人类α-突触核蛋白A53T-A30P突变对SVZ的影响和当地嗅球细胞增殖在转基因帕金森病大鼠模型

文摘

转基因雄性sd大鼠中轴承A30P A53Tα-核蛋白(αsyn)人类变异生成酪氨酸羟化酶启动子的控制下为了得到更好地理解人类的角色αsyn突变的神经病理事件参与帕金森病(PD)的发展。这只老鼠嗅显示赤字没有观察到的运动能力损伤最早期PD的案例。为了研究突变的作用αsyn细胞增殖,我们专注于subventricular区(SVZ)和嗅觉灯泡(OB)增殖的变化可能影响OB函数。对OB多巴胺能神经支配的影响进行了研究。人类的αsyn硝唑在TH-positive OB神经元。没有人αsyn SVZ的可视化。显著增加居民在肾小球细胞增殖,但不是OB和SVZ的颗粒层被观察到。TH神经支配是显著增加肾小球内层没有增加肾小球的大小。我们的老鼠可能是一个好的模型来调查人类突变的作用αsyn的发展嗅觉赤字。

1。介绍

帕金森病(PD)是第二个最常见的神经退行性疾病。主要特点是进步和大规模的亏损在黑质多巴胺(DA)神经元致密部(SNpc),这导致一些临床运动症状如失去活动能力,刚度和静止震颤(1,2]。这些伴随临床的分子途径改变仍然模糊,但相信它可能由于环境因素,遗传原因,或两者的结合3]。第一个发现参与疾病的基因α-核蛋白(αsyn)基因。负责常染色体基因的突变是优势种形式的PD (4,5]。事实上,三个错义突变αsyn基因被发现在病人的家庭:A30P, A53T, E46K [4,6,7]。Alpha-syn有增加倾向总由于其疏水性nonamyloid -β组件域和纤维的存在αsyn路易身体的一个主要的结构部件,帕金森病的病理特点,表明聚合的作用αsyn疾病发病机理(8]。Alpha-syn是一个本地的突触前蛋白的作用划分,存储和回收的神经递质。这是参与的生理调节某些酶如酪氨酸羟化酶(TH)和增加多巴胺转运蛋白分子的数量1]。相反,它是活动的差别与对这些水泡单胺transporter-2 (VMAT-2)。

为了更好地理解的影响αsyn突变在帕金森病的神经病理学和进展,转基因小鼠模型生成。然而,主要是由于启动子的选择,变异人类的表达αsyn通常是位于non-DA大脑结构(9- - - - - -11]。此外,当αsyn聚集在SNpc可视化,没有明显的DA神经元细胞损失是注意到尽管电动机赤字观察(1,11- - - - - -15]。

这些转基因小鼠模型更适合研究整个大脑α-synucleinopathy比调查的确切作用αsyn DA结构,因此寻找更好的PD动物模型。因此,大约十年前,Lo比安科et al。16和山田等。17)表明,慢病毒载体表达野生型或人类A30P和A53T形式的变异αsyn注入老鼠SNpc诱导,在转基因小鼠模型相比,选择性nigral DA神经元的损失,纹状体以及重要的DA去神经运动障碍(18]。这些研究表明,老鼠有特殊的敏感性SNpc DA神经元αsyn,但这个新模型PD缺乏进步的自然在人类疾病的观察。根据先前的研究,我们生成一个轴承A30P和A53T转基因老鼠αsyn人类突变(19,20.)为了得到一个更好的理解的人类αsyn作用在神经病理事件参与了疾病的进展。在鼠标,A30P突变形式(21)或A53T突变形式(22的αsyn显示神经发生减少肾小球和颗粒层的嗅觉灯泡(观察)。这就是为什么目前的研究集中在subventricular区(SVZ)增殖和OB本地扩散。SVZ的变更和地方OB扩散也可以影响OB功能,因为大多数时候,嗅觉减退先于临床运动症状帕金森病(23]。

在成年人的大脑,神经干细胞的前部分SVZ产生成神经细胞,沿着吻侧迁移流迁移到OB (24]。颗粒细胞和肾小球层内的OB,祖细胞持续增殖活动是观察到的24]。然后,细胞分化成功能性颗粒gaba ergic和periglomerular DA嗅觉中间神经元。

