文摘

突变LRRK2是最常见的导致帕金森病(PD)的日期,但他们的外显率可能是不完全的,由于所需的其他基因或环境因素的存在疾病的发展。我们分析的存在帕金序列变异(突变或多态性)和外显子的重组LRRK2突变携带者(PD患者和未受影响的亲戚)为了检测可能的修改器影响外显率。8有九杂合的PD患者的家庭LRRK2突变(在380撒丁岛人PD患者存在五种最常见的筛查LRRK2突变)和16个基因调查更多的亲戚的存在LRRK2和帕金突变。没有证据表明存在的病态帕金或外显子突变重组在患者家庭成员的影响。确定了三个单核苷酸多态性(snp)在患者和未受影响,但没有亲戚两组之间的显著差异。这些数据提供不支持假设,这样的帕金一般基因突变可能涉及可能影响外显率LRRK2突变携带者。

1。介绍

在过去的几年里等致病基因已经被鉴定孟德尔形式的PD (1- - - - - -5]。突变富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)基因,最近发现的基因,导致常染色体显性PD (6,7)和代表PD确认到目前为止的最常见原因(8- - - - - -11]。一个完整的了解LRRK2可能会导致PD,对其他已知的PD基因和公认的致病途径,仍然是难以捉摸的(12]。此外,外显率LRRK2突变是不完整的13- - - - - -15),可能由于其他遗传或环境因素的存在疾病的发展所需。先前的发现一个有趣的报道和意想不到的互动LRRK2与帕金,这表明这两个基因之间的直接相互作用引起的帕金森症可能参与一个共同的致病途径(16]。此外,最近的研究帕金突变被发现在一些病人携带LRRK2-G2019S突变(17- - - - - -19),暗示可能二基因的PD继承机制(18]。在这里,我们分析了存在帕金序列变异(点突变或多态性)和外显子重组帕金森病(PD)患者LRRK2突变和LRRK2突变携带者家庭成员没有迹象表明PD为了检测可能的外显率的影响。

2。对象和方法

三百八十撒丁岛人PD病人和二百零八个对照组的主题无关,连续招募从卡利亚里大学的运动障碍中心医院和大学的神经学Monserrato门诊部,筛选存在体内基因LRRK2五种最常见的突变(G2019S、I2020T R1441C / G / H)。渊源者的证据LRRK2突变被确定。随后,这些病人和各自的家庭是临床研究。研究渊源者检查在网站和其他家庭成员招募的渊源者。家庭成员同意接受遗传的分析研究LRRK2突变。此外,在病人和家庭成员,所有的外显子帕金基因分析小缺失,点突变和重组。PD患者实现定义的诊断标准的临床诊断PD的至少三个强制性标准(静止震颤、运动不能和刚度),改善与左旋多巴、不对称发病,排除标准的缺失。机构部门每个参与网站批准了这项研究,并从所有参与者得到书面知情同意。

从外周血基因组DNA提取样品使用标准程序。检测的存在R1441C / G / H (exon31) G2019S,和I2020T(41)外显子突变,样品被放大使用以下引物聚合酶链反应(PCR) ( 来 31):外显子向前:TCTGAAGTCTGCTAGTTTCTC和扭转:CTGACATTTCTAGGCAGTTG;外显子向前41:GAGCACAGAATTTTTGATGCTTG和反向:TTTATCCCCATTCCACAGCAGTAC。PCR反应是在50岁 包含1 x l黄金PCR缓冲,1.5毫米MgCl2, 250年 每个引物2的核苷酸,25 pmoles单位AmpliTaq黄金(应用生物系统公司),和100 ng的基因组DNA。循环条件11分钟 C;30 30秒变性的周期 C;45秒退火在 C外显子和31日 外显子41 C;90 -第二次扩展 C和最后7分钟的延伸 c .上浆后,PCR产品变性并涂抹到Hybond-N +膜(Amersham生物科学)。这些墨迹prehybridized,杂化与[32 p] CTP labeled-probes下面列出的1 h,洗,暴露于柯达西拉的电影。所有的步骤都是在特定的温度和时间。寡核苷酸用于ASOs技术表表示1。杂合的体内基因LRRK2样本变异(R1441C或S2019G)使用特定的内切酶经PCR-RFLP BstUI和SfcI根据制造指南。样品展示R1441 BstUI限制网站的损失是解决通过直接测序确定确切的密码子。使用意识和反义引物测序进行MEGABACE 1000 (Amersham)和分析器v3.0 MEGABACE测序结果分析。

表1
寡核苷酸用于ASOs技术。核苷酸的变化突显出寡核苷酸。

在所有科目来自家庭的存在LRRK2突变,帕金突变分析。所有12个外显子帕金及其intron-exon边界点突变筛查和小删除直接PCR测序。之前使用意识和反义引物测序进行描述(20.]MEGABACE 1000 (Amersham) MEGABACE测序分析仪v3.0和结果分析。

