线粒体翻译起始因子3变异可能与帕金森病mRNA水平降低有关

摘要

线粒体功能重要的基因与帕金森病(PD)有关。线粒体翻译起始因子3 (Mitochondrial translation initiation factor 3, MTIF3)是线粒体核糖体上复合物形成起始所需的一种核编码蛋白。MTIF3功能障碍可能损害线粒体功能，多巴胺神经元似乎特别容易受到氧化应激，这可能与PD的退行性变有关。最近在一份德国病例对照材料中报道了MTIF3中的同义rs7669(C>T)与PD之间的关联。我们在瑞典帕金森病例对照材料中调查了rs7669。研究表明，个体基因型或等位基因与帕金森病无显著相关性。当比较合并TT/ ct基因型和cc基因型时，我们观察到显著的相关性(与PD)。我们还证明，与cc基因型相比，tt基因型导致MTIF3 mRNA表达显著下降(）.我们的研究结果支持假设MTIF3可能参与PD的病因。

1.介绍

帕金森病（PD）是第二种最常见的神经变性障碍，影响全球50岁以上的1-2％的人口[1-4.］.一些发现支持线粒体参与帕金森病。

例如，神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-酮氢吡啶（MPTP）的代谢物;1-甲基-4-苯基吡啶（MPP⁺）是一种线粒体呼吸链复合物I抑制剂，并导致大巴胺（DA）神经元的退化在Implica nigra（sn）[5.］.另一个例子是农药旋转酮，其也是一种复杂的I抑制剂，导致啮齿动物的硝基苦参堇变性，类似于PD的病理学[6.］.线粒体DNA（MTDNA）编码两种核糖体RNA（RRNA），22个转移RNA（TRNA）和13个蛋白质。MTDNA编码的蛋白质是负责通过有氧代谢产生能量的氧化磷酸化体系的一部分，而静脉内蛋白质合成需要RRNA和TRNA [7.］.据报道，电子传输链中的复合物I的活性在SN和PD患者中减少了SN和血小板[8.］.某些mtDNA多态性已被报道与PD相关，其他的则可降低风险[9.］.进一步证明PD中的线粒体功能障碍来自PD与DNA聚合酶γ蛋白（POLG）中的遗传变体相关联的报告，这对于MTDNA复制和修复是重要的[10.］.人类POLG蛋白的n端包含一个由cac -repeat编码的短聚谷氨酰胺结构域。据报道，POLG基因中CAG-repeat的罕见长度变异与特发性PD相关[10.］.有条件的敲除小鼠破坏了Da神经元的线粒体转录因子A（TFAM）（“MITOPARK”小鼠）对PD的线粒体参与的假设提供了额外的支持[11.］.这些小鼠中脑DA神经元呼吸链缺失，表现出帕金森样运动障碍，L-dopa可缓解这种症状[11.］.

MTIF3是55S线粒体核糖体起始复合物形成所必需的[12.］.MTIF3的功能障碍可能影响MTDNA编码蛋白的表达，这又可能导致氧化应激。多巴胺神经元特别容易受到氧化应激，这可能是它们在Pd中变性的原因。迄今为止，已建议直接或间接地影响Park Loci鉴定的五种核基因，直接或间接地影响线粒体功能：α.-synuclein, Parkin, DJ-1, PINK1和LRRK2 [13.-15.］.据报道，丝氨酸苏氨酸激酶PINK1基因的突变与park6相关的常染色体隐性帕金森病有关。PINK1蛋白定位于哺乳动物细胞中的线粒体[16.］.PINK1的丝氨酸-苏氨酸激酶结构域和邻位蛋白果蝇黑胶基CG4523有一个300个氨基酸长的同源区。该PINK1同源物与CG11656-PA相互作用，CG11656-PA与MTIF3的哺乳动物同源蛋白最接近，支持MTIF3是PINK1的相互作用蛋白，在PD的病因学中起重要作用的假设[17.］.本研究的目的是分析MTIF3同义多态性RS7669（ASP266ASP，）在德国案例控制材料中的报告与散发和家族PD相关的瑞典PD壳体控制材料[17.］.此外，我们还研究了使用来自PD患者和对照的细胞系的三种基因型之间MRNA表达水平的可能差异。

2.材料和方法

2.1。DNA材料

多态性rs7669 (）在瑞典PD壳体对照材料中研究了MTIF3。每个机构的道德委员会KarolinskaInstitutikkomitténord和哥德兰大学福斯克斯特基·诺斯·诺斯克诺斯（哥德兰堡大学）批准了该研究，每个主题签署了知情同意。所有受试者都是不相关的，瑞典起源。共招募了381名PD患者：211名在卡罗西斯卡大学医院，斯德哥尔摩和170岁的哥德堡·哥德堡（Sahlgrenska Hospital）（样本收集的平均年龄，67.7岁;意味着发病年龄59.3岁; 59.3％）。所有散发性PD患者都满足了特发性PD的“脑银行临床诊断标准”[18.］.对照受试者是献血者，对PD患者的配偶或个人访问斯德哥尔摩非神经系统症状的医院或护理中心（)及哥德堡(）（;样品收集的平均年龄，58.7岁;43.8％的人）。52斯德哥尔摩PD患者和哥德堡PD患者的38名患者的自我报告的家庭历史，具有PD的一种或多种第一，第二或三级亲属。根据标准方案从血液样品中提取DNA。