总而言之,我们调查的影响人类双重A30P和A53Tαsyn突变SVZ和地方OB扩散与额外关注OB DA神经支配(25]。

2。材料和方法

2.1。代的转基因人类A53T和A30Pα-核蛋白老鼠

转基因构建pUTHTV嗯²αsyn(图1)是由田生et al。14),请给出了H。费德洛夫(纽约罗彻斯特大学)。短暂,转基因是由A30P A53T双突变形式的人类αsyn的控制下老鼠酪氨酸羟化酶(TH)启动子。当前的基因转移方法,显微镜下注射,广泛用于生产转基因小鼠,成功获得转基因老鼠。的显微镜下注射雄性sd大鼠中ovocytes到雄性原核生成的INSERM UMR643转基因鼠常见设施(法国南特)和由genOway公司(法国里昂)。本研究进行的3转基因鼠线生成,马转基因鼠线。

所有的实验都是按照规定进行南特大学的动物卫生委员会。

2.1.1。嗅觉的分析,修改勒马森从et al。26)和粗大运动运动

习惯后,动物被每月一次的开放领域仪器(毫米)配备红外光束和连接到一台计算机来分析运动和时间花在迷宫的四象限两分钟时间(Imetronic、贝、法国)。在一个角落里,一个滤纸(毫米)位于10厘米的高度,是浸泡在新鲜的椰奶(一半在蒸馏水稀释;表du Monde,勒克莱尔公司法国)。椰奶是一个非常有吸引力的老鼠的气味。相反的角落,同样大小的纸过滤器是浸泡在蒸馏水,视为中性气味。老鼠在角落的时间记录下来。结果表示为时间的比率在角落里的椰奶滤纸/所花费的时间与蒸馏水滤纸在角落里。更高的比率(即。,米ore time spent in the corner with the coconut milk filter paper) demonstrates that the animal was able to smell the odor of the coconut milk. During habituation and olfaction testing, the animals were studied for locomotor impairments by a hidden observer. Five animals were used in both groups. The day before the first olfaction testing, the rat is placed in the apparatus (without filter paper) for 30 min. During olfaction testing, the rat is recorded to examine if there was any gross impairments in the motor pattern.

2.1.2。横向步进运动测试和启动

每个动物都定期系统地处理前几天第一次评估。简单地说,在这个测试评估运动的起始,实验者坚定暂停了老鼠的后腿,限制它的前肢,虽然老鼠支持它的重量前肢。然后,实验者把老鼠沿着表5秒(0.9)右侧肢体,连续三次每会话。然后,老鼠的左爪经历相同的测试。所有的会话(左和右)记录允许调整步骤的数目统计的一名调查员盲鼠的状态(即。、转基因和野生型)。对于每个会话(左和右),总分计算的平均数量的调整步骤中观察到的三个测试(右和左爪)。然后数据从左和右是平均每个动物提供一个值。数据是每组平均值。

2.2。BrdU注入

5野生型(WT)和4组转基因雌性的雄性sd大鼠中牺牲在25个月大的时候。在那样的年纪,转基因老鼠表现出严重的嗅觉赤字。为了标签增殖细胞,BrdU(100毫克/公斤)是在连续5天每天腹腔注射一次,最后注入动物牺牲5小时后。这个协议的目的是检测局部扩散而不是神经发生变化在当地OB扩散可以参加嗅觉变化观察到我们的转基因老鼠。

2.3。组织准备

所有的动物都深深地麻醉Rompun /氯胺酮(1毫升/公斤坜)和冰冷的4%多聚甲醛灌注transcardially磷酸盐缓冲(PB)。大脑被迅速删除,在相同的固定剂浸泡24小时在4°C和存储在15%蔗糖PB 48小时,然后在30%蔗糖为额外的24小时。大脑被冻结在−40°C异戊烷(Prolabo、Fontenay-sous-Bois、法国)。通过整个大脑串行sixteen-micrometer-thick日冕部分被剪掉了在低温恒温器(徕卡,3050 CM),然后收集gelatin-coated幻灯片。

2.4。免疫组织化学

大脑部分与PBS彻底清洗前免疫组织化学标记。然后他们被贴上TH抗体识别含有儿茶酚胺的神经元(1:1000;Pel-Freeze,布朗鹿、WI),对人类-αsyn神经元表达人类的特征αsyn (1: 500;表达载体,Cergy Pontoise、法国)和BrdU量化增殖细胞(1:200;美国BD)。一段6串行部分是为每个免疫组织化学染色标记。

