帕金森病

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体积2010年| 文章的ID190450年| https://doi.org/10.4061/2010/190450

神经保护和功能恢复与减少小胶质激活mGluR2/3受体的选择性激活后在帕金森病的啮齿动物模型

休•陈,¹ 海伦包,¹ 安东尼·c·弗农,^1、2 维吉尼亚Zabarsky,¹ 克里希纳p Datla,¹ 马丁·j·裘槎,¹ 和大卫·t·德克斯特 ¹

学术编辑器: 安东尼奥•皮萨尼

收到了 2010年1月16日

修改后的 2010年2月24日

接受 2010年3月08

发表 2010年5月23日

文摘

临床试验已经证明了积极的证据效力的双重metabotropic谷氨酸受体2/3 (mGluR2/3)受体激动剂在焦虑和精神分裂症。重要的是,有证据表明,这些药物也可能对谷氨酸神经会引起,与帕金森病(PD)的发病机理。然而,这是否神经保护也转化为功能恢复尚不清楚。在目前的研究中,我们研究了双重的神经保护功效mGluR2/3受体激动剂,2R4R4-aminopyrrolidine-2 4-dicarboxylate (2R4R项目),是否这是伴随着一种啮齿动物的行为复苏6-hydroxydopamine PD (6-OHDA)模型。我们现在报告延迟后病变治疗2R4R项目(10 nmol),导致鲁棒神经保护黑系统转化为功能恢复以改善前肢使用不对称和减少(+)-amphetamine-induced旋转相对于车辆对待动物。有趣的是,这些有利影响与小胶质减少有关标记在SNc,这可能表明这种药物的抗炎作用。

1。介绍

多巴胺替代治疗提供有效的救济运动PD患者的症状,但没有证明影响黑系统的退化(1,2]。在PD病理生理学证据表明神经退化excitotoxic组件,介导通过多动症glutamatergic丘脑核(STN)输出通道由于纹状体多巴胺(DA)损耗(3]。由于他们的微分表达式和neuromodulatory谷氨酸神经传递作用在基底神经节,metabotropic谷氨酸受体(mGluR)可能代表承诺为帕金森病药物治疗(药物靶点4,5]。理论上,mGluR由于缺乏被认为是有利的副作用引起ionotropic受体拮抗剂(6]。这是由积极的证据证实疗效组II mGluR(包括mGluR2和mGluR3亚型)受体激动剂在精神分裂症的临床试验7和广泛性焦虑障碍8),这些药物在锥体外系副作用最小的耐受性良好。有趣的是,第二组mGluR被认为是有前途的药物靶点神经受体,因为他们的激活抑制谷氨酸释放在关键在基底神经节突触,包括subthalamonigral突触功能亢进导致纹状体DA损耗在PD (9- - - - - -11]。此外,激活mGluR2/3刺激生产和释放神经营养因子的神经胶质细胞在体外(12,13和体内14- - - - - -16]。结果从我们的实验室和其他露出一个温和的神经保护作用的第二组mGluR受体激动剂在PD的啮齿动物模型,这是依赖于损伤严重程度的大小(14,17- - - - - -19]。然而,目前尚不清楚是否这些神经保护效应也有效地转化为体内功能恢复。的确,系统性管理选择性双重mGluR2/3受体激动剂逆转reserpine-induced失去活动能力,但不是旋转对称后体内安非他命的挑战,尽管相伴,虽然弱,神经保护黑系统(18]。相比之下,其他的研究也报道逆转haloperidol-induced肌肉僵硬和强直性昏厥后大鼠组II mGluR受体激动剂治疗(9,20.]。另一方面,intrastriatal注入双重mGluR2/3受体激动剂2R4R4-aminopyrrolidine-2 4-dicarboxylate (2R4R在这些行为的测试(项目)没有效果21]。有趣的是,intranigral注入的非选择性mGluR2/3兴奋剂DCG-IV缓解reserpine-induced运动不能在啮齿动物22]。然而,这种化合物不选择性mGluR2/3受体,因此不适合单独使用体内模型(23]。

综上所述,药物治疗目标组II mGluR基底神经节似乎提供结合症状改善的潜力与潜在剩余nigral神经元的神经保护(4,5]。不过,似乎有冲突的数据现存文献中关于程度的神经保护和行为影响的双重mGluR2/3体内治疗PD动物模型,在一定程度上这可能是相关的不同路线在每个研究管理工作。因此,我们的目标在当前的研究中是扩展我们最初的发现与第二组mGluR受体激动剂2R4R项目来解决这个问题在啮齿动物部分PD的损伤模型。此外,考虑到出版组II mGluR激活对神经胶质细胞的影响,我们有检查炎症标记物,与标记黑质神经元损失的确定intranigral治疗2R4R项目也会影响体内炎性变化。

