α-syn) in the brains of Parkinson’s disease (PD) patients. An increase of SNCA gene copy number can genetically cause familial PD where increased dose of this pathogenic protein correlates with severity of symptoms (triplication of the SNCA gene causes dementia in PD patients). Gene promoter polymorphisms were shown to increase α-synuclein expression as a risk for PD. Cholinesterase inhibitors can clinically slow cognitive decline in the later stages of PD etiology similar to their widespread use in Alzheimer’s disease (AD). Pertinent to this, we identified that the well-tolerated anticholinesterase, phenserine, blocked neural SNCA mRNA translation and tested for targeting via its 5′untranslated region (5′UTR) in a manner similar to its action to limit the expression of the AD-specific amyloid precursor protein (APP). Posiphen, its better-tolerated (+) enantiomer (devoid of anticholinesterase action), repressed neural α-synuclein translation. Primary metabolic analogs of posiphen were, likewise, characterized using primary fetal neurons grown ex vivo from the brains of Parkinson’s transgenic mice expressing the human SNCA gene."> 抗胆碱酯酶氏菌和其对映体髓样为5'unralstated区域定义的翻译帕金森α突触核蛋白表达式 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果
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帕金森病
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帕金森病/2012年/文章
特殊的问题

与帕金森病相关的神经麻烦疾病

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研究文章|开放访问

体积 2012年 |文章ID. 142372 | https://doi.org/10.1155/2012/142372

Sohan Mikkilineni，Ippolita Cantuti-Castelvetri，Catherine M. Cahill，Amelie Balliedier，Nigel H. Greig，Jack T. Rogers那 “抗胆碱酯酶Phenserine及其对映体posphen as 5'帕金森氏α突触核蛋白表达的非翻译区域定向翻译阻滞剂“，帕金森病那 卷。2012年那 文章ID.142372那 13. 页面那 2012年． https://doi.org/10.1155/2012/142372

抗胆碱酯酶Phenserine及其对映体posphen as 5'帕金森氏α突触核蛋白表达的非翻译区域定向翻译阻滞剂

Sohan Mikkilineni.那1 Ippolita cantuti-castelvetri那2 凯瑟琳·m·卡希尔那1 Amelie Blaciedier那1 奈杰尔·h·格雷格那3. 和 杰克T. Rogers.1

1美国马萨诸塞州查尔斯顿市13街149号马萨诸塞州总医院(东)神经化学实验室

2Mind，Massachusetts综合医院，查尔斯敦，MA 02129，美国

3.美国衰老研究所，Baltimore，MD 21224，MD 21224

学术编辑器:保罗福斯特
收到了 2011年7月01
公认 2012年2月29日
发表 2012年5月29日

摘要

α -synuclein的限制性表达( -syn）在帕金森病（PD）患者的大脑中。增加SNCA基因拷贝数可以转基因归因于家族性PD，其中这种致病蛋白的增加剂量与症状的严重程度相关（三倍）SNCA基因导致PD患者的痴呆症）。基因启动子多态性显示出增加 -synuclein表达作为Pd的风险。胆碱酯酶抑制剂可以临床上缓慢的PD病因阶段的认知下降与阿尔茨海默病（AD）的广泛使用相似。与此相关，我们确定了耐受良好的抗胆碱酯酶，氏甲碱，阻塞神经SNCAmRNA翻译并通过其5 '非翻译区(5'UTR)以类似于其限制ad特异性淀粉样前体蛋白(APP)表达的方式进行靶向检测。波西芬，其较好的(+)对映体(无抗胆碱酯酶作用)，抑制神经 翻译-核蛋白。同样地，波西芬的初级代谢类似物是用生长的初级胎儿神经元进行表征的离体从帕金森的转基因小鼠的大脑表达人类SNCA基因。

1.介绍

帕金森病（PD）是一种缓慢进步的神经退行性疾病，影响了65岁以上人口的3％。临床上，它的特征在于一组电机症状和不包括痴呆症的症状。电机症状包括刚性，姿势不稳定性，Bradykinesia和休息震颤[1那2］．与大多数电机症状相关的核心病理特征是来自Indicaia NIGRA PARCASCACA（SNC）的多巴胺能神经元的损失。病理夹杂物，称为石油体，发现在一些剩余的多巴胺能神经元中存在[3.］．发病时多巴胺能神经元的破坏至少为70%，在疾病末期，多巴胺(DA)神经元的损失可超过95% [3.］．PD症状的治疗主要基于更换多巴​​胺能功能，并且可以在减轻多年的情况下显着有效地减轻电机症状[1那4.］．除了痴呆之外，还可以存在额外的非运动症状，包括抑郁，焦虑，感觉异常，Anosmia，睡眠和自主主义障碍，以及痴呆症1那5.-8.］．

