附近的药代动力学和Biodistribution评估Infrared-Labeled PSMA-Specific小分子在肿瘤的老鼠

文摘

前列腺癌是男性最常诊断的癌症,通常需要手术。利用近红外(NIR)技术进行图像引导手术可以提高准确描述肿瘤的利润率。促进临床前测试的结果,我们开发和特点PSMA-targeted小分子,YC-27。800年IRDye cw共轭YC-27或anti-PSMA抗体用于参考。人类22 rv1 PC3M-LN4和/或LNCaP前列腺肿瘤细胞暴露在标记化合物。在活的有机体内针对肿瘤小鼠和间隙特性测定。器官和肿瘤切除和成像评估探测器定位。YC-27表现出剂量依赖性增加信号绑定。用显微镜结合特异性和内化。在体外和在活的有机体内阻止研究证实YC-27特异性。在活的有机体内YC-27显示良好的肿瘤描述和组织对比nmole 0.25低剂量。YC-27通过肾脏清除,但绑定肾近端小管的皮层和附睾。自《还对大多数肿瘤的neovasculature广泛表达,我们预计YC-27将图像引导手术和肿瘤切除术的临床效用。

1。介绍

前列腺癌是男性最常诊断的癌症,影响六分之一,是癌症死亡的主要原因1- - - - - -4]。目前前列腺癌检测方法包括超声波和multiparametric核磁共振成像对指导活检过程和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)^111年In-capromab pendetide (Prostascint)疾病的评估和管理(5- - - - - -7]。双模式显像剂正在开发利用放射性核素的灵敏度和分辨率的近红外(NIR)荧光8)预处理和术中可能使用的应用程序。临床上可用的近红外染料(吲哚菁绿和亚甲蓝)无肿瘤特异性对比剂(9,10]。然而,成像分辨率增加使用代理几个强肿瘤性质与敏感检测和相对快速清关11]。最近的报告所描述的成功术中使用小分子靶向药物评价的几种类型的癌症肿瘤边缘,image-assisted切除术,腹腔镜切除淋巴结(12- - - - - -18]。

通过使用有效的针对肿瘤细胞的各种代理旨在识别肿瘤细胞表面的各个方面以特定的方式(11,13,19,20.]。特别有前景的结果已经通过针对前列腺特异性膜抗原(PSMA), II型跨膜糖蛋白也称为谷氨酸羧肽酶II,和叶酸水解酶,由前列腺上皮细胞和基底表达中原发性和转移性前列腺癌3,4,15]。此外,PSMA表达式内发现有其他各种实体肿瘤,特别是与内皮细胞密切相关的肿瘤前期和瘤内neovasculature [3,4,21,22]。因此,PSMA分子是一个有吸引力的目标,推进基本机械的研究前列腺癌进展的临床前模型和外科应用程序(15,21- - - - - -23]。

针对PSMA的可用工具包括单克隆抗体和小分子或肽配体,每一种都有其优点和局限性与它的使用(24]。基于抗体探针有吸引力,因为高水平的特异性的目标和picomolar-range亲和力,通常可以实现。这些属性,加上一个更长的循环半衰期比许多小分子,大大降低所需的剂量为最佳检测(25]。慢的间隙(2 - 3天)的单克隆抗体探针可能有利于那些将要动手术的例程,但是这个扩展的等待期是必要充分tumor-to-background信号实现高,手术前可以有信心(执行11,13,20.]。这些探针也是潜在的免疫原性。相比之下,小分子探针通常可以用摩尔生成关联范围和快速通关率,不仅促进组织渗透,而且减少曝光时间(带来的潜在毒性26- - - - - -28]。几组开发了PSMA-specific小分子尿基化合物,已成功应用于肿瘤组织的光学成像27- - - - - -31日]。

在这个报告中,我们评估近红外(NIR)荧光技术成像的前列腺肿瘤细胞小分子PSMA瞄准的目标代理,YC-27。比较一个商用anti-PSMA抗体是为了说明biodistribution和清关问题。分子都贴上IRDye 800连续波和针对特定绑定PSMA-positive细胞文化特征,其次是间隙和老鼠体内的肿瘤疗效的评价。我们的研究结果支持PSMA的特异性针对肿瘤检测,提供优化条件为其用在老鼠身上,并建议使用YC-27福利针对代理基于其药代动力学性质。