2。实验程序

2.1。材料

2R4R项目是来自Tocris Cookson生物科学(英国布里斯托尔)。所有其他试剂和化合物来自Sigma-Aldrich有限公司(英国普尔)除非另有规定的文本。

2.2。实验动物

男性Sprague-Dawley老鼠(25020克;哈伦英国有限公司,英国斯特)被安置在三个组12小时的光:黑暗周期(灯在h, 07:00灯晚7:00 h)。标准的鼠粮和饮用水随意在整个研究。所有动物实验进行了按照指南发表在内政部动物(科学过程)法案》,英国,1986年项目许可下公益诉讼数量70/6486,与当地伦理批准(伦敦帝国理工学院伦理委员会)。

2.3。立体定位引导插管注入

老鼠麻醉与异氟烷的混合物(维护归纳为5%,1% -3%,流量1 L / min)在医学空气/氧气混合物(70/30%)和放置在一个立体定位框架(美国Tujunga大卫·科夫仪器),切杆设置在3.3毫米以上两耳线(24]。体温监测使用直肠探头和维护在手术过程中使用一个恒温控制的加热垫。不锈钢引导插管(26-gauge,塑料,弗吉尼亚州,美国单方面植入1毫米高于左侧SNc在下列坐标;记者:3.0毫米和ML: + 2.5毫米(相对于前囱),DV:7.6毫米(相对于硬脑膜;Paxinos和华生,1986)如前所述19]。参与、老鼠被放置在激烈的复苏从麻醉恢复室。术后护理包括个人闭锁、镇痛(丁丙诺啡,0.3毫克/公斤。c在48小时内)、流体替换(4毫升0.18% i.p glucosaline解决方案),和泥类食物颗粒在手术后第一周。动物被检查每日总神经或行为异常的迹象,体重监控复苏。没有实验干预,直到动物完成了至少10天的恢复期。

2.4。实验设计

从手术后恢复,插管动物被随机分配到药物(= 8)或车辆治疗组(= 10)。调查的影响延迟2R4R-APDC-treatment神经保护,6-OHDA损伤动物收到intranigral注射10 nmol 2R4R项目或药物载体,每天一次,连续7天按我们以前公布的协议(19]除了药物治疗是推迟到48小时后病变。评估是否2R4R项目改善6-OHDA损伤动物的行为,治疗和控制动物自发的前肢的性能进行了评估测试和安非他命注射后的侧旋转的程度。表现在前肢不对称测试评估损伤和药物治疗之前建立一个基线和控制插管注入对行为的影响。动物测试的性能测试完成后,药物治疗(7天),相当于9天损伤。动物是评估amphetamine-induced 24小时后旋转行为。在两个治疗组,神经保护被后期的免疫组织化学分析量化酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞在黑质致密部(SNpc)和生化测量strital单胺浓度的高效液相色谱法。除了神经元细胞计数在SNc进行控制TH萎缩性神经元中表达的变化。最后,6-OHDA的影响车辆损伤和药物或治疗炎症标志物评估使用后期免疫组织化学astroglial和小胶质细胞标记,分别。细节6-OHDA损伤、药物制备和管理行为测试,后期免疫组织化学和生化分析中提供以下部分。

2.5。诱导6-OHDA黑病变

单边6-OHDA黑病变如前所述创建其他地方(25]。简单地说,12g 6-hydroxydopmine氢溴酸盐(6-OHDA,自由基地,Sigma-Aldrich普尔,英国)4L 0.1%抗坏血酸/生理盐水注入到左边SNc使用26-gauge不锈钢注射套管、扩大1毫米以下的留置引导插管,附有弹性油管(Portex,海斯,英国)10L 700系列汉密尔顿注射器安装在机动哈佛微型泵(英国哈佛装置,Edenbridge)。输液的速度是1L / min后5分钟到达平衡的时间,在此期间针还是在原地,然后慢慢收回了。