特殊的非运动症状，比如睡眠障碍[9.]失去嗅觉[6.那10.和抑郁，可在可检测到的运动症状出现之前就出现[5.］．精神病症状的存在可能影响患者的40％，通常与抗帕金森治疗有关，并且剂量依赖[2那7.］．相比之下，Pd的神经精神症状，如抑郁和痴呆，在疾病的后期更常见[6.那8.那11.那12.］．这些神经精神症状可能与PD本身的进展直接相关，如PD痴呆或PDD，与路易体痴呆(DLB)的存在或与阿尔茨海默病(PD/AD)等共病的存在[2］．Pd中痴呆的发病率比年龄匹配的对照六倍高;在与PD相关的所有形式的痴呆时，使用胆碱酯酶抑制剂可能是有益的[2那13.-17.］．

PD的病因仍然是难以捉摸的[18.］．各种遗传因素已与家族式PD的病因相关联19.］．首先是蛋白质α-突触核蛋白（ syn），一种丰富的脑蛋白质，似乎参与囊泡贩运并参与DA释放的调节[20.］．第一个涉及的报告 -PD中的syn描述了该蛋白的突变，导致该疾病的常染色体显性形式[21.那22.］．随后的研究表明，这种突变极其罕见，但也有 syn可以在所有家庭和零星PD的情况下找到[23.］．重要的是要认识到，到目前为止所确定的遗传机制在个体上是罕见的，而在整体上，只代表了从业人员观察到的PD病例的一小部分。这使得绝大多数PD目前无法解释。

与炎症级联相关的事件[24.]以及铁的新陈代谢[25.那26.]对基因表达的平移控制已被建模与PD和LBD相关[27.］．还报道了中断的信号传导事件的实例，例如响应于炎症细胞因子的发生：例如，信号传导激酶LRRK-2的突变可以在这种神经变性疾病中激活炎症事件[24.那28.]，可能影响新的信号通路[24.］．当然，据报道，据据报告了体内NIGRA（SN）的单个多巴胺能神经元中的铁的增加与PD的发病机制密切相关[29.]，而抗氧化剂已被测试作为缓解帕金森病严重程度的一种手段[30.］．DLB大脑表现出降低SNCA但不溶性蛋白含量较高，提示调控异常SNCAmRNA翻译伴随着伴侣的许可[31.]但虽然减少的自噬可以提供解释。翻译控制 syn可能至少部分由其转录本中唯一配置的5 '非翻译区(5'UTR)控制，该区域编码与已知APP和铁蛋白铁响应元件的同源性[32.-35.］．

事实上，综合核心是中央〜15 kda蛋白涉及神经变性的发病机制 -synucleinopathies [36.]，包括PD-人类中最普遍的运动障碍。其他α突触核苷酸病包括DLB，Alzheimer疾病（AD）和多种系统萎缩的Lewy体变体。在这些障碍中， syn经历构象变化和齐聚，导致功能的毒性增益。神经退行性沉积的 syn聚集体发生，最常见于路易体。路易小体在PD患者中很少见，仅存在于存活的神经元中。 syn聚集体是营养不良的神经牙。胶质细胞质夹杂物在多种系统萎缩中[37.］．致病途径 -核蛋白和淀粉样蛋白-β(a)通过这两个淀粉样蛋白的相互作用聚合，共同沉淀成ß-褶状低聚物和不溶性原纤维[38.-40]，虽然Aß和 syn很少在脑淀粉样膏沉积物中分开[41.］．当然，5 ' utr之间也有重叠SNCA和淀粉样前体蛋白(APP)转录本，另一种相似性提供了PD和AD之间的进一步联系[27.那33.-35.］．

这种重叠在5 ' utrSNCA和APP mrna与我们和其他小组最近的研究结果一致，即两者都是铁代谢和铁代谢的关键因素 syn可以通过对App表达所证明的蜂窝铁水平翻译控制，如应用表达式[35.那42.］．在这方面，App是一种铜依赖性铁出口铁脂酶[43.),而 synCu结合的含氟管酶[44.那45.］．这些相似性，以及抗胆碱酯酶在AD和PD中的应用，为我们检验已知的抗胆碱酯酶是否有益和Aβ降低(46.]同样，提供反 syn神经细胞中的活性。

