PD 帕金森病 2042 - 0080 2090 - 8083 Hindawi出版公司 142372年 10.1155 / 2012/142372 142372年 研究文章 胆碱酯酶抑制剂Phenserine及其对映体Posiphen 5′Untranslated-Region-Directed翻译阻滞剂帕金森的α-核蛋白表达 Mikkilineni Sohan 1 Cantuti-Castelvetri Ippolita 2 卡希尔 凯瑟琳·M。 1 Balliedier 天使爱美丽 1 格雷格 奈杰尔·H。 3 罗杰斯 杰克T。 1 福斯特 保罗。 1 神经化学实验室 马萨诸塞州综合医院(东) 149元,13街 查尔斯顿,马02129 美国 2 看来,马萨诸塞州综合医院 查尔斯顿 马02129 美国 massgeneral.org 3 药物设计和开发部分 神经科学实验室 校内的研究项目 国家老化研究所 马里兰州巴尔的摩21224 美国 nia.nih.gov 2012年 21 03 2012年 2012年 01 07年 2011年 29日 02 2012年 2012年 版权©2012 Sohan Mikkilineni et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

有令人信服的支持限制表达α-突触核蛋白( α - - - - - - syn)在帕金森病(PD)患者的大脑。增加了 SNCA基因拷贝数的基因会导致家族性帕金森病,增加剂量的致病蛋白质与症状的严重程度(的三倍 SNCAPD患者的基因导致痴呆)。基因启动子多态性被证明增加 α -核蛋白表达作为帕金森病的风险。胆碱酯酶抑制剂在临床上可以减缓认知能力的衰退后期PD的病因被广泛使用在类似阿尔茨海默病(AD)。相关的,我们发现,良好的抗胆碱酯酶,phenserine,阻止神经 SNCA信使核糖核酸的翻译和检测目标通过(5′UTR) 5′端非翻译区在某种程度上类似于它的行动限制的表达AD-specific淀粉样前体蛋白(APP)。Posiphen,其耐受性更好(+)对映体(无抗胆碱酯酶的作用),压抑的神经 α 翻译-核蛋白。初级代谢posiphen的类似物,同样,使用胎儿神经元生长的主要特征 体外从帕金森转基因小鼠表达人类的大脑 SNCA基因。

 1。介绍

帕金森病(PD)是一个缓慢渐进的神经退行性疾病影响多达3%的人口年龄在65年。在临床上,它的特点是一组电机和nonmotor症状包括痴呆症状。运动症状包括刚度、姿势不稳定,动作迟缓,休息的颤动 1, 2]。核心病理特性相关的这些运动症状是黑质致密部多巴胺能神经元的损失(SNc)。病理夹杂物,称为路易小体,是发现在一些剩余的多巴胺能神经元( 3]。多巴胺神经元的毁灭在发作至少70%,最后阶段的疾病多巴胺(DA)神经元的损失,可以超过95% 3]。治疗帕金森病的症状主要是基于替代的多巴胺功能,可以非常有效地减轻运动症状的年 1, 4]。额外nonmotor症状出现,包括抑郁,焦虑,感觉异常,嗅觉缺失症,睡眠,和自主障碍,除了痴呆( 1, 5- - - - - - 8]。

特定nonmotor症状,如睡眠障碍( 9],丧失嗅觉[ 6, 10),和抑郁,可能发生之前检测到运动症状的存在( 5]。精神病症状的存在,会影响多达40%的病人,通常与anti-parkinsonian有关治疗和是剂量依赖 2, 7]。相比之下,帕金森病的神经精神症状,如抑郁和痴呆,更常见的在疾病的后期 6, 8, 11, 12]。这些神经精神症状可能是直接相关的进展PD本身在帕金森病痴呆或PDD,与路易体痴呆的存在(下文)或并发症的存在像阿尔茨海默病(帕金森病/广告) 2]。痴呆的发病率在PD在年龄组的6倍;在所有形式的痴呆与帕金森病有关,胆碱酯酶抑制剂的使用可能是有益的( 2, 13- - - - - - 17]。