2。材料和方法

2.1。细胞培养、材料和试剂

LNCaP 22 rv1人类前列腺癌的细胞从美国购买类型文化集合(马里兰州罗克维尔市)保持在RPMI 1640中含10%胎牛血清。生物M-LN4细胞,来源于人类前列腺腺癌细胞生物,被好心的提供的以赛亚博士j·费德勒(MD安德森癌症中心,休斯顿,德克萨斯州)和维护基本介质中含10%胎牛血清,丙酮酸钠,不必要的氨基酸。人类/ FOLH1 PSMA NAALADase我抗体购自R & D系统(明尼阿波利斯、锰)。DAPI和TO-PRO-3从生命技术公司购买(CA)卡尔斯巴德。兔多克隆β微管蛋白抗体购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。Fluoromount试剂和poly-D-lysine氢溴酸盐是来自Sigma-Aldrich化学品(密苏里州圣路易斯和Zeba旋转脱盐列来自热费希尔科学(沃尔瑟姆,MA)。Poly-D-lysine涂96 -孔板从BD购买生物科学(贝德福德,MA)。氨基酸合成纤维、合成树脂支持和肽偶联试剂(NovaBioChem)购买的EMD微孔(Billerica, MA)。IRDye 800 cw NHS酯是由LI-COR生物科学(林肯,NE)。所有其他试剂的化学合成、纯化和分析从Sigma-Aldrich购买(密尔沃基WI) VWR(宾夕法尼亚州,二),格伦研究(英镑、VA)和热费希尔科学(沃尔瑟姆,MA)。高效液相色谱法(HPLC)分析和净化进行一个安捷伦1100系列以适当的反相高效液相色谱法列,紫外可见光谱分析(UV / Vis)上执行一个安捷伦8453系列分光光度计,和低分辨率的质谱(lrm)进行了使用电喷射(ES)技术在一个安捷伦1100系列LC -陷阱(安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。《奥德赛》经典的红外成像系统,Aerius自动红外成像系统,和珍珠脉冲小动物成像提供了LI-COR生物科学(林肯,NE)。

2.2。合成和标签YC-27 Anti-PSMA抗体

的生物活性一半YC-27合成如前所报道(28),贴上IRDye 800 cw NHS酯(YC-27 800连续波)28]。YC-27的分析数据新创合成与早些时候报道结果一致(28,29日)和dye-to-protein比率为1:1。IRDye 800 cw anti-PSMA抗体(PSMA 800连续波)是800年由添加IRDye cw NHS酯3:1 dye-to-antibody摩尔比。解决方案是在室温下孵化3 h其次是旋转柱净化去除剩余的非结合的染料。最终产品dye-to-protein比率为1.9。

2.3。显微镜

三个人类前列腺癌水平不同的细胞系表达PSMA被用来评估定位和内化的探针:生物M-LN4(负面),22 rv1(低),和LNCaP(高)32,33]。生物M-LN4 22 rv1细胞孵化在37°C 1 h和300 nM YC-27 800连续波或1μ克PSMA 800连续波。细胞被冲洗和4%甲醛固定20分钟和核与DAPI染色。图像是通过荧光显微镜使用奥林巴斯IX81倒置显微镜配备一个卤素灯泡和近红外光谱过滤器(例:HQ760/40x 790 dcxr EM: HQ830/50 m;色技术公司,为Rockingham市增加,VT)。

2.4。在体外检查YC-27 800连续波在细胞培养

人类A431、MCF7 U87通用汽车、生物M-LN4, 22 rv1细胞冲洗PBS和细胞溶解Laemmli样本缓冲区。电泳后,蛋白质被转移到硝化纤维膜,阻止1 h和奥德赛阻断缓冲区,和孵化主要抗体在1:2000稀释(PSMA 800连续波和兔多克隆微管蛋白)1 h在室温下用颤抖的。蛋白质检测IRDye 680 rd-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体(LICOR生物科学)奥德赛红外成像系统的可视化(LI-COR生物科学)。