帕金外显子重组也检查了。两个商用探测包,莎莎P051-C1和P052-C1帕金森MLPA工具包(MRC荷兰,阿姆斯特丹,荷兰;http://www.mlpa.com),用于分析。所有外显子的帕金包含在这两个包,和探针序列相同的外显子是不同的两个包之间。所有的25个样品的化验了根据制造商的协议。MLPA治疗后,样本运行ABI 3130 xl基因分析仪检测(应用生物系统公司)- 500年利兹大小标准(应用生物系统公司)根据制造商的建议。数据分析使用GeneMapper软件v4.0(应用生物系统公司)。重复第一次直观地分析了抛弃失败的样本。此后,峰高结果从Gene-Mapper Coffalyser v9软件出口。Coffalyser是一个excel的程序运行在微软Office 2003和MRC_Holland推荐的。Coffalyser宏观数据的归一化后,比较峰值模式获得的参考样本,我们获得样品携带异常的数字拷贝。Coffalyser分析、峰值大小显示正常拷贝数当显示0.7 - -1.3比例与正常对照组相比,删除时显示比例 0.7,再次显示比例 1.3,没有当显示比例等于0。根据这种相关性,一个正常的峰值表示两个基因副本的存在。

统计分析的多态性帕金基因比较PD患者之间LRRK2突变和LRRK2突变携带者家庭成员没有迹象表明PD与费舍尔的精确概率检验。

3所示。结果

八个家庭(6人携带G2019S突变和两个携带R1441C突变)九PD病人杂合的携带者LRRK2突变被确定。这些9例(平均PD发病63.6±10.2年,44 - 77)范围,七个人(5个男人和两个女人)体内基因LRRK2把G2019S替换和两个女性把R1441C替换。疾病近年来影响个体的平均持续时间为8.2±3.5年(范围:1 - 12)。十六岁不影响渊源者家庭成员在家庭与G2019S突变和3 (13 R1441C突变)和平均年龄在考试68.6±9,2年(范围,51 - 83)同意接受体内基因LRRK2分析突变,十人(四个男人和六个女人)被发现是G2019S杂合的航空公司没有PD(表的迹象2)。没有证据表明存在的病态帕金25点突变的任何科目检查,在PD患者或不受影响的家庭成员。三个单核苷酸多态性(snp)是确定的:其中两个snp驻留在intronic序列(静脉注射2 + 25 t C = rs2075923和静脉注射7 35克 = rs3765474),而第三外显子10中的Val380Leu多态性。这些snp被确定的病人和不影响家庭成员(表3)。费雪的精确概率检验表明,每个检测到的等位基因和基因型频率帕金单核苷酸多态性之间没有显著差异的PD患者群体LRRK2突变,不影响家庭成员LRRK2突变。MLPA分析披露没有染色体重排帕金基因在莎莎P051-C1和25例确诊P052-C1截止值之间的比例由。

表2
研究体内基因LRRK2家庭突变。
表3
等位基因和基因型频率分布的三个单核苷酸多态性的帕金体内基因LRRK2基因携带者的突变(R1441C或G2019S)有或没有PD。

4所示。讨论

据我们所知,这是第一个研究试图研究外显率的降低LRRK2突变分析可能的PD继承二基因的机制帕金突变,研究PD患者LRRK2体内基因LRRK2突变和不受影响的家庭成员。家人的检测至少10受试者携带G2019S突变杂合的状态,与附近的考试平均年龄68岁,但是没有任何迹象表明PD,显然证实了以前的观测描述外显率的LRRK2突变低和不完整的13- - - - - -15]。此外,一个完整的了解LRRK2基因突变导致PD,或者它对其他已知的PD基因和公认的致病途径,仍然是难以捉摸的(12]。在这种情况下,体内基因LRRK2的报道互动与帕金16)和几个科目同时窝藏的最近的观察LRRK2和PRKN突变(17- - - - - -19)请考虑潜在的基因之间的相互作用这两个最常见的帕金森症的遗传原因外显率的机制,与基因基因相互作用的典范。虽然前两篇文章研究了这种组合(18,19),他们只集中注意力在发病年龄或进展的残疾,研究PD患者的主要临床发现,没有一个完整的熟悉临床和遗传分析。事实上,第一篇论文(18G2019S突变患者),涉及9和10 R1441G突变(检测351例特发性帕金森病),得出的结论是,三个检测患者窝藏双突变没有出现早期发病年龄或更快的疾病进展的。不幸的是,在这项研究的遗传分析LRRK2突变在这些病人的亲属没有执行。在第二篇论文19,关于138年葡萄牙PD患者,13例LRRK2突变(10渊源者和3影响亲属)被确定和2进行的一个杂合的突变帕金基因。由于这一事实帕金突变在一个家庭没有cosegregate PD和PD发病年龄这两个姐妹有或没有帕金突变是相似的,这些作者认为的存在帕金突变可能是一个巧合的发现,但一个修饰词影响外显率也不是分析,因为在这份报告中其他患者的亲属没有从遗传的角度进行了研究。

不同于这些研究,因此,我们的分析的目的不是为了验证如果患者可能当代的存在LRRK2突变和帕金突变可能存在早期发病年龄或疾病进展的更快,但更准确地说,如果存在这种组合可以PD在这些患者的外显率的影响。在这方面,我们的研究结果不确定的存在帕金点突变、小删除或外显子重组我们的患者LRRK2突变。事实上,我们并没有发现任何致病帕金8的突变在任何学科研究家庭的载体LRRK2突变。此外,我们没有发现任何三个不同的多态性之间的关联帕金基因的外显率降低LRRK2这些家庭的突变,这表明帕金突变通常不参与决定,在这些患者PD的发病机制。我们的数据,连同两个先前的研究(18,19),排除致病的发生帕金体内基因LRRK2突变在大多数PD患者替换。

总之,我们的研究结果不支持假设,帕金一般基因突变可能与可能的修改影响外显率LRRK2突变携带者。