帕金森病最常见的治疗方法是左旋多巴，通常用于克服震颤的典型问题。然而，随着疾病的发展，临床可用的抗胆碱酯酶已越来越多地经经验使用，部分基于假定的胆碱能系统损害发展的帕金森[47.］．

因此，我们研究了胆碱酯酶抑制剂phenserine及其非胆碱能(+)手性对映体posiphen的降压效果 - 神经细胞系中的蛋白蛋白表达。已显示两种试剂通过在APP mRNA 5'UTR水平介导的平移调节，有效地将APP合成率降低了神经元培养和动物。由于这两种药剂都通过临床研究开发，并且如果有效减少，则在广告中耐受良好 syn水平，他们有转化的希望作为潜在的治疗帕金森病。

此外，由于泊西芬对啮齿动物和人类的有效剂量远高于芬西芬，从而产生高水平的初级代谢物，我们还对泊西芬的三种最主要的初级代谢物进行了描述。作为一个模型来检验 syn-降低这些药物的疗效，我们评估这些筛选的细胞治疗影响SNCA5 ' utr定向翻译阻滞剂 -synuclein在神经细胞系中表达，随后也在PAC/Tg的原代神经元中表达(SNCA)人类基因组SNCA小鼠PD模型(图2和6.）[48.］．

1.1。假设/模型

我们进行测试的模型如图所示7.．总体假设是药物氏碱（抗胆碱酯酶）及其对映体是已知的阿尔茨海默病（Ad）的淀粉样蛋白前体蛋白（Ad）的翻译障碍，并且因此在临床试验中测试了它们的抗酸化疗效和改善认知的潜力。我们注意到，APP mRNA 5'UTR中的RNA靶标类似于α-突触核蛋白转录物中发现的RNA靶标。因此，我们决定看看posiphen和phenserine可能会阻止 -synuclein, PD的主要罪魁祸首蛋白。为了达到这一目的，我们首先用SH-SY5Y多巴胺能神经母细胞瘤细胞和来自PD基因组小鼠模型的原代E18神经元进行了Western Blot实验。我们进行这项研究的基本原理是确定波西芬和芬丝氨酸是否是两种5 ' utr定向药物，可以减少α -突触核蛋白的表达，为帕金森病患者提供治疗益处。

2。材料和方法

2.1。材料

Dulbecco的改进的基本媒体（DMEM，目录号12-614Q）;FBS（目录号14-503E），L-谷氨酰胺（目录号17-605e），青霉素/链霉素（目录号17-602e）;从Lonza（Portsmouth，NH）购买酚红自由培养基（具有4.5克/升D-葡萄糖（目录号12-917F）的酚红DMEM）。胰蛋白酶/ EDTA（目录号25-053-CL）购自Cellgro。稳定的glo（目录号e2250）购自Promega（麦迪逊，WI）。对于Western Blot二级筛网，青霉素/链霉素是从生物惠特克（Walkersville，MD）中获得的，小鼠单克隆抗α-突触核蛋白购自BD转导实验室，并从Chemicon，Inc。获得抗β-肌动蛋白经常使用384孔板（目录号3570），从康宁和猎鹰TC烧瓶购买（目录号353112）购自Becton Dickinson（Waltham，MA）。SH-SY5Y细胞购自ATCC，Manassas，VA。

2.2。细胞培养

转染SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞在35 mL含4.5 g/L d -葡萄糖的完整DMEM中生长，并添加10%胎牛血清200μM L-谷氨酰胺，100μM青霉素/链霉素，和200μ在T1175 TC烧瓶中的G / mL谷物素在TC培养箱（37℃，95％湿度，5％CO2）（倍增时间= 24小时）。未经遗传的SH-SY5Y对应物在没有遗传素的情况下生长。通过用5ml胰蛋白酶/ EDTA（1x）快速洗涤单层，吸入细胞，然后加入5ml胰蛋白酶/ EDTA，并在37℃，95％湿度下孵育5分钟，5％CO2，然后将细胞收集到磷酸盐缓冲盐水中，离心成球，在−70°C下保存。