PD的病因仍然是难以捉摸的( 18]。多种遗传因素与家族性帕金森病的病因 19]。首先是蛋白质的α-突触核蛋白( α syn),一个丰富的大脑蛋白质似乎参与囊泡贩运和参与DA发布的规定 20.]。第一个报告包含的东西 α - - - - - -syn在PD描述蛋白质的突变,导致常染色体显性遗传疾病的形式( 21, 22]。随后的研究发现,这种变异是极其罕见而且总量 α syn可以发现,在所有情况下的家族和零星的PD ( 23]。重要的是要认识到遗传机制确定日期分别是罕见的,总的来说,只代表一小部分例PD从业者观察到。因此让绝大多数的PD目前原因不明。

与炎症相关的事件级联( 24)以及铁代谢( 25, 26)和转化控制基因表达的建模与PD和小黑裙 27]。也有报道的例子中断信号等事件发生,以应对炎症细胞因子:例如,突变信号激酶LRRK-2可能激活炎症事件在这种神经退行性疾病 24, 28),可能影响小说的信号通路( 24]。当然,铁增加个人的黑质多巴胺能神经元(SN)据报道,与PD的发病机制密切相关 29日),和抗氧化剂检测作为一种手段来缓解帕金森病的严重程度( 30.]。下文的大脑表现出降低 SNCA信使rna但更高的不溶性蛋白质,暗示misregulation SNCA信使核糖核酸的翻译更多的陪伴的间隙( 31日),虽然降低了自噬可能提供解释。转化的控制 α syn可能适用,至少在某种程度上,由一个独特的配置(5′UTR) 5′端非翻译区记录的编码与已知的同源性应用和铁蛋白iron-responsive元素( 32- - - - - - 35]。

α -核蛋白,事实上,中央~ 15 kDa蛋白与神经变性的发病机制 α -synucleinopathies [ 36),包括PD-the人类中最普遍的运动障碍。其他αsynucleinopathies包括下文、路易体变体的阿尔茨海默病(AD)和多系统萎缩。在这些障碍, α syn经历一个构象变化和低聚,导致有毒的增益函数。神经退行性沉积的 α syn在路易小体聚集发生,最常见的。路易小体是罕见的在PD患者中,目前只有在幸存的神经元。  α syn聚集在瘠薄探明。神经胶质细胞质内含物在多系统萎缩( 37]。致病的途径 α -核蛋白和淀粉样蛋白- β通过交互(Aß)收敛这两个amyloidogenic蛋白质,共沉淀成ß-pleated寡聚物和不溶性纤维 38- - - - - - 40),尽管Aß和 α syn很少colocalize大脑淀粉样变( 41]。当然也有重叠5′utr的 SNCA淀粉样前体蛋白(APP)记录,另一个相似之处,它提供了一个进一步PD和广告之间的联系( 27, 33- - - - - - 35]。

这种重叠的5′utr SNCA和应用mrna符合我们和其他组织的最近的示威活动,都是在铁代谢和关键球员 α syn可以控制的转化细胞铁水平作为应用证明表达( 35, 42]。在这方面,应用程序是一个copper-dependent铁出口铁氧化酶( 43),而 α syn一个Cu-binding ferrireductase [ 44, 45]。这些相似之处,加上抗胆碱酯酶在AD和PD的效用,提供我们的原理来测试是否有益的和已知的抗胆碱酯酶 β降低( 46),同样,提供反 α syn神经细胞的活动。

最常见的治疗PD是左旋多巴,经常被用来克服地震的典型的问题。随着疾病的发展,然而,临床上可用抗胆碱酯酶已经越来越多的使用经验,在一定程度上是基于一个公认的胆碱能系统的损伤发展中PD ( 47]。

因此,我们的研究调查的有效性胆碱酯酶抑制剂phenserine及其noncholinergic(+)手性对映体,posiphen在降低 α -核蛋白表达神经细胞系。代理都被证明能够有效地降低应用合成率通过平移调节介导神经元文化和动物在APP信使rna 5′UTR水平。作为代理已经过临床研究和广告中出现耐受良好,如果有效地降低 α syn水平,他们持有转化作为潜在的治疗PD的承诺。

