CA)和反向转录的高容量cDNA逆转录包(应用生物系统公司,培育城市,CA)。rt - pcr进行使用的SYBR绿色QPCR主混合设备和Mx3000P QPCR系统(Stratagene,圣克拉拉,CA)。25μL PCR反应混合物包括1μL的互补脱氧核糖核酸(RNA)由100 ng, 12.5μL 2 x的主人,每个引物和100 nM(通过集成DNA合成技术、珊瑚镇IA,列在表中1)。骑自行车在95°C条件包含一个初始变性10分钟紧随其后40周期放大30年代在95°C的变性,60°C为退火30年代,30年代和72°C扩展。荧光检测在退火/扩展每个周期的步骤。的GAPDH基因作为内部控制。比较阈值周期方法被用来分析数据。所有的反应都是一式三份。结果控制相比没有任何治疗。
6-OHDA EGCG + 6-OHDA p
DMT1 +愤怒 2.3±0.2 0.9±0.0 < 0.001
Hepcidin 1.7±0.1 0.8±0.2 < 0.01
Fpn1 0.7±0.0 1.2±0.2 < 0.05
H-ferritin 2.4±0.4 1.1±0.2 < 0.05
TfR1 0.7±0.0 1.3±0.1 < 0.01
TfR2 1.5±0.1 1.1±0.1 < 0.05
N27细胞治疗25µM 6-OHDA 24 h后100年EGCG预处理µ米2 h。值比率相比个人mRNA值归一化后的控制GAPDH表达式。p值表明6-OHDA之间的差异和EGCG + 6-OHDA治疗组。
;ns:不显著而控制。
使用学生的差异决定的 以及。
表1
6-OHDA和EGCG iron-related基因表达(±SEM, = 3 - 6)。

2.8。免疫印迹分析

DMT1、hepcidin Fpn1蛋白质表达被免疫印迹试验评估。与100年N27细胞进行预处理μM的EGCG 25紧随其后μM 6-OHDA 24 h。然后,PBS的细胞被洗冷,均质里帕缓冲区中含1% Triton x - 100, 0.1% SDS, 1毫米的phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF),和蛋白酶抑制剂(1毫克/毫升每个抑肽素、抑肽酶和亮抑酶肽),然后用冰。离心后的上层清液收集在10000克15分钟在4°C,和蛋白质浓度测定。40毫克的蛋白质提取与同等体积的5 x混合样本缓冲区(0.35 M Tris-HCl, 10% SDS, 30%的甘油,和0.012%溴酚蓝)并加载到SDS-polyacrylamide凝胶12%或15%尿素凝胶电泳,然后转移到硝酸纤维素(Bio-Rad大力神,CA)。膜被5%的脱脂奶粉在TBS渐变然后孵化兔子anti-rat DMT1与愤怒多克隆抗体(1:200),兔子anti-rat Fpn1多克隆抗体(1:500),或兔子anti-rat hepcidin多克隆抗体(1:500),其次是辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rat IgG抗体(1:3000)。β肌动蛋白(1:2000)是用于正常蛋白质加载。免疫印迹分析都是在两个独立的实验中,表现一式三份和乐队密度控制相比没有任何治疗。

2.9。细胞铁吸收

N27细胞生长在12-well盘子和暴露于25μ与100年M 2 h后6-OHDA预处理μEGCG的M。氯化铁(0.5μCi /毫升55Fe)添加到细胞培养基和孵化24小时37°C。细胞被冷1 x PBS洗两次,250年细胞溶解μL•瑞帕缓冲区,以及离心机在10000 g 10分钟4°C。的55菲在上层清液放射性测量中闪烁计数器预拌10毫升闪烁鸡尾酒。细胞吸收测量基于细胞溶解产物的放射性的发现与最初添加量。实验进行了一式两份,55铁吸收被表示为每分钟计数归一化细胞蛋白质浓度。

2.10。统计分析

数据分析与棱镜4.0软件(图软件,圣地亚哥,CA)。所有的值表示为均值±SEM和代表各自的比例控制。方差分析与图基的多重比较测试用于检测治疗之间的差异。学生的 以及用于比较iron-related基因表达差异6-OHDA EGCG预处理和6-OHDA单独治疗组。均值的差异被认为是重要的 。