野生型小鼠和PAC-Tg的初级皮质神经元(SNCA(wt)人类SNCA基因小鼠(48.]如Ray等人的方法概述，2009年[49.］．简单地说，我们在牺牲怀孕的雌性幼鼠后恢复了15-18天的胚胎期，分离了大脑，摘除了脑膜和血管。然后我们将皮质切除，并将其置于单独的eppendorf管中，管中含有500 uL的HBSS，不含Ca＋２/ mg.＋２盐补充1毫米丙酮酸钠和10毫米HEPES, pH 7.4。在冰上，单个细胞用玻璃牧草移液管分离10次，顶端几乎没有火抛光。我们将体积调整到1.5 mL，加入1 mL含Ca的HBSS＋２/ mg.＋２盐+丙酮酸钠+ HEPES，通过添加HBSS恢复二价阳离子，使非分散组织在冰上沉淀5分钟。在组织培养板罩中，我们将上清转移到一个新的15ml试管中，以900 rpm, 4℃离心1分钟。我们用Ca将颗粒重新悬浮在2ml HBSS中＋２/ mg.＋２盐+丙酮酸钠+ HEPES，取等分计数(约2ml。5胚胎)。然后我们镀了~ 1 × 105.24孔或2×10的细胞/孔5./ 12-well盘子。每组培养皿均涂有含有聚l -赖氨酸包覆物的聚d -赖氨酸，以进行神经元完整性的微免疫细胞化学确认。

２.３.生物信息学方法

这 使用NCBI Gene搜索和Ensembl数据库选择 - Xynumin RNA序列（参见[34.])。由于5 ' utr是主要的兴趣，除了8月开始的编码序列(CDS)，大多数都被忽略了。正如我们报道的[34.[两个外显子之间的接头结25 =来自8月的核苷酸，并且在调查的其他物种中被保守。因此，为了研究来自第一外显子的接头结25个核苷酸，用于产生50个核苷酸RNA序列（小鼠和大鼠引起的插入引起的52个NT序列）。

ClustalX2图形程序用于比对RNA序列，以确定物种之间的进化保护。对于α - synuclein, CDS的AUG起始区域是序列比对的参考点，由于具有较高的局部保守保真度，可以比较剪接连接处附近两个外显子中的序列。然后由维也纳大学的RNAfold网络服务器(带有标准设置)生成二级序列，并使用RNAfold命令行软件进行注释。RNAfold服务器基于最小自由能量计算提供了最可能的二级结构。

我们通过比较任何物种的RNA序列(如所列)与HOMO SAPIENS.序列在每个边的接合处。我们还计算了核心L-和h -铁蛋白IREs与α - synuclein和APP mrna的同源性。只有相应的核苷酸HOMO SAPIENS.序列得1分;我们通过合计得分和除以总核苷酸数来确定每一边的同源性百分比。然后对每一侧的结果进行比较，以阐明跨剪接连接处保存的差异。

2.4。结构体

这SNCA-5'UTR-pGL3的构建由pGL3表达载体(Promega)生成。本例中，PCR片段编码48个碱基 - 在PGL3中的Luciferase基因的起始密码子前的后III和NCO1位点之间克隆 - 蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白。瞬时转染的细胞表达PGL3或SNCA5 'utr-pgl3构造。与rsv2 -新霉素质粒共转染后，通过新霉素选择获得稳定转染的神经细胞系，表达SNCA-5'UTR-pGL3构建(H2A细胞)或pGL3(对照细胞)。

2．5．天然产物抑制剂库的稳定转染筛选 -核蛋白翻译

Microsource Discovery Systems, Inc .的720种化合物天然产物，包括添加的phenserine和posiphen，在浓度为2 uM的情况下，通过(APP细胞)和(SNCA细胞)。在本实验中，如果一个化合物在所有重复中对>有65%的抑制作用，那么该化合物被认为是命中的，如果至少有一个重复中对>有65%的抑制作用，那么该化合物被认为是矛盾的，但并不是所有重复中都对>有65%的抑制作用。为了排除由于毒性而降低荧光素酶表达的化合物，我们还使用alamar blue (Biosource, Inc.)作为读数，在两个细胞系中筛选了整个文库的细胞毒性。计算alamar Blue法的抑制率，并与荧光素酶活性的抑制率进行比较。在荧光素酶测定中，波西芬和芬丝氨酸的差异大于40，被认为是命中或矛盾的化合物。