简单地说,治疗后与H₂O₂一夜之间,3%在PBS,部分被孵化的稀释主要抗体。然后,部分是沉浸在1:500稀释的二级生物素化的抗体(杰克逊ImmunoResearch实验室、西树林、PA)。然后部分被转移到一个Vectastain ABC Kit / PBS 1小时(向量实验室,Burkingame, CA);3,3 diaminobenzidine担任色原体在随后的可视化反应。

双免疫化学标签和共焦的可视化和人类α使用syn, immunofluorescent二级抗体(anti-mouse免疫球蛋白alexa568;表达载体,Cergy Pontoise、法国和anti-rabbit免疫球蛋白FITC;JacksonimmunoResearch实验室、西树林,PA)。

对于BrdU免疫组织化学,我们使用一个DNA变性方法包括在前30分钟孵化37°C 2 N盐酸在PBS紧随其后的第二个孵化0.1硼砂,pH值:8.6为30分钟。

美国圣路易斯Thioflavin T(σ)是用于检测淀粉样蛋白结构蛋白质。Thioflavin T是一个试剂,成为淀粉样原纤维强烈荧光在绑定。在PBS 3洗后,大脑部分都沉浸在1:500稀释TO-PRO-3(表达载体,Cergy Pontoise,法国)在红色标签胞体。然后部分被孵化1小时thioflavin T(0.04%)在甘氨酸溶液(50毫米)。

2.5。量化过程

2.5.1。增殖的细胞

在SVZ BrdU量化的阳性细胞,一个矩形(毫米)是在结构和所有染色细胞(清晰可见阳性细胞核)指望每个部分总共10等距的部分前囱水平1.70−0.40毫米。这10个值的均值(每节一个值)计算每动物为最后一个值。

得到无偏的估计的密度BrdU OB颗粒内阳性细胞和肾小球层,我们使用了解剖器原理和随机系统抽样(27]。墨卡托体视学分析软件(Explora新星,拉罗谢尔,法国)被用来执行无偏stereological项BrdU阳性细胞。客观的量化,一条线是在各个部分的粒状或肾小球层(12节的12种不同rostrocaudal水平右和左大脑)。观察者是盲鼠群。细胞数40 x客观(NA, 0.85)使用Eclipse E600尼康显微镜(日本东京)机动阶段(,)。随机和系统计算帧(μ200年m广场,定期间隔μ米)使用(28]。画面中只有BrdU阳性细胞数在部分(16-um串行部分,每六个部分)。BrdU阳性神经元被定义为一个清晰可见BrdU-immunoreactive核。

两层BrdU阳性神经元的总数也使用公式计算,在那里BrdU阳性神经元的数量的层,的总体积层,是单位体积的神经元数量计算,然后呢是神经元的数量单位体积的计算。总额的平均每组内的颗粒细胞和肾小球层统计分析。

全球体积估计的肾小球层和颗粒细胞层(即没有偏见。,without systematic error) from the profile areas of the cut sections of the glomerular and granular cell layers. An unbiased estimate of each layer’s volume was done using Cavalieri’s principle. Accordingly, we multiply the sum of the profile areas of each layer on all sections (regularly spaced) with the distance between the sections [29日]。与=和概要文件的地方间距,间距部分= 16μ(部分厚度)6(每六个部分)。所有动物的总量的平均值被计算。

2.5.2。OB TH免疫反应性

衡量肾小球内TH免疫反应性层的宽度在产科医师进行。首先,OB是分为3个相等的部分,从前面到后面轴(给3值:一个前(在前囱6.7毫米),一个内侧(在前囱6.2毫米),和一个后(在前囱5.7毫米)),每个部分包含4 TH-stained部分的间隔16微米(总数为12个部分为整个OB)。然后,对于每一个动物,这12个日冕部分可视化使用X4放大的光学显微镜(Eclipse E600尼康,日本东京)。TH染色的宽度对应于TH神经支配测量每节在3背腹水平(背、中位数和腹侧的水平;参见图4)左和右OB使用ImageJ软件(National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达)。然后左右措施这三个背腹侧的水平获得了每个部分都加在一起从每个3和4的值的均值前后OB水平下计算了给最后一个值/动物的前部OB,最后一个值/动物的内侧部分OB和最后一个值/动物后OB的一部分。