绑定和特异性YC-27 800连续波和PSMA 800连续波被荧光细胞化验进一步评估。22 rv1生物M-LN4, LNCaP细胞增长到大约80% confluency以96 -微量滴定板。Poly-D-lysine涂层板LNCaP所需化验。增长媒体取代媒体含有浓度增加PSMA 800连续波(0.01 - 5所示μ800 g / mL), YC-27 cw (0.1 nM为1μ50米),无标号YC-27(0.026海里μM, 1: 5稀释系列)+ 28 nM YC-27 800连续波,和800年YC-27 cw (28 nM) + 2-PMPA NAALADase活动的竞争性抑制剂(0.5 nM PSMA 50μM, 1: 10稀释系列)。所有的治疗都是一式三份和孵化公司37°C的5%₂大约15分钟。井被冲洗1 x PBS和停在4%甲醛溶液固定20分钟紧随其后四洗1 x PBS + 0.02% Triton - 100去除游离染料和permeabilize细胞。板块被封锁在奥德赛阻断缓冲区(LI-COR生物科学、林肯、NE) 1小时和孵化一个额外的小时TO-PRO-3 DNA染色剂(稀释1:5000)正常化的细胞数量。清洗步骤重复了奥德赛缓冲+ 0.02% Tween-20板是扫描奥德赛SA自动红外成像系统。量化是通过比率分析的荧光强度从700纳米(代表手机号)和800海里(表示标记探针)通道。绑定(明显(IC)和竞争₅₀)参数计算了非线性曲线拟合分析使用GraphPad棱镜5 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。

2.5。在活的有机体内动物成像

男性SCID小鼠远系繁殖无毛(商店,Crl:商店-Prkdc^SCID人力资源^人力资源)从查尔斯河(威灵顿,MA)购买和维护纯化辐照维护饮食(ain - 93)从哈伦Teklad(麦迪逊,WI)。所有实验动物使用以前的程序审查和批准的机构布拉斯加-林肯大学动物保健和使用委员会,依法进行指导的实验室动物保健和使用由美国国立卫生研究院出版。

六个老鼠植入皮下注射22 rv1 (PSMA积极、右翼)和生物M-LN4 (PSMA负数,左翼)细胞(1×10⁶细胞/ 100μL盐水)和维护直到肿瘤大小达到直径约3毫米。这个时候,带有动物收到1 x PBS (100μL), IRDye 800 cw羧酸盐(1 nmol)免疫球蛋白g 800连续波(免疫球蛋白g 800连续波,75μ800 g), YC-27连续波(1 nmol)或PSMA 800连续波(75μg)通过尾静脉注射。三个剂量,0.25,0.5,和1.0 nmol评价小鼠22 rv1肿瘤(每剂)。特异性与2-PMPA进一步证实了抑制。这个实验中,注射前2-PMPA (2μ800 g,通过静脉注射)随后YC-27 cw剂量(0.5 nmole)。所有化合物的图像被抓获后24小时注射使用珍珠脉冲小动物成像系统。

2.6。器官和组织分析

最终的成像后,动物被牺牲和肿瘤和器官被成像确认信号内容和评估代理目标。肿瘤和器官在10月snap-frozen cryosectioning化合物。部分(8μ米厚度)进行扫描使用《奥德赛》CLx成像系统测量800纳米荧光信号。每像素800纳米荧光信号被用来比较针对代理在组织特异性和保留。

3所示。结果

3.1。免疫印迹分析和显微镜检查

我们第一次确认的选择性PSMA-specific抗体选择我们的研究参考使用西方分析(图1(a))。PSMA蛋白(85 kDa)是专门PSMA-expressing细胞系,检测22 rv1。没有明显的非特异性结合是nonexpressing指出细胞溶解产物。积极或消极的前列腺肿瘤细胞系表达PSMA (22 rv1生物M-LN4, resp)孵化了PSMA 800连续波(1μg,数据1(b)和1(c))或YC-27 800连续波(300 ng,数字1(d)和1(e)和复染色DAPI可视化细胞核。探针结合PSMA-expressing细胞系和显示nonexpressing细胞系的微不足道的绑定。

3.2。细胞特异性YC-27 800连续波

评估的亲和力和靶向特异性YC-27 800连续波,我们进行了基于单元的剂量反应分析。三个人类前列腺肿瘤细胞系PSMA的选择基于不同的表达。YC-27 800连续波显示剂量依赖性增加荧光,表明高亲和力结合22 rv1细胞(明显= 8纳米,图2(一个))。没有明显的信号增加了在添加YC-27 800 cw PSMA-negative细胞系,生物M-LN4(图2(一个))。,重要的是,LNCaP细胞表达水平高于其他的PSMA商用线,表现出类似的亲和力YC-27 800连续波(明显= 36海里,图2 (b))(~ 200倍)荧光强度明显高于饱和,反映出更多的结合位点探针的这些细胞。