2.6。瞬时转染化验

在100 mm培养皿中转染SH-SY5Y细胞24小时后(i)SNCA-5'UTR-pGL3或(ii) pGL3亲代载体，然后将细胞传代到6个孔中，用波西芬和菲丝氨酸(15μm = 48小时），如图所示3.和4.也进行了剂量反应试验(未显示)[34.那50.］．

2.7。荧光素酶检测

细胞在2000 Cells /well (APP)或4000 Cells /well (SNCA)，在50 uL介质体积的384孔白色平板(Greiner)中。过夜孵育后，50 nL / 5μ使用VPN钢筋加入DMSO中。将细胞返回到48小时的培养箱中，然后测定用于荧光素酶活性。使平板平衡至室温。加入25μl稳定的glo试剂（Promega）后，将平板涡旋30秒，35分钟后，在无限F2000读数器（Tecan）上读取发光的发光[34.那50.］．

2.8。Western Blot测定

人SH-SY5Y细胞和原代皮层神经元(E18胎儿细胞)暴露于浓度增加的芬丝氨酸和波西芬48小时。采用midRIPA缓冲液(25 mM Tris pH 7.4, 1% NP40, 0.5%脱氧胆酸钠，15 mM NaCl，蛋白酶抑制剂，RNase抑制剂，10μ米德勤)。使用小鼠单克隆抗-synuclein (BD转导实验室)和抗- β -actin (Chemicon)进行α -synuclein的Western Blotting。使用化学发光(PIERCE)检测印迹，并使用PhosphoImager (BioRad, Hercules, CA)进行可视化，使用QuantityOne软件(BioRad)对条带进行定量。

3.结果与讨论

在图中1，我们进行了完整的生物信息分析SNCA由计算机介导的预测显示的5'UTR [50.的5'UTRSNCA转录物折叠成类似于耐铁响应元件（IRE）RNA结构的独特的RNA茎环，其与H-Ferritin和APP 5'Frat-Fature IRE相关[33.］．我们目前正在测试细胞内铁与去铁胺螯合抑制神经的能力 -synuclein翻译通过IRE在其转录本的5'UTR起作用，正如我们报道的APP和铁蛋白mrna [42.那51.］．

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图1
SNCA 上面板 SNCA SNCA 58. 底板: SNCA 33. SNCA SNCA SNCA 59. 50. SNCA SNCA SNCB SNCG 制表： SNCA 帕金森病α-突触核蛋白的5'unralslated地区（5'UTR）（)的转录本与h -铁蛋白mRNA中的铁响应元件(IRE)同源。(一)： 这5.。'UTR由Exon-1和Exon-2编码外显子1 ' -2转录本，可选择性剪接生成较短的外显子1/-2转录本或较长的外显子1 ' -2转录本[］．进化排列5.。'UTR相对于人序列和CAGUGN环/剪接位点序列[］．我们量化了整个同源性剪接连接在5 '非翻译区。(b) RNA/FOLD计算机程序从RNA茎环预测5.。'utr序列(kcal / mol）。人类茎环类似于经典IRE RNA茎环(5'CAGUGN3 '环基元)，控制铁依赖的L-和h -铁蛋白翻译和转铁蛋白受体(TfR) mRNA的稳定性。一些物种的5 ' utr茎环被预测是折叠的，如材料和方法部分所述，假三环AGU在h -铁蛋白IRE的顶端用红色字母表示[]描绘了App IRE中的类似AGA [］．人类mRNA表现出AGU TriLoop，而在下脊椎动物中，该AGU基序位于这些转录物的干燥区域。显示的是拼接位点和5'UTR结构的排列那那MRNA。第一个表显示了人类α -突触核蛋白每个外显子的ire样结构域与不同哺乳动物物种的类似结构域之间的同源性。第二表显示了5 '非翻译区域之间的同源性使用APP和FERRININ L-和H-CHAINS。该数据强调了我们通过小分子（例如氏甲碱和Posiphen）的APP和α-突触核蛋白的Cot转移镇压的识别。
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图2
- 应用程序 SNCA μ - 50. μ β 波西芬和芬丝氨酸均能降低APP和突触核蛋白水平依赖性在多巴胺能SH-SY5Y细胞中。小组A：两者的5岁和基因与IRE h -铁蛋白mRNA同源性为50%。B组:SH-SY5Y细胞用0 - 10浓度处理用芬丝氨酸和波西芬浸泡48 h。制备收获的细胞裂解物。Western Blotting定量分析建立了抗Posiphen和Phenserine的SYN疗效（IC<5m）;标准化后-肌动蛋白(多道密度测定法(）通过imagequant）。细胞活力不受影响（通过标准化的ATP水平/细胞（TM（Cell-Titer-Glo，Promega，Inc.））测量）。