3所示。结果

3.1。6-OHDA和EGCG对细胞死亡的影响

基于SYTOX绿色化验,EGCG剂量反应的方式防止6-OHD-induced细胞死亡(图1(一))。三倍(6-OHDA显著增加细胞死亡的~ )与控制。与EGCG预处理浓度50和100μM 2 h细胞死亡减少31% ( )和55% ( ),分别。细胞死亡有100μM EGCG预处理没有显著不同的控制,但明显低于6-OHDA孤单。没有发现保护细胞死亡EGCG在低浓度(1和10μ米)。

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图1
6-OHDA和EGCG N27细胞死亡,细胞生存能力,和细胞凋亡。数据被表示为%的控制(不处理)。细胞死亡(a)是由SYTOX绿色分析,和值意味着±SEM、 。细胞用EGCG预处理2 h 100紧随其后μ米6-OHDA治疗6 h。酒吧没有常见的字母不同。细胞生存能力(b)由MTT试验评估。6-OHDA 100μ摩尔数为6 h / L;EGCG, 100μmol / L。为2 h Pre-trt EGCG:预处理;Co-trt EGCG: cotreatment 6-OHDA。值意味着±SEM, 。细胞凋亡(c)测定caspase-3活动。6-OHDA (100μ100年6 h后EGCG (M)μ米)预处理2 h。值意味着±SEM, 。酒吧不常见字母不同。 。
3.2。EGCG防止6-OHDA-Induced降低细胞生存能力

如图1 (b)、细胞生存能力下降到59% ( 与6-OHDA)后6 h的治疗,但EGCG预处理2 h显著防止这种毒性21% ( )。相比之下,没有发现保护细胞生存能力与EGCG cotreatment组,表明EGCG不提供neurorescue效应。

3.3。EGCG防止6-OHDA-Induced细胞凋亡

细胞凋亡,以caspase-3活动(图1 (c)),确定只有预处理,不是cotreatment ECCG因为它没有显示neurorescue效应细胞生存能力实验。控制相比,6-OHDA显著增加caspase-3活动~ 12 ( ),而与EGCG预处理2 h caspase-3活动降低了49% ( 6-OHDA治疗相比)。

3.4。EGCG TH下降+神经元损失6-OHDA小学文化

治疗6-OHDA 24 h诱导~ 80% ( )损失的+细胞计数(图2 (e)),而控制。与EGCG预处理(1、10和100μ米2 h显著增加TH+细胞计数155% ( ),205% ( )和290% ( ),分别(图2 (e))。EGCG在100μM浓度完全保护TH+细胞的损失,如图所示的控制相比无足轻重的区别。TH的平均长度+神经过程EGCG-pretreated细胞比只接受6-OHDA大大延长。我们发现6-OHDA显著降低TH+神经突的长度93% ( ),而与EGCG预处理(1、10和100μ米~ 2 h显著增加神经突长度的10倍( ),12 ( ),12 ( ),分别(图2 (f))。此外,赫斯特染色是用于验证细胞生存能力。6-OHDA赫斯特活力显著降低,而与EGCG预处理(1、10或100μ米)增加了赫斯特染色(数据未显示),这表明细胞生存能力的主要文化与EGCG增加。总而言之,保护EGCG对6-OHDA毒性被证明是有效的,即使在最主要的文化。

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图2
预防的+神经引起的损失由EGCG 6-OHDA小学文化。细胞用EGCG预处理(1、10和100μ为2 h 6-OHDA紧随其后(10米)μ米)24 h。免疫细胞化学被用来测量TH+细胞(箭头,(a)、(b) (c)和(d))。TH量化数据+数量(e)和神经突的长度(f)。值意味着±SEM, 。酒吧没有常见的字母不同。 ; 。
3.5。EGCG的影响改变6-OHDA Iron-Related mRNA表达的基因