此外,随着posiphen前可以有效地在啮齿动物和人类的数量远远大于phenserine,从而产生高水平的主要代谢产物,三个最著名的主要代谢产物posiphen也为特征。作为一个模型来检查 α syn降低这些药物的功效,我们评估了这些筛选细胞治疗的影响 SNCA5′UTR-directed翻译阻滞剂减少 α -核蛋白表达神经细胞线路和随后的初级神经元从PAC / Tg ( SNCA)人类基因组 SNCA帕金森病小鼠模型(数据 2和 6)[ 48]。

1.1。假设/模型

我们的模型进行测试图所示 7。包罗万象的假设是,药物phenserine(抗胆碱酯酶)及其对映体被翻译阻滞剂淀粉样前体蛋白的阿尔茨海默病(AD),因此,在临床试验中测试过antiamyloid有效性和潜在改善认知。我们注意到RNA 5′UTR的目标应用mRNA类似发现在α-突触核蛋白成绩单。因此,我们决定看看posiphen phenserine可能会阻止 α 在PD -核蛋白,中央的罪魁祸首蛋白质。为了实现这个目标,我们进行了免疫印迹实验首先与SH-SY5Y多巴胺能神经母细胞瘤细胞,然后主要E18神经元从PD的基因小鼠模型。我们的理由进行本研究旨在确定posiphen和phenserine是两个5′UTR-directed药物会降低α-突触核蛋白表达提供治疗帕金森病病人受益。

 2。材料和方法 2.1。材料

杜尔贝科的基本介质(DMEM,目录没有修改。12 - 614 - q);的边后卫(目录号14 - 503 e)、谷酰胺(目录没有。17 - 605 e),青霉素和链霉素(目录号17 - 602 e);酚红自由媒体(苯酚red-free DMEM和4.5 g / L d -葡萄糖(目录号12 - 917 f))从Lonza购买(朴茨茅斯NH)。胰蛋白酶/ EDTA(目录没有。25 - 053 - cl)从Cellgro购买。 Steady-Glo (catalog no. E2250) was purchased from Promega (Madison, WI). For the Western Blot secondary screen, penicillin/streptomycin was acquired from Bio-Whittaker (Walkersville, MD), mouse monoclonal anti-alpha-synuclein was purchased from BD Transduction Laboratories, and anti-beta-actin was acquired from Chemicon, Inc. We routinely use 384-well plates (catalog no. 3570), which were purchased from Corning and Falcon TC flasks (catalog no. 353112) were purchased from Becton Dickinson (Waltham, MA). SH-SY5Y cells were purchased from the ATCC, Manassas, VA.

 2.2。细胞培养

转染SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞种植在35毫升confluency完成DMEM和4.5 g / L d -葡萄糖补充10%的边后卫,200 μ谷酰胺,100 μM青霉素和链霉素,200 μg / mL geneticin T175 TC烧瓶中TC孵化器(37°C,湿度95%,5%的公司2)(倍增时间= 24小时)。Untransfected SH-SY5Y同行都没有geneticin成长。细胞被洗的单层快速收获5毫升胰蛋白酶/ EDTA (1 x),吸气,然后添加5毫升胰蛋白酶/ EDTA和孵化为5分钟37°C,湿度95%,5%的公司2后,细胞被收集到磷酸盐和离心机颗粒为存储−70°C。

主要从野生型小鼠皮层神经元和PAC-Tg ( SNCA(wt)人类 SNCA基因小鼠( 48)培养的方法概述射线et al ., 2009 49]。短暂,我们回收胚胎提升天小狗牺牲女性怀孕后,分离出大脑,消除了脑膜和血管。然后我们解剖皮质和放在单独的埃普多夫管包含没有Ca 500 uL的哈佛商学院+ 2/毫克+ 2盐补充1毫米丙酮酸钠和10毫米玫瑰,pH值7.4。在冰上,单个细胞被titurating孤立使用10倍与技巧几乎没有火抛光玻璃牧场吸管。我们调整量1.5毫升,加入1毫升的哈佛商学院与Ca+ 2/毫克+ 2盐+ Na丙酮酸+玫瑰,恢复二价阳离子通过添加非分散组织哈佛商学院,这样可以满足于5分钟,在冰上。在组织培养层流罩,我们浮在表面的转移到一个新的15毫升900 rpm管和离心1分钟,4°C。我们轻轻地resuspended 2毫升的颗粒与Ca哈佛商学院+ 2/毫克+ 2盐+ Na丙酮酸+玫瑰,为大约数的整除(2毫升。5胚胎)。然后我们镀~ 1×105细胞/ 24-well或2×105/ 12-well盘子。每组包含聚赖氨酸的盘子被涂上一层聚D-lysine盖玻片为微采用神经元完整性的确认。