图3.
SNCA μ SNCA SNCA 波西芬是-突触核蛋白5 ' utr定向翻译的立体特异性抑制剂。瞬时转染试验-5.。’utr - pgl3构建(H2A细胞系)。波西芬是一种高度选择性的抑制剂(10米)的-Xynucin 5'Utr驱动荧光素酶报告基因的表达。Phisserine的这种立体异构体受到抑制-synuclein5.。' utr驱动的荧光素酶在神经细胞中的表达(5.。’utr阳性转染的神经细胞())。相比之下，Phisserine和已知的App特异性翻译2号阻断剂未抑制H2A细胞中赋予α偶联5'UTR的翻译。Phenserine和App Blocker号9增加5.。'UTR授予的翻译。这些数据支持Posiphen的作用机制作为α突触核蛋白5'UTR活性的高度选择性阻断剂，而氏甲簇（相同的化学结构但Posiphen的立体异构体）先前示出了由APP 5'UTR驱动的平移。

图4.
μ SNCA 对α -synuclein 5'UTR序列驱动的翻译抑制的选择性:第二组瞬态转染实验(10m）在SH-SY5Y神经细胞中选择性地抑制α-突触核蛋白5'UTR赋予的荧光素酶表达（5.。'UTR阳性转染剂，（))。证实了选择性，在pGL3转染的SH-SY5Y细胞中，posiphen增加了荧光素酶的表达(**pGL3-SH-SY5Y作为实验对照，因为这些细胞转染了pGL3，这与H2A结构相同，但缺乏-核蛋白5 'utr)。

以前，将RNA定向的抗胆碱酯酶药氏碱与其胆碱理惰性手性（+）对映体，染色症均在AD的临床开发中显示出治疗限制脑Aβ野生型和AD小鼠模型的水平[46.］．通过降低应用程序的合成速率，全部或部分地介导此操作，从中β是proteolytically裂解。在这里，我们试图证明，同样地，phenserine和posiphen也会被阻断 -通过相关的5 ' utr表达synuclein，编码铁响应元件RNA元件的变异版本，可能结合铁调节蛋白。

为了阐明我们定义的目标是否会跨物种翻译，我们提供了一项关于IRE RNA茎环保存的进化评估结果SNCAmRNA如图所示1．这是RNA二级结构序列，与Phenserine和Posiphen靶向的APP 5'UTR一起，如图所示2-4.．α -synuclein特异性IRE茎环形成于前两个外显子的剪接连接处SNCA基因(35.］．我们还比较了预测的结构SNCAMRNA IRE在H-Ferritin和APP转录物中，从其基因的单一首要外显子转录，证实了平移抑制的唯一性SNCA通过它的5'UTR的mRNA。

抗胆碱酯酶phenserine及其(+)对映体posiphen是经证实的APP 5'UTR介导的药物，在啮齿动物和人类中具有已知的药代动力学和确定的目标浓度[46.那52.］．因为我们预期两个代理都将在限制中活跃 -通过它的5'UTR的突发蛋白翻译，我们在我们以前筛选时，我们飙升了一个FDA库和PhisserineSNCA5'UTR RNA目标[34.］．在这里，我们确认Posiphen和Phenserine都被压抑了SNCA5'UTR驱动的稳定细胞系中荧光素酶报告器的翻译。他们抑制的能力SNCA正如我们之前报道的，mRNA翻译类似于某些其他FDA定义的药物先导物，包括三糖苷和一种免疫抑制剂麦考酚酸(二级铁螯合物)[34.］．

在图中2(一个)，两个应用程序的5岁SNCAh -铁蛋白mRNA与IRE的同源性分别为40%和50%。因此，我们进行了多次Western blot实验，以确定phenserine与posiphen的影响范围 -syn与APP表达式比较。在这方面，SH-SY5Y细胞用这两种化合物处理48小时，浓度从0到10不等μM.可行性研究确定，与之前的研究一致，该范围具有良好的耐受性。一般和如图所示2 (b)，波西芬(除了，但可能比芬瑟宁更有效)降低了 -如前所述为应用程序报告，以培养的神经细胞（SH-SY5Y）中的剂量依赖性方式。这种较高的效力是否会转化为原发性神经元和体内是未来研究的重点。在本文中，这是通过初步确定的IC实现的50.顺序是5μm，在没有毒性的情况下。