如表所示2,6-OHDA 25μM 24 h显著增加的mRNA表达DMT1 +愤怒,hepcidin TfR2, H-ferritin和降低的mRNA表达Fpn1 TfR1。然而,EGCG中和效果减少DMT1 + 60%(愤怒的mRNA表达 ),hepcidin 54% ( ),H-ferritin 53% ( )和TfR2 27% ( ),而增加的mRNA表达Fpn1 70% ( )和TfR1 96% ( 治疗),而只有6-OHDA,表明细胞中的铁减少负担。
Hepcidin向前 棉酚GGC亚美大陆煤层气有限公司ATG GCA CTA AGC
Hepcidin反向 TCT CGT CTG TTG 20 GAG ATA G
Fpn1向前 CCA有条件现金援助GTG有条件现金援助CCC AGA T
Fpn1反向 CCC ATG CCA GCC AAA AAT AC
DMT1 +愤怒向前 CAG TGC TCT GTA CGT AAC CTG TAA GC
DMT1 +愤怒反向 公司治理文化AGA AGA ACG gg ACC AA
H-ferritin向前 GCC CTG亚美大陆煤层气有限公司AAC TTT GCC AAA T
H-ferritin反向 TGC gg亚美大陆煤层气有限公司攻击力CGT CCA有条件现金援助
TfR1向前 CTA GTA TCT TGA GGT GGG gg亚美大陆煤层气有限公司
TfR1反向 GAG AAT CCC AGT GAG GGT CAG
TFR2向前 AGC TGG广汽GGA GGT广汽TT
TFR2反向 太极拳gg CTC ACA TAC ACG ACA G
GAPDH向前 有条件现金援助GGA棉酚ACC TGC CAA GTA T
GAPDH反向 AGC CCA GGA TGC有条件现金援助TTA GT
所有的引物合成DNA技术集成。
表2
摘要iron-related引物的基因表达。

3.6。EGCG Iron-Related 6-OHDA影响蛋白表达改变

类似于基因表达的结果,6-OHDA显著增加蛋白表达DMT1 +愤怒的2倍( )和hepcidin 77% ( )和表达Fpn1下降61% ( )与控制。与EGCG预处理规范化这些影响减少DMT1 +愤怒66% ( )和hepcidin 43% ( )和Fpn1增长82% ( 独自6-OHDA治疗(图相比)3)。

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图3
免疫印迹分析的影响6-OHDA和EGCG iron-related N27细胞蛋白表达,DMT1(+愤怒)(a), hepcidin (b),和Fpn1 (c),归一化的β肌动蛋白。细胞治疗EGCG (100μ米)治疗前2 h 6-OHDA (25μ米)24 h。定量数据带强度显示在底部面板,(d), (e)和(f)。值意味着±SEM, 。酒吧没有常见的字母不同。 ; 。
3.7。EGCG还原铁6-OHDA引起的负担

如图4,6-OHDA显著增加55铁吸收96% ( )。与EGCG预处理明显降低细胞55铁27% ( )单独6-OHDA治疗相比,支持mRNA和蛋白表达的结果。


图4
55N27铁铁吸收的细胞。细胞治疗EGCG (100μ米2 h 6-OHDA(25紧随其后μ米)24 h。的百分比55铁吸收计算通过测量细胞溶解产物中含有放射性物质的比例关系最初的放射性。值(±SEM, )表示为与蛋白质浓度正常化后的比例控制。酒吧意味着没有一个共同的信是不同的。 ; 。

4所示。讨论

神经毒素,6-OHDA等被广泛用于研究PD在体外和在活的有机体内研究[7,23,24],因为它们能够诱导氧化应激,导致线粒体功能障碍。高剂量的6-OHDA通常用于短期学习和急性病理损害。一项研究表明,100年μM 6-OHDA 6 h完全丧失引起的细胞(25),但在我们的研究中,在同一浓度,6-OHDA细胞生存能力降低了只有~ 40%和N27细胞死亡增加了三倍和细胞凋亡的~ ~十二倍。我们使用相对低剂量的6-OHDA (25μ米),以确定其监管影响iron-related mRNA和蛋白表达以及细胞内铁吸收,考虑到低剂量的6-OHDA有利于更好的理解完全丧失之前的神经退化细胞的机制(26]。原代细胞培养,低浓度的6-OHDA(< 50岁μ米)大多是由于使用高灵敏度的初级神经元(27,28),因为更高浓度的6-OHDA (200μ米)显示完整的死亡大鼠初级nigral文化(29日]。在这项研究中,我们使用了10μM 6-OHDA显示重要的TH+治疗24小时后细胞损失。总的来说,不同的研究中使用的剂量的6-OHDA取决于细胞类型和研究的目的。