2.6。药物制备和Intranigral管理

股票的解决方案2R4R项目准备在磷酸缓冲盐(PBS;mM:氯化钠137;氯化钾2.7;KH₂阿宝₄1.8;Na₂HPO₄10)和pH值调整到7.4。药物浓度选择基于体外EC出版₅₀和值的每个复合mGluR2/3 [23,26与这种化合物[]和我们以前的经验19),以避免干扰由于激活其他mGluR亚型。2R4R项目被选为使用,因为它保留了选择性mGluR2/3即使在相对较高的浓度(26]。药物能整除和存储根据制造商的指示。新的药物能整除每天用于药品管理局,以避免反复冻融循环。在所有治疗组,单边intranigral注射毒品进行完全的描述6-OHDA病变,最后注入体积的4l .重要的是,在我们之前的研究中,这种化合物(19),药物治疗开始前一个小时6-OHDA损伤,同时提供强大的概念,并不理想。为了解决这个限制,在当前的研究中药物治疗开始推迟到48小时后病变,此时黑退化应该持续的体内。在所有组,药物治疗或车辆启动后48小时6-OHDA损伤。Intranigral注射每天执行一次,与此同时,在连续7天。所有intranigral注射后,动物被观察到定性的总值20分钟的任何迹象行为异常的药物注射。

2.7。评估自发前肢后使用和旋转不对称(+)安非他命的挑战

表现自发探索前肢使用测试评估由其他人(如前所述27,28]。总之,动物被放置在一个透明的塑料圆筒(高度:30厘米,宽20厘米)和前翼使用不对称是评估在养育行为(27]。前肢与气缸壁接触被列为左,右,或两者兼而有之,前肢比例不对称决定使用以下公式:((侧肢体位置身体的同侧的肢体位置)/总安置)100)(27]。如上所述,前肢不对称是评估中空后10天,1天前6-OHDA损伤。动物被测试在牺牲之前,经过7天的药物治疗,相当于9天病变,治疗组由调查员蒙蔽。

旋转不对称是评估药物治疗后24小时内完成,相当于10天病变。动物服用安非他命(5毫克/公斤i.p。)诱导旋转行为如前所述[29日]。动物被放置在一个清晰的圆形竞技场(25进行测试15厘米),在短时间内适应环境(30分钟),注射多巴胺受体激动剂。完整的侧和侧被记录为60分钟接受。

2.8。组织准备

在完成行为测试,初始药物注射和11天9天后病变,动物被斩首了,大脑快速切割到冷冻平台和削减的漏斗状茎(4.16毫米前囱)生产前,后脑块包含了纹状体和SNc,分别。后脑块固定在4%多聚甲醛5天,cryoprotected在30%的蔗糖和存储干燥24 - 48小时之内直到低温恒温器切片。冠状部分(20米)减少低温恒温器,(明亮的仪器,剑桥,英国),在SNc的吻侧尾程度(从前囱4.80到6.30毫米;Paxinos和华生,1986)。自由浮动部分串联收集并存储在PBS (pH值7.4)含0.05%直到疣状叠氮化钠作为防腐剂。从前脑块,左和右striata很快被解剖,snap-frozen,储存在直到单胺生化分析的内容。

2.9。免疫组织化学

免疫组织化学进行了使用标准immunoperoxidase方法如前所述[25]。简单地说,自由浮动的部分在PBS (pH值7.4,3洗5分钟)和内源性过氧化物酶活动淬火孵化在1%双氧水(30分钟),其次是细胞permeabilisation PBS含有0.1% triton x - 100(15分钟)。非特异性等候被孵化部分3%正常山羊血清(门店,议员生物医学、Eschwage、德国)在PBS稀释1小时。部分是孵化主要抗体稀释PBS包含0.1% triton和3%在室温下挥动18个小时。多巴胺能神经元被确定使用兔子antirat酪氨酸羟化酶(TH、AB151 Chemicon欧洲,沃特福德,英国1:3000)与相邻部分探测鼠标antirat特定核神经元蛋白质(NeuN、MAB377 Chemicon欧洲,1:2000;)控制TH蛋白表达的变化。星形胶质细胞被确定使用兔子antirat胶质原纤维酸性蛋白(GFAP、AB5804 Chemicon欧洲,1:400),和两个抗体,鼠antirat cd11b(克隆OX-42;CBL1512 Chemicon,欧洲,1:400)和鼠标antirat主要组织相容性复合体(MHC)二类(克隆OX6;ABD Serotec Kidlington,英国)是用来确定小胶质细胞和活化的小胶质细胞,分别,因为它已经被报道,活化的小胶质细胞表达高水平的MHC II级(30.]。主要抗体治疗后,部分被孵化与生物素化的二次抗体(山羊兔子或小鼠免疫球蛋白,向量实验室,彼得伯勒,200年英国)稀释1:在PBS 2小时。部分为进一步1小时孵化辣根过氧化物酶共轭(Vectastain精英ABC工具包,向量实验室,彼得伯勒,英国),和抗体绑定是视觉效果使用3-diaminobenzidine (DAB)过氧化物酶染色装备与镍增强(轻拍过氧化物酶工具包sk - 4100,向量实验室,彼得伯勒,英国)根据制造商的指示,其次是在蒸馏水洗涤。每一步之前是洗在PBS (pH值7.4,35分钟)。自由浮动的应用部分被安装到poly-L-lysine-coated幻灯片(英国Lutterworth VWR)和允许坚持用电吹风。安装部分与自来水冲洗前脱水通过一系列的分级酒精和二甲苯的解决方案,应用前盖玻片使用DPX安装介质。消极的控制进行主要抗体是省略了,没有观察到免疫染色,从而确认主要的特异性抗体。