使用由48碱基SnCA 5'UTR驱动的翻译荧光素酶的构建体进行SH-SY5Y细胞的多瞬时转染。SNCA-5'UTR-PGL3）或空PGL3表达载体（图3.和4.)．如图所示（图3.和4.)， 50%被抑制SNCA5'UTR-授予荧光素酶报告转录物的翻译。在这方面，Posiphen证明了一种高度选择性的抑制剂SNCA5'UTR驱动的活性，因为这种手性纯化合物被抑制SNCA5'UTR驱动的荧光素酶在H2A神经细胞中的表达（即，SNCA5'Utr阳性稳定转染的神经细胞）。相比之下，Phenserine和已知的应用翻译阻拦者，化合物号9（包括在于比较器），没有抑制SNCA5'UTR在H2A细胞中进行翻译。事实上，麻黄碱和9号化合物含量升高SNCA5'UTR授予的翻译。

这些数据支持了波西芬作为一种高度选择性阻滞剂的作用机制SNCA5 'utr活动。然而，phenserine -具有相同的化学结构，但具有不同的三维(手性)构型，此前已经证明它能有效抑制APP 5'UTR驱动的转译，显然在SNCA5'UTR。从这里，我们可以推断出来的元素SNCA5'UTR由Posiphen瞄准具有立体化组件。另外，由于Phenserine降低了 -syn水平(图2 (b)),进一步SNCARNA序列可能参与控制该途径 -syn平移的监管。

超越转化的神经元细胞系，原代神经元野生型老鼠和PAC.SNCA转基因小鼠(PAC-TgSNCA)的抑制能力进行了评估 -SYN表达式，如图所示6.（以100nm的药物浓度测试）。Posiphen不仅在SH-SY5Y细胞中活跃和良好耐受，而且持续减少人类 -在低至1 uM剂量(减少75%，未显示)时，初级神经元中的synuclein表达(E18)无毒性。在同样的细胞中(数据未显示)，这一差额似乎大于其降低APP产量的能力(20%)(作为阳性对照)。

在口服Posiphen施用啮齿动物，狗和人后，将该化合物进行代谢过程，并在这些物种上产生相同的代谢型材。具体地，通过第1阶段代谢，Posiphen在N1和N8位置中经历N-去甲基化，以产生相应的原代代谢物，N1-NORPOSIPHEN和N8-NORPOSIPHEN（图5.)．然后每一种都进一步进行n -去甲基化，生成共同的代谢物N1, n8 -双诺波西芬。与芬瑟碱不同的是，波西芬缺乏胆碱酯酶抑制活性，因此可以在较高的临床剂量(5倍至8倍)下给药。


图5.
60. 离体 61. 62. posiphen的代谢类似物及其各自的抗胆碱酯酶活性[］．波西芬缺乏抗胆碱酯酶活性。然而，其1期代谢物N8去甲基化、N1去甲基化和双去甲基化N1、N8-双诺泊酚显示临床相关性的疼痛和BCHE抑制活性[那］．化合物n8 -双诺啡没有乙酰胆碱酯酶活性。在人类安全研究中，这种活动被证明是有剂量限制的。

图6.
- SNCA - n β 百分比抑制与原代E18神经元中synuclein/APP的代谢类似物比较(来自PAC-Tg(） 老鼠）。密度测定和相对水平的定量synuclei/应用程序from western blots (-actin标准化)后，用波西芬及其三个代谢类似物在100 nM浓度下处理初级神经元48小时。

图7.
一种α -突触核蛋白的翻译抑制模型，其中它的转录与RNA抑制蛋白相互作用。在经典的翻译抑制模型中，铁调节蛋白1 (IRP1)控制铁蛋白L-和h -链的铁依赖表达。通过类比，可以预测芬丝氨酸、波西芬及其代谢类似物作为RNA结合蛋白，在药物处理后增加抑制因子，与SNCA 5’utr相互作用。这应该会阻止40S核糖体进入SNCA mRNA的5'UTR以降低翻译。

如图所示5.，特异性N-脱甲基化代谢物（特别是N1-NOR和N1，N8-Bisnorposiphen）具有潜在的临床相关的IC50.抑制乙酰胆碱酯酶的值（疼痛）。这些活性小于氏甲碱基，预期将符合Posiphen的时间依赖性代谢的缓慢发作，以产生其代谢物。但是，关于行动 -突触核蛋白的表达，代谢产物的活性，在这个靶点，泊西芬是有效的，可以有效地增加和延长药物的体内功效。为了阐明这一点并帮助规划未来的动物研究，我们描述了波西芬代谢类似物的相对影响能力 -syn表达式（图6.)．