等途径,线粒体功能障碍,氧化应激和炎症,已经提议解释6-OHDA-induced神经毒性。它还报道,6-OHDA可以释放铁铁蛋白和改变DMT1表达式,表明它可能产生的毒性打断铁稳态通过增加细胞内铁浓度,进而诱导氧化应激(30.,31日]。在我们的研究中,我们还发现6-OHDA铁代谢改变通过改变铁调节基因和蛋白表达。我们发现6-OHDA增加DMT1 +和hepcidin表达愤怒和减少Fpn1表达式,表明高细胞铁吸收、低铁释放导致细胞铁负担。增加铁蛋白和转铁蛋白受体2 (TfR2) 6-OHDA治疗支持细胞铁浓度增加的假设。铁吸收放射性数据也支持DMT1结果通过展示与6-OHDA铁吸收增加。

我们的研究结果支持先前的研究显示,upregulation 6-OHDA DMT1的愤怒/ IRP-dependent方式,表明6-OHDA可能影响irp的活动和增加DMT1 mRNA的翻译和稳定32,33]。因为我们发现6-OHDA不改变DMT1没有愤怒的表情(数据未显示),我们可以推测,DMT1监管6-OHDA可能通过IRP。DMT1的增加可能会导致高铁涌入,导致氧化应激。

Hepcidin,一个关键的铁监管机构,主要是参与调节铁体内平衡,可以通过增加铁调节流入和高氧化应激(34,35]。TfR2已被证明与hepcidin表达呈正相关(36,37),我们的研究结果显示增加TfR2和hepcidin表达式支持这种关系。Hepcidin可以绑定Fpn1和诱导其内化和退化,降低铁出口。在我们的研究中,我们发现6-OHDA hepcidin和抑制Fpn1表达明显增加,这可能会导致更高的细胞内铁保留。尽管我们没有数据显示减少铁释放支持Fpn1结果,我们可以假设机制基于upregulation hepcidin。混合结果已报告在Fpn1神经毒素的效果。Fpn1降低,增加多余的铁是在早前的一项研究报告(38,39]。相反,神经毒素也被报道在星形胶质细胞表达上调Fpn1 SH-SY5Y细胞(39,40]。Fpn1监管的差异可能取决于细胞类型和性质的神经毒素。

鉴于脑铁水平的改变与几个神经紊乱,维持正常的铁稳态似乎是一个理想的神经保护策略(41]。作为一个铁螯合剂和抗氧化剂,EGCG已经在许多研究报道预防神经毒性(42- - - - - -44]。在这项研究中,EGCG N27保护细胞对抗6-OHDA-induced细胞死亡。EGCG预处理方法比cotreatment证明是更有效的,这表明它提供神经保护而不是neurorescue效果。尽管EGCG在低浓度(10 - 100μ米)施加保护N27细胞和原代细胞培养,浓度为100μM显示最好的保护作用,而高剂量(> 200μ米)被发现有毒(数据未显示)。EGCG的8 h治疗(100μ米)N27细胞减少ROS水平( )与控制(未发表的数据),表明这种级别的EGCG没有毒性作用。这一发现匹配EGCG的钟形模式,典型的抗氧化剂,显示神经保护在低浓度和prooxidant效应在更高浓度(14,15]。不同剂量的EGCG (10 - 400μ米)也报道有保护作用在其他细胞模型45,46]。我们使用100μEGCG的米,高于人们预期在正常生理条件下,因为低剂量少被证明是有效的。这种高剂量可能与人类饮食无法实现,但它是可能的膳食补充剂。

几个拟议的机制可能归因于EGCG的神经保护功能。首先,它可以调节iron-related蛋白质和维持正常的铁稳态(47]。在这项研究中,我们表明,预处理EGCG中和6-OHDA iron-related蛋白质的不利影响,导致细胞内的铁积累较少。减少铁积累与EGCG预处理得到我们的支持55铁吸收的数据显示,27%的铁减少负担而独自6-OHDA治疗。第二,EGCG可能螯合铁,复杂的不被细胞,减少铁诱导活性氧的一代,我们有另一项研究(未发表的结果)所示。第三,EGCG也可能提高抗氧化系统移植抗氧化酶(14,48)和直接清除自由基。减少氧化应激也会影响铁直接或间接体内平衡。EGCG可能也会抑制炎症活动,这可能会间接影响氧化应激和hepcidin和减少铁的负担。

5。结论

总之,结果表明,EGCG可能防止神经毒性。在这项研究中,我们没有看到一个neurorescue EGCG的影响,因为6-OHDA可能造成的急性毒性作用在体外条件。未来的研究需要使用较低剂量的动物模型。人类研究PD患者也将提供数据来研究儿茶素在生理条件下的影响。

利益冲突

作者报告,没有利益冲突有关的出版。

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