2.5.3。肾小球的面积

衡量肾小球的面积的OB进行12 TH彩色日冕部分(从前囱6.7毫米到5.7毫米)3转基因和野生型动物使用ImageJ软件(National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达)。为了执行这种量化调查如果肾小球面积的变化与不同的肾小球层TH神经支配两组之间的模式动物。总共45至50每动物肾小球测量领域。七个区域间隔任意用于排名肾小球每大小:0 - 4330μ米²;4331 - 8660μ米²;8661 - 12990μ米²;12991 - 17320μ米²;17321 - 21650μ米²;21651 - 25980μ米²;25981 - 30310μ米²。数据被表示为肾小球的百分比为每个区域间隔为每一个动物。

2.6。数据的统计分析

从行为结果表示为均值±SEM分析采用方差分析和Mann-Whitney。数据从BrdU标记的SVZ OB,肾小球TH神经支配的OB和肾小球面积表示为±SEM。BrdU-positive细胞的密度和数量和宽度的肾小球TH神经支配使用Mann-Whitney统计进行分析测试(单侧;棱镜;图垫4.0软件、钙、美国)。

3所示。结果

3.1。代A30P A53Tαsyn转基因鼠

使用转基因建筑从田生et al。((14),见图1),3行转基因老鼠表达A30P和A53T突变形式的人类αsyn基因的控制下启动子已经生成。然而,只有2创始人能够传输几代的转基因后代的特点是PCR(没有显示)。马线的特点是1或2转基因拷贝在我们目前的调查。

3.2。调查的嗅觉

在空旷的田野,习惯化模式是相同的两组老鼠的(没有角落偏好)。嗅觉测试期间,WT老鼠的气味所吸引的椰奶和花更多的时间在角落里的椰奶滤纸相比与蒸馏水的角落。2的比率表明,老鼠花了两倍的时间访问的角落椰奶比蒸馏水的角落。相反,转基因动物明显花更少的时间在角落里和椰奶的比例1对应于同期时间的角落。因此,转基因动物嗅觉障碍相比,WT动物(图1 (b))。这个障碍从6个月大的时候保持稳定。

没有观察到总运动模式的转换在习惯和嗅觉测试两组动物之间。

3.3。横向步进试验

之间无显著差异,观察运动开始在WT和Tg老鼠从14到18个月(图1 (c))。总运动观测结果在嗅觉的调查被证实在老年大鼠外侧测试。

3.4。免疫组织化学

分布的人类αsyn蛋白质和DA-labeled细胞/流程OB和SVZ被免疫组织化学调查评估。所有转基因马大脑表达了人类αsyn蛋白质标记在OB(图2(d))。酪氨酸羟化酶和人类αsyn疣状只检测到OB肾小球层(数据2(一),2(b),2(c)和2(d))的转基因老鼠(同样的位置在WT TH染色观察动物,人物2(a))。使用合并荧光TH和更高的放大倍数αsyn染色显示比大多数的TH阳性神经元的OB肾小球层还表达了人类αsyn(图2(e),2(f)2(d))。比人类共焦分析确认αsyn和TH分子与位于相同的单元中身体细胞扩散和过程αsyn染色模式。胞体高密度区域包含积极的人类αsyn染色和著名的免疫反应性(数据的过程2(h),2(我),2(g))。此外,使用Thioflavin T染色,发现了大量聚集的蛋白质在细胞内的身体(图2(k))。抗体用于检测人类αsyn被没有任何人类的验证αsyn染色的OB WT老鼠(图2(b))。没有人类syn阳性细胞和TH-labeled细胞内可视化SVZ WT或转基因动物(数字3(一),3(b),3(c),3(d))。

BrdU-positive核观察WT和转基因大鼠SVZ地区(数字3(e),3(f),3(g)3(h))。Proliferative-BrdU-labeled细胞也注意到在OB肾小球(数字3(我),3(k))和颗粒细胞层(数据3(j),3(左))。更少的细胞被指出在WT肾小球层比Tg肾小球层。

3.5。量化SVZ的扩散

我们执行项BrdU免疫反应性的细胞体测量SVZ的水平扩散。无显著差异在BrdU阳性细胞之间的SVZ是指出2组大鼠(数字3(e),3(f),3(g),3(h)和表1)。