 2.3。生物信息学方法

的 α -核蛋白RNA序列选择使用NCBI基因搜索和运用数据库(参见[ 34])。自从5′utr主要关心的,编码序列(CDS)大多是忽视的,除了开始8月我们报道( 34),两个外显子之间的接头连接发生在CAGUGU网站从8月25 =核苷酸,这种模式在其他物种调查是守恒的。因此,为了研究平衡的序列,前25核苷酸接头连接从第一外显子被用来创建50个核苷酸RNA序列(老鼠和老鼠有52元序列由于插入)。

ClustalX2图形程序被用来使RNA序列识别任何进化保护物种之间。α-核蛋白,8月开始的序列比对的cd是一个参考点,允许一个比较两个外显子序列的拼接结,由于当地环保保真度高。二次生成的序列被维也纳大学RNAfold网络服务器(使用标准设置),注释使用RNAfold命令行软件。RNAfold服务器提供最可能的二级结构基于最小自由能的计算。

我们计算的对齐同源性比较任何物种的RNA序列(上市)反对 智人序列拼接结的两侧。我们也计算之间的同源性核心L -和H-ferritin IREs与α-核蛋白和应用mrna。只有各自匹配的核苷酸 智人序列是得分点;我们确定的百分比相同两侧通过总计得分和除以核苷酸的总数。每一方的结果被照亮的差异相比保护接头连接。

 2.4。构造

的 SNCA5′UTR-pGL3构建生成的pGL3表达载体(Promega)。在这种情况下,PCR片段编码48基地 α -核蛋白5′UTR之间克隆面前的Hind-III和Nco1网站开始在PGL3荧光素酶基因的密码子。瞬变pGL3或转染细胞表达 SNCA5′UTR-pGL3构造。稳定转染神经细胞系生成后通过新霉素选择cotransfection RSV2-neomycin质粒表达 SNCA5′UTR-pGL3构造(H2A细胞)或pGL3(控制单元)。

 2.5。Stable-Transfection-Based屏幕的自然产物抑制剂图书馆< inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id = " M25公路" > < mml: mrow > < mml: mi >α< / mml: mi > < / mml: mrow > < / mml:数学> < / inline-formula > -核蛋白翻译

720复合天然产品,包括添加phenserine posiphen,从Microsource发现系统,Inc,上映2嗯一式三份的浓度抑制荧光素酶表达的使用(应用细胞)和( SNCA细胞)。化合物被列为了如果所有复制给> 65%抑制试验,如果至少有一个和矛盾的,但并不是所有的复制给抑制> 65%。为了排除由于毒性化合物荧光素酶的表达减少,整个图书馆也筛选两种细胞株的细胞毒性,使用alamar蓝色(Biosource, Inc .)读出。alamar蓝抑制百分比计算分析并与荧光素酶活性的抑制百分比。Posiphen和phenserine差异大于40的化合物和荧光素酶得分达到或矛盾的分析。

 2.6。瞬时转染化验

SH-SY5Y 24小时转染后细胞在100毫米盘要么(我) SNCA5′UTR-pGL3或(ii) pGL3父母向量,细胞然后通过6井和测试posiphen和phenserine (15 μM = 48小时)如图 3和 4的剂量反应分析也进行了(没有显示) 34, 50]。

 2.7。荧光素酶检测

细胞被镀在2000细胞/(应用程序)或4000细胞/ ( SNCA)在384 -白色的平底盘子(格林尼)在一个卷50 uL的媒体。隔夜孵化后,50问5 μ使用VPN Pintool M在DMSO被添加。细胞被返回到孵化器48 h,然后化验荧光素酶的活动。盘子被允许平衡至室温。后添加25 uL Steady-Glo试剂(Promega),盘子漩涡,持续30秒,35分钟后发光读取无限F2000板读者(Tecan) [ 34, 50]。