2.10。细胞计数

TH-positive细胞的总数计算手动rostro-caudally通过SNc在相邻的部分使用Eclipse E800尼康显微镜(尼康、东京、日本)连接到一个JVC模拟摄像机和图像专业+软件(英国媒体控制论,Finchampstead)。提出了SNc使用手动跟踪感兴趣的区域(ROI)低倍镜下(4)。TH阳性细胞的数量计入侧和侧半球的第三颅神经,在100年米100年高倍镜下计数区域(40)只有在这个定义的ROI。重要的是,第三颅神经的水平提供了一个健壮的解剖学标志,SNc可以可靠地描述从腹侧被盖区,如前所述[31日,32]。病变大小当时unlesioned侧半球的比例计算。尽管不是stereological过程,之前的研究表明,第三神经延伸提供可靠的解剖学标志的细胞损失的程度是反映细胞损失在整个黑质(32]。进一步,人工细胞计数评估第三层面的脑神经已经证明给相同的结果,不是明显不同,从同级无偏估计stereological获得使用光学分馏器探头的设计(31日]。这些数据表明,人工细胞计数的第三个神经是一种可行的方法确定细胞损失和神经保护的模型(31日]。

控制的变化表达在神经元萎缩,NeuN +细胞体在SNc计算以完全相同的方式如上所述参照相邻TH-immunostained部分相同的动物。两家运营商执行盲治疗组在分析所有定量细胞计数(H.C.和惠普)。同时定量分析,代表显微照片被抓获40放大使用相同的显微镜和相机设置和图像专业+ v.5.0图像分析软件(英国媒体控制论,Finchampstead)。

2.11。通过测定纹状体测量类,

使用测定纹状体单胺含量进行了分析,如前所述[19]。简而言之,左右striata解冻,重,500年单一化μl的冰冷的均化缓冲(三氯乙酸50毫米,0.5毫米EDTA)包含0.5 pmol /毫升3 4-dihydroxybenzylamine氢溴酸盐(DHBA)作为内部标准。Striata被单一化20秒钟的声波降解法(Soniprep、三洋、拉夫堡、英国),放在冰10分钟允许类的完整提取,离心在13000 g紧随其后10分钟(贺利氏离心机、新港Pagnell、英国)。示例上层清液过滤(0.2m聚四氟乙烯过滤器,绘画纸,梅德斯通,英国)高效液相色谱瓶(英国Chromacol),装上一个autosampler(英国桑德赫吉娜50,Dionex)维护。从每个样本,20L是注射多巴胺(DA)和分析,dihydroxyphenylacetic酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)内容使用磷酸缓冲流动相(0.1毫米KH₂阿宝₄、0.1毫米EDTA和1毫米辛基磺酸钠,10%甲醇V / V,调整和正磷酸pH值2.5)0.9毫升/分钟的流量在一个Altex Ultrasphere 3m ODS柱(4.6毫米7.5厘米,beckman coulter英国威科姆)。样本量化的电化学分析细胞(ESA分析模型5011年,艾尔斯伯里,英国)附加到Coulochem II电化学检测器(ESA分析,艾尔斯伯里,英国)与电极一套0.20 mV和电极两组+ 0.34 mV的钯参比电极与专用的基于pc的在线数据分析项目(英国桑德赫Chromeleon, Dionex)。一组标准每个单胺及其代谢物进行分析后每个第五大脑样本。Striata控制和mGluR agonist-treated组在同一天进行分析。

2.12。统计分析的数据

数据从车辆和药物治疗组使用双尾学生的比较以及在棱镜v5.0软件(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。所有数据给出的意思平均数标准误差(s.e.m)和被认为是统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。延迟Intranigral注入2 r, 4 r-apdc提供健壮的神经保护反对6-OHDA毒性