3.6。量化OB肾小球内新的生成细胞和颗粒细胞层

OB BrdU注射后,扩散是评估使用无偏体视学。当WT和转基因老鼠相比,无显著差异在居民数量激增的密度细胞颗粒细胞层(BrdU阳性细胞的平均密度在转基因组:与WT组:(数据3(j),3(左)和表1)。相比之下,我们观察到的密度显著增加BrdU阳性细胞相比,转基因大鼠的肾小球层WT动物(+ 68%;;数据3(我),3(k)和表1)。分析当地的增殖细胞的总数还显示显著增加只有在肾小球层的转基因动物和WT老鼠(表1)。

没有显著的变化观察肾小球和颗粒层的体积(表2组之间的动物1)。

3.7。量化的DA在肾小球层神经支配

分析DA OB(图中神经支配4),TH阳性区域的宽度在肾小球层就是TH immunolabeling测量每节在3种不同的前囱水平(前(6.7毫米),内侧(6.2毫米)和后(5.7毫米)。全面观察TH神经支配的宽度增加7.9%的转基因鼠相比WT动物。然而,当观察者分裂沿前后轴,只在前囱6.2毫米宽度计算水平显著增加了12.4%在转基因鼠相比WT老鼠(;表2)。

3.8。肾小球的面积

从4330年地区不如肾小球分布μ米²最大面积30310μ米²他们中的大多数有面积由8660年之间μ米²和12990年μ米²。没有观察到显著差异对肾小球的百分比在每个区域间隔,除了间隔越小,更多的转基因肾小球(3.47%)中包含“0到4330μ米²“面积区间为1.40% WT肾小球(;表3)。

4所示。讨论

我们的研究使用αsyn转基因鼠轴承人类A30P和A53T突变TH启动子的控制下。如前所述(19,20.转基因动物显示一些持久的嗅觉赤字和human-mutatedαsyn OB蛋白观察,SNpc和信用证。这是与TH免疫染色(OB摘要所示)这是符合这一事实是转基因的启动子。嗅觉赤字出现电机改变之前的18岁动物并没有呈现任何赤字运动开始。赤字在运动协调出现在19个月大的时候(没有显示)。25个转基因老鼠被用于这项研究的临床和病理表现αsyn突变出现在PD的高龄,一般(22]。酪氨酸羟化酶被用来启动子为了获得人类αsyn合成含有儿茶酚胺的结构。事实上,我们能够观察转基因表达的三个主要含有儿茶酚胺的大脑区域参与PD的课程:OB, SNpc和蓝斑。到目前为止,越来越多的证据表明prion-like传播αsyn骨料中供体细胞和受体细胞(30.]。然而,它似乎并没有在我们的转基因鼠non-TH积极的大脑结构不包含任何人类αsyn分子。然而,我们也不能排除,这个机制没有发生在含有儿茶酚胺的结构,因此转基因的增效作用。

OB是大脑区域的神经突特别感兴趣,因为路易和身体出现在这一领域的早期阶段PD (31日]。这些夹杂物由聚合形成的αsyn与其他组件,如磷酸化神经纤维细丝和泛素(31日]。在PD患者中,我们已经表明,变异人类A53T和A30Pαsyn表达鼠蛋白质聚集在肾小球层表明human-mutated的含义α细胞处理syn的总量,这可能反过来改变当地的OB扩散。

我们的数据显示增生性肾小球细胞层数增加而不是在颗粒细胞层。这里值得一提的是,BrdU协议用于本研究显示当地OB扩散而不是迁移细胞从SVZ OB动物BrdU 5天,最后牺牲了5小时后注射。

有趣的是,冠军et al。32)显示在丽江女Wistar鼠细胞分裂当地代表总数的不到5%的新细胞。BrdU阳性细胞总数的颗粒细胞(8200)和肾小球层(250)比我们更低(分别为16600个细胞和2350个细胞)。这一重要区别数字可以BrdU用于赢家的浓度相关的研究被我们使用的一半,牺牲后注入的时间(2 h和5 h在我们的研究),对动物的年龄(2个月和25个月),可以指出几个细胞颗粒的增加和肾小球层局部扩散由于老化。