 2.8。免疫印迹分析

人类SH-SY5Y细胞和初级皮层神经元(E18胎儿细胞)暴露在浓度增加phenserine posiphen 48小时。胞质蛋白溶菌产物被均质化细胞准备midRIPA缓冲区(25毫米三pH值7.4,1% NP40, 0.5%钠脱氧胆酸盐,15毫米氯化钠,蛋白酶抑制剂,核糖核酸酶抑制剂,和10 μ米德勤)。西方墨点法对α-突触核蛋白是使用鼠标执行单克隆anti-alpha-synuclein (BD转导实验室)和anti-beta-actin (Chemicon)。墨迹是使用化学发光(皮尔斯)和可视化PhosphoImager (BioRad大力神,CA),和乐队量化使用QuantityOne软件(BioRad)。

 3所示。结果与讨论

在图 1,我们执行一个完整的生物信息学分析 SNCA由电脑仲介预测[5′UTR展示 50的5′UTR) SNCA成绩单折叠成一个独特的RNA抑制循环类似一个iron-responsive元素(愤怒)RNA结构有关,但不同于,H-ferritin和应用5′UTR-specific IREs [ 33]。我们正在测试与desferrioxamine胞内铁螯合能力,抑制神经 α - - - - - -通过愤怒-核蛋白翻译行动的5′UTR记录,作为应用,我们报道铁蛋白mrna ( 42, 51]。

(5′UTR) 5′端非翻译区帕金森病的α-突触核蛋白( SNCA成绩单是同源iron-responsive元素(愤怒)H-ferritin mRNA。(一) 上面板: SNCA5′UTR由exon-1和exon-2编码 SNCA基因,可以另外拼接生成exon-1 / 2记录更短或更长的exon-1′2记录( 58]。 底板:进化的对齐 SNCA相对于人类的序列和5′UTR CAGUGN循环/剪切位点序列[ 33]。我们量化的同源性 SNCA拼接。结的5′端非翻译区(b) RNA /褶皱计算机程序的预测RNA抑制循环 SNCA5′UTR序列( Δ G = 53 千卡每摩尔)。人类的 SNCA干细胞循环类似于经典的愤怒RNA茎环(5′CAGUGN3循环主题),控制iron-dependent L -和H-ferritin翻译和转铁蛋白受体(TfR) mRNA的稳定性。茎环从5′utr预测了几个品种的折叠,在材料和方法部分,所述和pseudotriloop AGU的红色字体描述了H-ferritin愤怒的顶点( 59),类似AGA从APP愤怒被描述 50]。人类的 SNCA信使rna展出一个AGU的triloop,而在较低的脊椎动物,这AGU的主题是位于干地区的这些记录。显示是拼接的安排网站和5′UTR结构 SNCA, SNCB, SNCG信使rna。 列表:第一个表显示了在每个外显子IRE-like域之间的同源性的α-突触核蛋白同行相比在不同哺乳动物物种。第二个表显示了5′未翻译区之间的同源性 SNCA应用程序和铁蛋白L -和H-chains。这些数据强调我们识别cotranslational镇压应用和α-突触核蛋白的小分子,如phenserine和posiphen。

Posiphen phenserine减少应用程序和 α - - - - - -在多巴胺能SH-SY5Y细胞-核蛋白水平剂量依赖性。面板:5′utr的 应用程序和 SNCA基因是50%同源愤怒H-ferritin mRNA。面板B: SH-SY5Y细胞治疗浓度范围从0到10 μM phenserine posiphen 48 h。收获细胞溶解产物被准备。定量西方墨点法建立了反 α - - - - - -syn posiphen和phenserine (IC的效果50< 5 μ米);标准化后 β肌动蛋白(多个车道(微 n = 8 由ImageQuant))。细胞生存能力的影响(以标准化ATP水平/细胞(Tm (Cell-Titer-glo Promega, Inc .)))。