２.２.焦磷酸测序

为了对MTIF3中的遗传变异rs7669进行基因分型，我们使用了焦磷酸测序，这是一种通过检测一个核苷酸被合并到一个预定义的DNA链时所释放的能量来分析遗传变异的方法[19.］.为了测试基因分型错误，我们用水作为阴性对照，并重新开始随机选择的一些样品以确认结果。已经使用了以下引物序列;前底漆-cgtgctttcagcaaaaatg -，生物素化在-结尾;反向底漆- aaaggactgcagaccaagga -、测序引物- tccttatcattcca -．用Taq聚合酶进行聚合酶链反应(PCR)，然后根据厂家说明书将生物素化的PCR产物固定在链霉亲和素包被的微珠上。将固定化的DNA模板捕获到过滤探针上(PyroMark Vacuum Prep Tool, Biotage AB, Uppsala, Sweden)。用70%乙醇、变性液、洗涤缓冲液冲洗过滤探针，将单链模板退火成反测序引物。所有的溶液都是根据制造商的说明(bitage AB，乌普萨拉，瑞典)制备的。使用psq96系统、SNP软件和SNP试剂试剂盒(Biotage AB，乌普萨拉，瑞典)对样品进行自动测序分析。采用卡方比较各组间基因型分布和等位基因频率(χ²） 测试 [20.］.对对照中的基因型分布用于与Hardy-Weinberg平衡的一致性。统计显着性水平设定为．

2.3。MRNA二级结构的预测

为了评估rs7669对mRNA结构的影响，我们使用公开的在线mfold程序(version 3.2)预测了MTIF3的二级结构[21.那22.］.分析并将多态性两侧的侧翼序列（70个核苷酸）的部分MTIF3 mRNA序列进行分析并与野生型序列进行比较。

2.4。Epstein-Barr病毒转染和人B淋巴细胞培养

使用Ficoll-Paque（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.，Piscataway，NJ，USA），通过标准方案与外周血分离B淋巴细胞。用20％胎牛血清和L-谷氨酰胺（200 mm; Invitrogen，Carsbad，Ca，USA），青霉素 - 链霉素（5000，以20％胎牛血清和L-谷氨酰胺（200mM; Invitrogen，Carlsbad，CA），青霉素 - 链霉素（5000 μ.g / ml;Invitrogen，Carlsbad，Ca，USA），环孢菌素（1 l /毫升;Epstein-Barr病毒(EBV)感染B95-8细胞的上清。培养液每周更换两次，直到细胞系建立，细胞逐渐冷冻保存直到使用C。对mRNA进行量化，将细胞解冻，培养约两周，当细胞数量达到4-5百万时采集细胞。

2．5．定量实时聚合酶链反应

定量实时PCR (qRT-PCR)对来自代表三种不同rs7669基因型(CC、CT和TT)的EBV转染的b淋巴细胞的RNA进行检测。在每个基因型的6个不同个体中，对3个不同基因型的MTIF3 mRNA表达水平进行量化。只根据rs7669基因型选择个体，而不考虑其神经状态(CC基因型:2例PD患者和4例对照，CT基因型:4例PD患者和2例对照，TT基因型:5例PD患者和1例对照)。使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)从ebv转染的b淋巴细胞中分离总RNA，并在260 nm分光光度法定量。从1G RNA通过使用Deoxyribonuclease I，扩增级（Invitrogen，Carlsbad，Ca，USA）和Sybercript III铂两步QRT-PCR试剂盒进行制造商的协议，以及Sybr Green（Invitrogen，Carlsbad，Ca，USA）。使用Sybr Green I Dye（Invitrogen，Carlsbad，Ca，USA）对ABI棱镜7000（应用生物系统，福斯特城，CA）进行QRT-PCR进行QRT-PCR。以靶基因MTIF3（正向引物）以三份含量进行样品（正向引物- ATCGCTTGCCCCAGCAC -;反向底漆- tcatcccagttgatgagg -）和两个家务基因;β-肌动蛋白（正向底漆- AACCGCGAGAAATCATGTTTG;反向底漆- CAGAGGCGTACAGGGATAGCA）和细胞环（正向底漆- gacccaacacaaatggtcc -;反向底漆- ggcctccacaatattcatgc -）.通过监测解离曲线和琼脂糖凝胶电泳证实了单基因产物的扩增。采用ABI Prism 7000 SDS v1.2.3分析PCR扩增图指数期的阈值循环(Ct)。使用qBase v1.3.5将靶转录本的每个Ct值归一化为-actin和cyclophilin [23.]，基于方法(24.］.的在QBASE软件中扩展了方法，包括多个稳定表达的参考基因以改善归一化[23.］.用Student的基因型对3种不同基因型的表达进行定量比较以及。意义水平设定为．