没有SVZ扩散的变化引起的两倍αsyn突变。这之后的结果可以解释为没有任何SVZ转基因表达。SVZ的观察是一致的发现Maxreiter et al。21)使用鼠标表达的人类A30P突变形式αsyn,他们没有发现任何SVZ增殖的变化。使用小鼠表达的A30P突变形式αsyn的控制下钙/ calmodulin-dependent蛋白激酶2α(CaMK)启动子21]或表达的A53T突变形式αsyn PDGF-promoter[的控制下22),两组学习OB神经发生发现新生成的神经元的减少肾小球和颗粒层。综上所述,OB神经发生和从我们的调查数据表明,人类αsyn A30P / A53T突变影响新生成的成神经细胞在OB集成/分化以及当地OB增殖。与我们的观察,当然由于他们使用的启动子,赢家et al。22)和Maxreiter et al。21也观察到一些转基因表达noncatecholaminergic结构。一些数据表明,突变α使用prion-like syn可能蔓延传播从细胞到细胞30.]。因此,有可能更“α大脑syn有毒环境”成立于A30P和A53T转基因小鼠的大脑比我们老鼠的大脑。增加当地肾小球层中的扩散,我们注意到在从PD患者的肾小球层协议数据(23]。这以后发现表明,我们的老鼠模型是一个合适的工具论的影响αsyn OB基因突变。

作为增生性肾小球内细胞层被区分在DA神经元24),我们调查了在肾小球层神经支配。我们观察到的宽度的增加肾小球TH阳性区域层没有增加肾小球的大小(小间隔在转基因动物除外)建议增加TH神经支配并不是增加引起的肾小球层区域(如增加肾小球大小会增加肾小球层的大小进而扩大TH神经支配的模式)。这个结果与DA细胞数量增加100%是协议在肾小球层从PD患者23]。虽然机制增强DA神经支配的OB肾小球层还有待确定,各种生长因子发挥重要作用在OB增殖和DA分化可能涉及如BDNF, GDNF,据33]。有趣的是,这一增长在DA神经支配观察转基因鼠和PD患者可以解释,至少部分,嗅觉赤字观察到在我们的老鼠和病人的DA OB有抑制作用。嗅觉减退中可以发现PD患者在疾病的早期阶段。转基因鼠嗅觉测试函数在不同的年龄(从一个星期到25个月大的时候),在6个月大的时候,他们提供了一个改变的嗅觉。多巴胺有一个重要的作用在调节嗅觉信息进入大脑34]。TH神经支配发现只在肾小球层OB (25]。在我们的老鼠,TH神经支配的增加在这一领域可能建议增加DA的释放。DA已知引起嗅觉受体之间的抑制肾小球内细胞和僧帽细胞层(23]。D2受体是最丰富的DA受体亚型在肾小球层(35),参与突触传递的减少34]。DA神经元的增加引起的A30P A53T突变形式的αsyn可能诱发抑郁症突触传递,因此妥协嗅觉的门槛。这条赛道是第一步的过程中最终意识嗅觉,因此对嗅觉的适当功能电路至关重要。数据从活检的患者诊断为PD支持这个想法,嗅觉障碍在PD不造成损害嗅觉上皮但中枢神经病变的结果(36]。因此我们的老鼠可能是一个好的模型来调查人类突变的作用α发展的syn嗅觉赤字。

总之,我们生成了一个人类的双突变αsyn (A30P和A53T)转基因鼠呈现一个改变当地的肾小球层中的扩散但无论是在颗粒细胞层的OB SVZ的也没有。此外,增加DA肾小球层神经支配是注意到,这可能与增加扩散中观察到这一层。进一步调查应该检查时间的嗅觉功能的变化关于改变OB当地的扩散以及阐明的角色增加DA功能嗅觉赤字中我们观察到的转基因老鼠。

确认

作者要感谢公关。h . j .,罗切斯特大学,纽约,礼物的转基因构造,p . Hulin博士,大学的南特IFR26”Plate-forme MicroPICell”使用的共焦显微镜,诉Paille博士刺激讨论无偏stereological程序,和k·d·芬克女士校对。这项研究是在法国基金会(PD)的支持下,法国帕金森(PD), CECAP (CB) INSERM-Region des支付de la卢瓦尔(FL)和Progreffe基金会(INSERM UMR 643)。f . Lelan c·波伊尔·Naveilhan和l . Lescaudron同样贡献了这项工作。

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