Posiphen是α-核蛋白的立体定向抑制剂5′UTR-directed翻译。瞬时转染的化验 SNCA5′UTR-pGL3构造(H2A细胞株)。Posiphen是高度选择性抑制剂(10 μ米)的 α 5′-核蛋白UTR-driven荧光素酶报告基因的表达。这种立体异构体的phenserine抑制 α 5′-核蛋白UTR-driven荧光素酶表达神经细胞( SNCA5′UTR-positive转染神经细胞( N = 7 ))。相比之下,phenserine和已知APP-specific翻译9号拦截器不抑制α-核蛋白5′UTR-conferred翻译H2A细胞。Phenserine和应用拦截器9号增加 SNCA5′UTR-conferred翻译。这些数据支持作用机理posiphenα-核蛋白的高度选择性阻断剂5′UTR活动,而phenserine (posiphen相同的化学结构但立体异构体)以前显示选择性地抑制5′UTR翻译的应用。

posiphen的选择性抑制翻译由α-突触核蛋白5′UTR序列:第二组posiphen(10的瞬时转染实验 μ米)选择性地抑制α-突触核蛋白5′UTR-conferred荧光素酶表达SH-SY5Y神经细胞( SNCA5′UTR-positive转染子( N = 6 ))。确认选择性,posiphen增加荧光素酶表达pGL3-transfected SH-SY5Y细胞(* * pGL3-SH-SY5Y作为实验控制,因为这些细胞转染与pGL3 H2A构造是一样的,但缺乏 α -核蛋白5′UTR)。

在以前,RNA-directed抗胆碱酯酶药物phenserine,连同其cholinergically惰性手性对映体(+),posiphen,广告都是在临床发展,显示出治疗限制大脑 β野生型和AD小鼠模型( 46]。这个动作是调解,在全部或部分,通过降低的速率的综合应用,一个 β是proteolytically裂解。在这里,我们试图证明phenserine posiphen,同样,屏蔽 α - - - - - --核蛋白表达通过相关的5′utr、编码iron-responsive元素的变体版本RNA可能iron-regulatory蛋白结合的元素。

阐明我们的定义目标是否会翻译跨物种,我们提供了一个进化的结果评价愤怒RNA茎环的保护 SNCA信使rna,如图 1。这是RNA二级结构序列,应用5′UTR,针对性的phenserine posiphen,如图 2- - - - - - 4。alpha-synuclein-specific愤怒阻止循环形成接头连接的前两个外显子 SNCA基因( 35]。我们还比较了预测的结构 SNCA信使rna的愤怒与规范化IREs H-ferritin应用记录,这是转录从单一基因第一外显子确认平移镇压的独特性 SNCA通过它的5′UTR mRNA。

胆碱酯酶抑制剂phenserine及其(+)对映体,posiphen,证明应用5′UTR介导药物与已知药物动力学在啮齿类动物和人类和确定目标浓度( 46, 52]。因为我们预期这两个特工活跃在限制 α - - - - - -通过5′UTR -核蛋白翻译,我们有上升FDA图书馆posiphen和phenserine当我们以前反对的筛选 SNCARNA 5′UTR目标( 34]。在这里,我们确认posiphen和phenserine压抑 SNCA5′UTR-driven翻译稳定细胞的荧光素酶报告行。他们的抑制能力 SNCA信使核糖核酸的翻译定义的某些其他类似FDA药物先导物,包括三种苷和免疫抑制剂,霉酚酸(二级铁螯合剂),正如我们之前报道( 34]。

在图 2(一个),5′utr应用和 SNCA也显示40%的同源性,同源性50% H-ferritin mRNA的愤怒。多个因此进行免疫印迹实验确定posiphen相比phenserine限制的影响 α - - - - - -syn相比应用表达式。在这方面,SH-SY5Y细胞治疗与化合物浓度48小时从0到10 μm .可行性研究确定,这个范围是耐受性良好,与之前的研究一致。一般来说,如图 2 (b),posiphen(除了但可能更有说服力地比phenserine)水平的下降 α - - - - - -syn剂量依赖性的方式在培养神经细胞(SH-SY5Y)作为应用程序之前报道。这更高的效力是否会转化为初级神经元和 在活的有机体内是一个未来的研究的焦点。在这篇文章中,这是通过初步决定集成电路50在5的顺序 μ米,没有毒性。