TH +细胞的平均数量unlesioned半球的药物或vehicle-treated动物相当,而不是明显不同。Intranigral注入6-OHDA (12g)导致减少70% (68.751.71 (95% CI: 64.89% - -74.62%)的侧SNc vehicle-injected-animals (TH +细胞= 8)相对于侧半球;图1(一))。相比之下,在动物接收intranigral注射2R4R项目为7天(10 nmol), 48小时后开始病变,有一个小得多的减少损伤SNc TH +细胞相比,车辆对待动物(40.263.18% (95% CI: 32.74% - -47.78%)和68.751.71% (95% CI: 64.89% - -74.62%);;图1(一))。控制可能改变在表达式内神经元萎缩影响观察SNc对TH +细胞数量的影响,增加细胞数量从每个治疗组进行同样的动物组织部分沾上特定的神经元标记,NeuN。至关重要的是,SNc TH +细胞的损失反映了一个等价的减少NeuN +细胞在损伤SNc vehicle-treated动物(67.431.15% (95% CI: 64.74% - -69.95%)。相比之下,小得多的减少NeuN +细胞在2R4R-APDC-treated动物相比vehicle-treated动物(37.894.03% (95% CI: 28.36% - -47.42%)和(67.431.15% (95% CI: 64.74% - -69.95%);;图1 (b)),符合观察保护损伤SNc +细胞。这些数据在代表nigral TH +和NeuN +细胞的显微照片从两组数据1 (c)- - - - - -1 (f)。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

图1

延迟(48小时后病变)subchronic intranigral管理2R4R项目(10 nmol 4L)变弱6-OHDA体内毒性。散点图显示(a)的平均损失百分比±王新宏。米of nigral TH+ cells and (b) NeuN+ cells in each treatment group (Vehicle= 10,2R4R项目,= 8)。请注意,6-OHDA诱发一个等价的减少TH和SNc NeuN +细胞,这是明显的减毒后延迟管理2R4R项目(10 nmol)。2、车辆和R4R项目(2-tailed学生以及)。(c) - (f)代表显微照片(40)的过氧化物酶染色TH和SNc NeuN +细胞从每个治疗组,也显示了ROI包括SNc用于细胞计数,规模200酒吧m。(c) TH, 6-OHDA +车辆,(d) NeuN 6-OHDA +车辆,(e), 6-OHDA + 2R4R项目(f) NeuN 6-OHDA + 2R4R项目。

没有显著变化的单胺内容或营业额sham-lesioned动物(表中被观察到1)。生化分析纹状体单胺水平在每个治疗组显示延迟的神经保护作用2R4R项目治疗观察到细胞水平与温和,但统计上显著的保护DA, DOPAC, HVA含量在同侧纹状体相比vehicle-injected控件(;表1)。重要的是,没有观察到任何显著差异单胺浓度之间的侧半球车辆和药物治疗动物(;表1)。纹状体的多巴胺显著增加周转率观察车辆的损伤striata治疗动物(;表2),表明增加DA代谢作为内在6-OHDA补偿性反应病变。有趣的是,在2R4R-APDC-injected动物纹状体DA营业额仍升高进行半球相对unlesioned端(;表2),但重要的是,这是观察到明显低于vehicle-treated纹状体损伤的动物(;表2)。

3.2。功能恢复的运动行为体内后延迟Intranigral注入2 r, 4 r-apdc

功能评估的神经保护效应延迟intranigral 2R4R项目注入(10 nmol),自发电机性能评估通过观察前肢探索性缸饲养行为测试期间使用。没有明显的前肢之间使用不对称检测治疗组之前6-OHDA损伤(数据没有显示)。两个2R4R显示项目和vehicle-treated 6-OHDA损伤动物的一个重要转向使用侧前肢相对于侧前肢。然而,这同侧前肢偏见是适度使用,但在2显著降低R4R-APDC-injected动物相比vehicle-treated动物(42.64.1% (95% CI: 32.79% - -52.41%)和66.45.9%(95%置信区间:52.78—-80.07);;图2(一个))。此外,同侧的旋转反应(+)安非他命也调查前牺牲。注入5毫克/公斤(+)安非他命(i.p)诱发显著增加网络侧将在60分钟的录音vehicle-treated 6-OHDA损伤动物(图3 (b)),这在动物接收延迟intranigral 2明显减弱R4R项目(;图2 (b))。

(一)

(b)