3.结果

3．1.mRNA的基因分型和二级结构

我们在PD病例和控制中发现了RS7669（CC，CT和TT）的所有三种基因型。观察到的控件频率与Hardy-Weinberg均衡（数据未显示）一致。我们的分析显示，任何三种单独基因型或等位基因都没有显着关联PD（表1）.比较TT / CT基因型与CC基因型相比，我们观察到与散发性PD的重要关联（）.与年龄匹配的对照相比，PD发病于50岁或50岁的比较年龄的分层显示，没有基因型或等位基因分布与疾病（可根据要求提供的数据）相关联。

为了测试RS7669的同义胞嘧啶7998替代（ASP266ASP）取代的rs7669改变mRNA的二次结构，我们对MTIF3 mRNA的MFOLD分析。我们的分析表明，外显子5中的RS7669导致mRNA二级结构的表观变化和mRNA折叠（DG）的能量稍高，与野生型mRNA折叠（可根据要求提供的数据）。

3.2。RNA表达

为了进一步研究同义多态性RS7669的可能后果，我们通过使用QRT-PCR测量mRNA表达水平来研究MTIF3基因的转录活性。我们发现MTIF3 mRNA水平显着降低（）与携带TT基因型的个体的细胞与具有CC基因型的个体相比（图1）.来自携带CT和CC基因型的个体的细胞之间没有统计学差异，在细胞之间发现（）.测试两者- 将基因型在一起（TT / CT）与CC相比，MTIF3 mRNA降低接近意义（）.使用Mann-Whitney观察到类似的结果你测试。由于基于其RS7669基因型选择了个体而没有限制其神经状态状态，我们也将从患者与对照的表达数据进行比较，这显示出没有重要的关联（）.

4。讨论

我们的研究结果强化了MTIF3 RS7669变体可以参与散发性PD的病因，因为TT / CT与CC基因型在瑞典样品集中的显着关联。Abahuni等。（2007）先前已经在德国案例控制材料中调查了MTIF3 RS7669多态性，该材料由PD阳性家族病史以及散发病例组成的患者以及散发病例[17.］.之前的研究发现，TT / CT基因型与散发性PD（），而我们的数据集的结果显示了一个重要的关联（）.有趣的是，Abahuni等人。（2007）显示CT基因型增加和散发病例中的TT基因型减少（在组合样品中（）与对照相比。

RS7669变体可能是连锁不平衡，其其他真实疾病导致MTIF3中的遗迹或在其附近的其他基因中，并且该基因座可能与伦理群体之间有所不同，尽管据报道没有其他已知的MTIF3多态性与RS7669的联系不平衡在CHR13：26,907,7​​80-26,922,711上。这两项研究的结果是相反的，并且可能会通过从不同国家收集两个样本系列，并且在协会中可能存在较小的背景效果，尽管这不太可能像我们的研究和前一个一样报告类似的等位基因频率在Hardy-Weinburg均衡。

迄今为止，MTIF3和PD的唯一两个遗传研究是Abahuni等。（2007）和本研究。我们的结果表明，TT / CT基因型在散发性PD病例中可能更常见，而不是对照，强化线粒体功能障碍在Pd中的累积。我们还可以表明，与来自携带CC基因型的个体的细胞相比，来自携带TT基因型的个体的B淋巴细胞含有显着更少的MTIF3 mRNA（）.这表明TT基因型影响MTIF3 mRNA水平，尽管不能完全排除具有这种基因型的个体也携带影响mRNA水平的额外遗传变异。通过将样品除以患者并对对照而不尊重其基因型，我们表明MTIF3 mRNA表达的减少不是由于PD（）.同义多态性易于疾病的机制尚不清楚，但已经提出了几种可能性，包括它们可能影响mRNA转录活性，mRNA稳定性，次级mRNA结构或在蛋白质水平，合成，折叠，以及转换或功能[25.］.我们进行了结构分析在网上为了研究MTIF3中的同义多态性RS7669是否可以诱导次级mRNA结构的改变。我们的研究结果表明，RS7669导致MRNA二级结构的改变，并且多态性具有影响折叠和mRNA稳定性的可能性。然而，没有强烈的结论可以从用于建模二次结构的人工条件中得出在网上．

5.结论

总之，我们发现MTIF3的一种遗传变异与瑞典的散发性PD有关，支持线粒体参与疾病。我们还证实了TT基因型导致MTIF3 mRNA表达降低。进一步的遗传学研究需要更大的材料来证实这些遗传学发现。还需要在细胞水平上对MTIF3蛋白进行研究，以了解MTIF3水平的改变可能影响功能的细胞位点。

致谢

这项研究得到了瑞典研究委员会、瑞典大脑基金会和Hållstens Forskningsstiftelse、卡罗林斯卡学院基金、瑞典帕金森基金会、瑞典大脑力量、Magnus Bergwalls Stiftelse、Åhlen的基金会以及通过SLL和VGR资助的alf的支持

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