多个SH-SY5Y瞬时转染细胞进行构造,要么翻译荧光素酶由48基础SNCA 5′UTR ( SNCA5′UTR-pGL3)或空pGL3表达载体(数字 3和 4)。如图所示(图 3和 4),posiphen 50%压抑 SNCA5′UTR-conferred荧光素酶记者成绩单的翻译。在这方面,posiphen证明一个高度的选择性抑制剂 SNCA5′UTR驱动活动因为这手性纯化合物抑制 SNCA5′UTR-driven荧光素酶表达H2A神经细胞(即, SNCA5′UTR-positive稳定转染神经细胞)。相比之下,phenserine和已知的应用翻译杀杀杀,化合物9号(包括比较器),没有压抑 SNCA5′UTR赋予翻译H2A细胞。事实上,phenserine和复合数9升高 SNCA5′UTR-conferred翻译。

这些数据支持posiphen作为高度选择性阻断剂的作用机理 SNCA5′UTR活动。然而,phenserine-with相同的化学结构,但在不同的三维(手性)配置曾被证明能够有效地抑制翻译由APP 5′UTR posiphen在显然有不同的行动 SNCA5′UTR。从这,我们可以推断出的元素 SNCA5′UTR posiphen有立体定向的目标组件。此外,因为phenserine降低 α - - - - - -syn水平(图 2 (b)),进一步 SNCARNA序列很可能参与控制的途径 α - - - - - -syn平移的监管。

扩展转换神经细胞株之外,主要的神经元 野生型老鼠和PAC SNCA转基因小鼠(PAC-Tg SNCA)为posiphen镇压的能力进行了评估 α - - - - - -syn表达式,如图 6在100纳米药物浓度(测试)。Posiphen证明不仅积极和良好的耐受性SH-SY5Y细胞不断减少人类 α - - - - - --核蛋白表达在初级神经元(E18)剂量低至1嗯(减少75%,未显示)没有毒性。这个保证金似乎大于低应用生产能力(20%)(用作积极控制)在这些相同的细胞(数据没有显示)。

口服后posiphen啮齿动物,狗和人类,化合物代谢过程和生成相同的代谢轮廓在这些物种。具体来说,通过第一阶段的新陈代谢,posiphen经历去N1和N8位置生成各自的主要代谢产物,N1-norposiphen和N8-norposiphen(图 5)。每个经历进一步去生成常见的代谢物,N1, N8-bisnorposiphen。与phenserine posiphen缺乏胆碱酯酶抑制活性,因此,可以方便地管理临床剂量更高(在5的顺序,八大)。

代谢类似物posiphen和各自的抗胆碱酯酶活动的 60]。Posiphen是缺乏抗胆碱酯酶的活动。然而,它的第一阶段代谢物,N8脱甲基,N1脱甲基,di-demethylated N1, N8-bisnorposiphen显示 体外疼痛和BChE抑制活性的临床意义 61年, 62年]。复合N8-bisnorposiphen证明没有疼痛的活动。这个活动已经被证明是剂量限制在人类安全性研究。

抑制百分比 α - - - - - --核蛋白/ APP posiphen相比之下,其代谢类似物在初级E18神经元(来自PAC-Tg ( SNCA)老鼠)。微和定量的相对水平 α - - - - - -synuclei n/应用程序从西方墨迹图( β肌动蛋白标准化)治疗后主要神经元posiphen和其三个代谢类似物在100纳米浓度48小时。

翻译的典范镇压的α-突触核蛋白的成绩单与RNA抑制因子相互作用的蛋白质。在经典的翻译镇压模型中,Iron-regulatory蛋白1 (IRP1)控制铁铁蛋白L -和H-chains依赖表达式。通过类比、phenserine posiphen及其代谢类似物将预测增加抑制因子作为RNA结合蛋白与药物治疗后的SNCA 5′UTR。这应该禁止40 s核糖体的5′UTR SNCA mRNA降低翻译。

如图 5,具体N-demethylated代谢物(尤其是N1-nor和N1, N8-bisnorposiphen)具有潜在的临床相关的集成电路50值抑制乙酰胆碱酯酶(疼痛)。此类活动小于phenserine和将有一个缓慢的开始与时间有关的新陈代谢posiphen生成它的代谢物。然而,关于行动 α - - - - - --核蛋白表达、活性代谢物的这一目标,posiphen有力,可以有效地提高和延长药物的 在活的有机体内功效。阐明这个援助计划为未来的动物研究中,我们为特征的相对能力posiphen代谢类似物的影响 α syn表达式(图 6)。