图2

神经保护与6-OHDA毒性后延迟subchronic intranigral管理2R4R项目(10 nmol 4L)转化为功能恢复的赤字。(a)条形图的平均百分比前肢使用不对称东南部。米in vehicle and 2R4R项目(10 nmol)治疗的动物,2、车辆和R4R项目。(b)条形图amphetamine-induced旋转行为,表示为网侧转超过60分钟东南部。米in vehicle and 2R4R-APDC-treated动物,2、车辆和R4R项目。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

图3

神经保护与6-OHDA毒性后延迟subchronic intranigral管理2R4R项目与定性减少炎症标记物相关联。代表显微照片(40)的过氧化物酶对GFAP染色(astrocytosis)和OX-42 (microgliosis) SNc从每个治疗组(比例尺200米)。板(一)——(g)显示的强度和分布GFAP +和OX-42 +细胞侧控制SN车辆(a)、(c)和(e), (g) 2R4R项目(10 nmol)又动物。面板(b) - (h)显示的强度和分布GFAP +和OX-42 +细胞损伤SNc的车辆(b)、(d)和(e), (g) 2R4R项目(10 nmol)又动物。(Insets (a) - (h)),60岁,放大了区域(比例尺10米))。注意明显减少GFAP +和OX-42 +染色强度在2R4R-APDC-injected动物相比vehicle-treated动物。此外,2R4R“治疗似乎减少细胞反应性星形胶质细胞的形态学特征或活化的小胶质细胞在SNc相比vehicle-treated控制。

3.3。延迟治疗2 r的影响,4 r-apdc表达Astroglial在黑质致密部和小胶质标记

vehicle-treated动物,多巴胺能神经元死亡引起6-OHDA一方面伴随着显著的神经炎症。的确,相比完整unlesioned半球(图3(一个))的强度显著增加GFAP和观察OX-42-immunostaining损伤SNc相对unlesioned半球(图3 (b))。GFAP和OX-42-positive (GFAP + / OX42 +)细胞unlesioned半球显示形态典型的休息或静止细胞(insets,数字3(一个)和3 (e))。相比之下,进行半球,显著增加GFAP +和OX42 +细胞显示典型的激活细胞形态学观察,与星形胶质细胞显示增厚过程和一个开关从分歧的变形形态在小胶质细胞(insets,数字3 (b)和3 (f))。定性分析表明,延迟治疗2R4R项目减少了损伤SNc GFAP染色强度,(数字3 (c)和3 (d))相比,vehicle-treated 6-OHDA损伤动物(数字3(一个)和3 (b))。此外,少GFAP +细胞显示激活形态学损伤SNc的2R4R-APDC-treated动物相比,车辆6-OHDA损伤动物(数据处理3(一个)- - - - - -3 (d))。此外,明显减少OX42 +染色强度损伤SNc可能观察到2R4R项目注入动物(数字3 (g)和3 (h)),而vehicle-treated 6-OHDA损伤动物(数字3 (e)和3 (f))。值得注意的是,定性分析表明显著减少OX42 +细胞显示活性形态vehicle-treated动物相比,虽然这不是完全废除(数据3 (e)和3 (h))。与这些观察结果一致,OX6 +细胞明显升高显示活性形态也观察到的损伤SNc vehicle-treated 6-OHDA损伤动物相比unlesioned半球(数字4(一)和4 (b)),证实活化的小胶质细胞的存在。重要的是,这是明显的,但是不是完全减少动物注射2R4R项目(图4 (c)和4 (d))。

(一)

(b)

(c)

(d)

图4

神经保护与6-OHDA毒性后延迟subchronic intranigral管理2R4R项目与活化的小胶质细胞在SNc数目减少。代表显微照片(OX-6 40)的过氧化物酶染色,活化的小胶质细胞在SNc的标记每个治疗组(规模200酒吧米)。(一)6-OHDA +车辆,unlesioned SNc, (b) 6-OHDA +车辆,进行SNc, (c) 6-OHDA + 2R4R项目(10 nmol) unlesioned SNc, (d) 6-OHDA + 2R4R项目(10 nmol)进行SNc。注意OX-6染色强度的增加和增加OX-6 +细胞形态学显示活化的小胶质细胞的损伤SNc vehicle-treated动物,在动物治疗2出现明显下降R4R项目。