数字6.显示了Western Blot分析，代表了三个实验，比较了posiphen和它的三个主要代谢物的疗效限制 -核蛋白表达离体使用来自人的E18初级皮质神经元SNCAPAC老鼠。我们一直在测量N1-norposiphen(具有乙酰胆碱酯酶活性)被证明是最有效的限制 -synuclein表达减少50%，APP表达也减少。如图100 nM处所示6.，其他代谢物对这些靶点的活性较低，表明相对较小的结构变化(即甲基部分的丢失)具有显著影响。评估每个代谢物的剂量反应是未来研究的重点，特别是在可实现的临床范围内的药物在人和体内动物模型的范围（Maria Maccecchini博士和Robert Nussbaum博士，个人通信）。

4。结论

我们以前报道过培育术，A（ - ） - 抗磷酸酯酶，达到AD期临床评估[53.-55.]，虽然它的5'UTR [56.那57.］．芬丝氨酸被发现在其乙酰胆碱酯酶抑制作用后具有剂量限制，引起动物模型中的震颤和人类的恶心的经典胆碱能作用。相比之下，phenserine的手性纯(+)对映体Posiphen不具有直接的抗胆碱酯酶活性，同样地，通过其5'UTR抑制小鼠神经ad特异性APP翻译。它最近被开发(QR Pharma, Berwyn, PA)作为AD的APP合成抑制剂，以降低两脑Aβ一代以及其他有毒蛋白水解的产物应用的水平。与一个非常不同的药理学和药代动力学phenserine,它最近完成了单身,multiple-dose升级阶段我在人类临床评估,出现耐受良好,证明机制的研究,表明目标订婚。

在本文中，我们在人类不朽神经元培养中证明了，然后离体在来自人的原发性皮质神经元SNCA基因组小鼠模型，即Posiphen.充当安全的5'UTR定向毒性抑制剂 -突触核蛋白累积。最后验证SNCA5'UTR的目标将通过不变来实现β-核蛋白(β-syn)和 -核蛋白( -SYN）表达是当前研究的重点。重要的是，我们确定Posiphen的主要代谢物，同样降低 -SYN表达，因此可以在动物和人类研究中增加对该目标的Posiphen的作用。

更有趣的是，我们确定了同样有效地降低了麻黄碱的含量 -但与posiphen相比，它是通过一种不同的机制实现的，可能是通过5'UTR甚至3'UTR中的其他元素相互作用，从而突出目标对微小结构-活性变化的敏感性。这些研究还证明了如何做到这一点 -synuclein和a的致病机制可以通过两种淀粉样蛋白的相互作用而聚合[38.-40]，虽然Aß和 -SYN很少在淀粉样膏沉积物中共定41.]但提供了靶向一种疾病的药物可能对另一个疾病的药物具有治疗潜力。

在这方面，我们指出，应用程序的5'UTR之间存在50％的序列相似性SNCA基因。因此，我们预测会通过其5'UTR抑制APP mRNA翻译的药物谱与那些抑制APP mRNA翻译的药物谱重叠 -synuclein，特别是phenserine和posiphen(与初步IC50.价值为5μM和更少)。在未来的研究中，我们的目标是对抗 -与代谢类似物及其他化合物相比，波西芬类似物对原代神经元中的突触核蛋白的影响更大体内最有效的功效SNCA5'UTR翻译阻止者。

致谢

作者感谢Robert Nussbaum和Yien-Ming Kuo博士（UCSF）的PAC-TG（SNCA）小鼠。This research was supported (i) for J. T. Rogers by the Michael J. Fox Foundation Novel Drug Discoveries Award, National Institute of Aging R01 AG20181, NINDS R21NS059434, Alzheimer’s Association Zenith Award 09–131352 and ISOA (ii) for N. H. Greig by the Intramural Research Program, National Institute on Aging, National Institutes of Health, (iii) for I. Cantuti-Caselvetri: the MGH/MIT Morris Udall Center of Excellence in PD Research (NIH NS38372) and the APDA Advanced Center for Parkinson Research at MGH, and (iv) for C. M. Cahill by NIH HD012437 29 S-1.

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