图 6免疫印迹分析代表三个实验表明相比posiphen的功效与它的三个主要代谢产物的限制 α -核蛋白表达 体外使用E18主要从人类大脑皮层神经元 SNCAPAC老鼠。我们能不断的测量 N1-norposiphen(拥有疼痛活动)被证明是最有效的限制 α - - - - - --核蛋白表达(50%),同样,应用表达式也减少了。为评估在图100海里 6,其他的代谢物被证明是不活跃在这些目标,表明相对较小的结构变化(即。,一个甲基的损失一部分)产生重大影响。每个代谢物的剂量反应评估是未来研究的重点,特别是在实现临床范围内的人类和代理 在活的有机体内在动物模型(玛丽亚Maccecchini博士和罗伯特•努斯鲍姆博士个人通信)。

 4所示。结论

我们之前报道,phenserine(-)毒扁豆碱类似物和抗胆碱酯酶,达到三期临床评估广告( 53- - - - - - 55),抑制应用翻译尽管它的5′UTR [ 56, 57]。Phenserine被发现剂量限制的疼痛抑制作用,引起震动的古典胆碱能作用在人类在动物模型和恶心。Posiphen, phenserine纯(+)手性对映体,相比之下拥有没有直接抗胆碱酯酶的活动,同样,压抑的神经AD-specific应用翻译通过5′UTR老鼠。它最近被开发(QR制药公司,董事PA)诊所作为广告应用合成抑制剂降低两个大脑 β一代以及其他有毒蛋白水解的产物应用的水平。与一个非常不同的药理学和药代动力学phenserine,它最近完成了单身,multiple-dose升级阶段我在人类临床评估,出现耐受良好,证明机制的研究,表明目标订婚。

在本文中,我们展示了在人类不朽的神经元的文化,然后 体外从人类在初级皮层神经元 SNCA基因小鼠模型, posiphen作为一个安全的5′UTR-directed抑制剂的毒性 α - - - - - --核蛋白。最终的验证 SNCA5′UTR目标是通过不变 β-核蛋白( β-syn)和 γ -核蛋白( γ - - - - - -syn)表达,是当前研究的焦点。重要的是,我们认为关键的主要代谢物posiphen,同样,低 α - - - - - -syn表达式,并可能因此增加posiphen的行为在动物和人类研究这一目标。

进一步的兴趣,我们建立了phenserine同样有效地减少 α - - - - - -syn水平通过不同的机制,但达到这posiphen相比,可能通过其他元素相互作用的5′UTR甚至3′UTR,从而突出目标小结构活性变化的敏感性。这些研究另外说明 α - - - - - --核蛋白和Aßpathomechanisms可以通过交互的两个收敛amyloidogenic蛋白( 38- - - - - - 40),尽管Aß和 α - - - - - -syn很少在淀粉样沉积物硝唑( 41),但提供的证据表明,药物只针对一种疾病可能在另一个治疗的潜力。

在这方面,我们注意到,有50%的序列相似性的5′utr的应用 SNCA基因。因此我们预测的频谱重叠药物会抑制应用mRNA翻译通过其5′UTR与抑制 α - - - - - --核蛋白,突出特别是phenserine和posiphen(初步集成电路50值5的顺序 μM和更少)。在未来的研究中,我们的目标是描述反 α - - - - - --核蛋白posiphen类似物的功效除了代谢类似物和其他化合物主要神经元和建立 在活的有机体内最有效的效果 SNCA5′UTR翻译阻滞剂。

 确认

作者感谢教授罗伯特•努斯鲍姆博士Yien-Ming郭(UCSF)为他们PAC-Tg (SNCA)老鼠。这项研究支持(我)j·t·罗杰斯由迈克尔·j·福克斯基金会小说奖,药物发现国家老化研究所的R01 AG20181,研究所R21NS059434,阿尔茨海默氏症协会天顶奖09 - 131352和ISOA (ii) n h·格雷格校内研究项目,国家老龄研究所,国家卫生研究院(iii) i Cantuti-Caselvetri:麻省总医院/莫里斯•尤德尔PD研究卓越中心(NIH NS38372)和APDA先进MGH帕金森研究中心,由国立卫生研究院和c·m·卡希尔(iv) HD012437 29 s - 1。

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