4所示。讨论

在当前的研究中我们扩展我们最初的初步观察19使用双mGluR2/3受体激动剂2)体内R4R项目在啮齿动物局部病变6-OHDA PD模型。的确,我们现在报告延迟(48小时后病变)subchronic intranigral管理2R4R项目(10 nmol)可以防止啮齿动物黑系统6-OHDA毒性在细胞(保护nigral TH +细胞体)和生化水平(保护纹状体单胺浓度)。这是有效地转化为功能恢复,提高前肢不对称分数和修正amphetamine-induced旋转不对称。此外,这些影响是减少定性在SNc小胶质激活。重要的是,动物接收2R4R项目发布病变,NeuN +和TH +细胞损失在平行的侧SNc减毒,强烈支持神经保护效应,而不是改变TH萎缩性神经元中表达。然而,尽管intranigral治疗2R4R项目降低了内在补偿增加纹状体DA新陈代谢vehicle-treated动物相比,这不是完全逆转。因此,我们不能排除这种可能性的神经保护作用2R4R项目对纹状体DA及其代谢物并不一定程度上是由于内在的补偿机制。此外,这将是未来重要的研究,以确定这些数据复制在系统管理和更进步的PD模型,如intrastriatal 6-OHDA模型(33]。值得注意的是,2R4R项目没有完全阻止6-OHDA体内毒性,符合先前的体内研究[14,17- - - - - -19]。

我们实验室的初步数据显示2的神经保护作用R4R项目是由共同服用EGLU,废除一个高度选择性组II mGluR拮抗剂(34]。这些观测结果强烈表明2的有利影响R4R项目的影响通过选择性激活体内mGluR2/3(弗农et al .,未发表的观察)。有趣的是,相对较弱的神经保护效应中观察到以前的研究(14,17- - - - - -19)也可能被解释成证据表明mGlu2和3受体体内有不同的功能(15]。事实上,在一个优雅的小鼠的研究中,螺旋器和同事(2007)表明,系统性管理双重mGluR2/3对NMDA受体激动剂LY379268保护纹状体神经元毒性在野生型和mGluR老鼠而不是mGluR老鼠(15]。此外,LY379268对黑神经变性引起的低剂量的1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine mGluR注射(MPTP药物)老鼠,强烈建议这些体内神经保护效应依赖于mGluR3的激活(15]。自LY379268 mGlu只是神经老鼠,这些数据表明,激活mGluR2在野生型老鼠可能抵消药物的保护活动(15]。这个假说是由详细的体外实验在相同的研究中,提供的证据表明,激活mGluR2可能加强在混合皮质NMDA毒性文化(15]。因此,在体外和体内收敛于证据表明mGluR3介导的神经活动mGluR2/3体内受体受体激动剂,结合mGluR2和mGluR3受体的激活可能因此限制程度的神经保护观察(15]。相反,有趣的是,mGluR2小说需要单独激活抗精神病行为的双重mGluR2/3体内受体激动剂(35,36]。然而,很明显,双mGluR2/3受体激动剂如LY367385事实上,2R4R预测项目可能有神经保护效果比单独mGluR3受体激动剂(15]。

这也暗示了这些化合物的潜在的抗帕金森病的影响在PD的临床前模型。在当前的研究中,我们提供了初步证据表明,神经保护延迟后,subchronic intranigral管理2R4R项目转化为功能恢复,确认行为水平的神经保护作用。这些数据有些符合先前的数据中系统性管理双重mGluR2/3兴奋剂LY379268弱改善reserpine-induced失去活动能力,但没有扭转安非他命在6-OHDA损伤大鼠旋转不对称,尽管温和的神经保护作用[18]。有趣的是,intrastriatal注2R4R项目没有反向haloperidol-induced木僵或肌肉僵化在老鼠21]。这些不同的结果可能是由于数据证明双mGluR2/3受体激动剂,(包括LY379268和2R4R项目)不仅抑制谷氨酸,但也在纹状体DA释放体内(37]。有趣的是,LY379268还显示部分激动剂活动达D₂受体在体外和体内38,39]。因此,系统性或intrastriatal管理后,双mGluR2/3受体激动剂可能绑定到突触前DA D₂从而减少纹状体DA的释放和抑制受体locomtion [38,39]。是否2R4R项目已经部分激动剂活动达D₂受体是未知的。然而,最近的数据表明,组II mGluR,特别是mGluR2与DA密切相关₂受体,可以调节他们的数量和纹状体的活动40,41]。事实上,D的数量₂受体在纹状体明显升高mGluR2和mGluR3胜过老鼠40,41]。此外,在试管内纹状体匀浆从mGluR2胜过老鼠显示明显更大的过敏性反应₂受体激动剂(+)PHNO相比,那些来自mGluR3淘汰赛,这表明mGluR2和DA D₂受体在功能上与体内(40]。

综上所述,这些数据表明,翻译后的神经保护功能恢复双重mGluR2/3受体激动剂治疗严重依赖药物管理局的路线。事实上,我们自己的数据表明,这可能是观察到激活后nigral mGluR2/3隔离。相比之下,系统性管理后,混杂在其他大脑区域特别行动,但不仅限于,纹状体可以挡住这一效应(18]。值得注意的是,这似乎主要是由于激活mGluR2 [38]。因此,这些数据加强预测mGluR3选择性化合物可能会更有效,因为神经保护和抗帕金森病的药物,虽然这还有待测试体内。

在当前的研究中我们还发现的神经保护作用2R4R项目被关联到一个定性的减少在SNc小胶质标记。有趣的是,在体外激活mGluR3小胶质细胞表达抑制小胶质激活和神经毒性细胞因子的分泌42,43]。相反,激活的小胶质mGluR2提高小胶质毒性体外(42,43]。再一次,这些数据符合不同的角色mGluR2体内和3 (15),当然也可能导致2的适度的神经保护作用R4R项目由平衡体内有益mGluR3激活的影响。然而,在此基础上观察人们很容易推测的神经保护作用2R4R项目和其他双mGluR2/3体内受体激动剂可能涉及抗炎机制,包括预防有毒小胶质激活,同时记录的影响,如促进从星形胶质细胞营养因子的分泌12- - - - - -15]。然而,这些数据应该被谨慎地减少小胶质标记可能仅仅反映了由于神经保护的二次效应2R4R项目通过其他机制。然而,这些最初的观察表明,进一步的研究的影响mGluR2/3受体激动剂小胶质反应体内可能是必要的。

5。结论

总之,本研究延伸我们的初步研究结果19),并提供证据表明subchronic intranigral注入双重mGluR2/3受体激动剂2R4R“强劲变弱体内多巴胺能神经退化,即使治疗启动延迟。此外,这转化为适度的功能恢复,至少intranigral政府在体内。此外,2的神经保护作用R4R项目可能涉及修改的炎症反应减少定性证明了在小胶质标记在SNc的表达。然而,我们完全承认这些数据的重要性应该被警告,我们利用双重mGluR2/3受体激动剂,因此任何有益的影响可能会受到干扰的影响由于mGluR2体内激活(15]。然而,这些数据提供了进一步的证据的基本原理针对组II mGluR PD,尽管它将在未来的研究极其重要的重复这些实验使用mGluR3-selective化合物可用。总的来说,这也暗示了临床使用双重mGluR2/3受体激动剂治疗神经退行性疾病。的确,从临床前研究现有数据的基础上,orthosteric非选择性mGluR2/3受体激动剂可以作为神经保护有限的临床使用/抗帕金森病的药物由于干扰mGluR2体内(15]。小说的发展类的化合物,被称为积极的变构调节器(PAMs),不直接激活受体,但从glutamate-binding绑定到一个网站不同的网站,增加响应的影响受体的内源性glutamatergic语气,可能提供一个解决这个问题的,因为这些结合位点往往限制较少,更易于发现小说,subtype-selective化合物,而针对谷氨酸结合位点(44]。事实上,许多PAMs选择性mGluR2已经被开发出来,这可能提供了一个激动人心的替代方法至少双mGluR2/3受体激动剂的抗精神病药物或抗焦虑药的迹象44- - - - - -47]。然而,尤其是这并没有与其相匹配的mGluR3选择性PAMs类似的发展。因此mGluR3选择性化合物的发展是热切期待,可能代表一个至关重要的一步的潜在使用这些化合物用于神经退行性疾病如帕金森病。

非标准缩写

2R4R项目:	2R4R4-aminopyrrolidine-2, 4-dicarboxylate
EGLU:	(年代)- - -α-Ethylglutamic酸
DCG-IV:	(2年代,R,R)2 - (,-Dicarboxycyclopropyl)甘氨酸
测定:	高效液相色谱-电化学检测
LY379268:	(1R4R,5年代6R)4-amino-2-oxabicyclo []hexane-4 6-dicarboxylic酸
LY354740:	(1年代,2年代,5R6年代)2-aminobicyclo []hexane-2 6-dicarboxylic酸
6-OHDA:	6-hydroxydopamine;mGluR metabotropic谷氨酸受体
MTN:	内侧核终端
NMDAR:	N甲基-D天冬氨酸受体
帕金森病:	帕金森病
+ PHNO:	4-propyl-9-hydroxynaphthoxazine
西门子数控(南京)有限公司:	黑质致密部
信噪比:	黑质pars试
STN:	丘脑核
区域:	腹侧被盖区。

确认

这项工作由资助来自英国医学研究理事会和多萝西霍奇金信任,谁作者要感谢慷慨的财政援助。

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