特异性的研究进一步证实了竞争。LNCaP细胞治疗YC-27 800连续波结合无标号YC-27(图2 (c))或与2-PMPA PSMA的有力竞争抑制酶活性(图2 (d))。两种化合物抑制有效剂量反应信号强度降低。的集成电路₅₀1.7无标号YC-27和2-PMPAμM和0.1μM,分别确认为小分子PSMA作为目标。

3.3。在活的有机体内探测器的性能

雄性小鼠皮下注射22右翼rv1细胞和生物留给M-LN4细胞靶向探针PSMA的直接比较。正如预期的那样,动物收到任何的三个控制化合物1 x PBS, 800 cw羧酸盐,或免疫球蛋白g 800连续波显示,肿瘤(白色箭头,最小保留数据3(一)-3(c))。YC-27 800连续波和800 cw绑定PSMA 22 rv1肿瘤(白色箭头人物3(d)和3(e)、职责),而很少或没有可见的生物信号M-LN4肿瘤。正如预期的那样,动物注射800 PSMA cw显示不完整的间隙的探针在24小时时间点(图3(e))。

检查切除肝脏、肾脏和肿瘤从动物给YC-27 800连续波和PSMA 800连续波提出了数字4(一)和4 (b),分别。正如预期的那样,800年YC-27 cw显示可以忽略的信号在肝脏和肾脏的高信号,表明没有明显的肝脏保留。800连续波PSMA另一方面显示了相反的高荧光信号在肝脏和低信号在肝脏肾脏显示更高的保留。PSMA-expressing肿瘤探针都是特定的,22 rv1,忽略信号的生物M-LN4肿瘤。信号量化部分从多个器官进一步支持这些结果(图4 (c))。一般来说,所有组织保留更高水平的PSMA 800连续波,包括生物M-LN4肿瘤,这是符合不完整的自由间隙调查。两个探针在附睾积累。在考虑800年PSMA高信号连续波在22个rv1肿瘤,肝、附睾,重要的是要认识到基于抗体的最佳间隙和成像时间点探测器接近72 h,而不是24小时时间点是最佳YC-27 800连续波(2]。

部分肝、肾、睾丸和附睾,保留高信号,进行更详细的检查(图5)。荧光强度的控制免疫球蛋白g 800连续波和特定PSMA 800连续波高在肝脏的部分(图5(一)),符合报告的基于抗体的试剂(间隙2]。指出在肾脏低信号。YC-27 800连续波信号在肾脏方面表现出显著的,很少或根本没有信号保留在肝脏。如前所述,附睾显示PSMA-specific探针和残余信号,在较小程度上,标签控件。有趣的是,800年YC-27 cw显示强烈的局部信号的肾脏肾皮质,这房子近端小管。代表肾皮质的微观图像区域(40 x;图5(b))显示特定信号的刷状缘房地产近端小管。

3.4。最小有效剂量测定YC-27 800连续波

SCID小鼠无毛轴承22 rv1(右翼,白色箭头)和生物M-LN4(左翼)异种移植接受静脉注射0.25,0.5,1.0 nmol YC-27 800连续波或YC-27 800连续波(0.5 nmol) + 2-PMPA (2μ克)。动物成像后24 h注入和肿瘤切除进行进一步分析。如数据所示6(一)和6 (b)、合理的肿瘤,背景是在最低剂量的0.25 nmol实现。证明观察到的信号是由于特定绑定的YC-27 800连续波探头PSMA,动物接收0.5 nmol探测的探测与之前2-PMPA挑战注入。结果~ 50%下降信号确认调查绑定到它的目标在活的有机体内。

4所示。讨论

YC-27从铅化合物化学优化利用的抑制属性PSMA-binding尿素支架(27,28),改善了检测前列腺癌的药物动力学和nonprostate肿瘤(29日]。在当前的报告中,我们描述一个基于YC-27 NIR共轭和比较其属性到一个基于抗体针对PSMA代理。我们的细胞,在活的有机体内数据证实,800年IRDye附件cw YC-27没有改变其目标绑定特点和显示,共轭绑定PSMA-positive与高亲和力和特异性细胞和肿瘤。YC-27 800连续波产生一个强大的、特定的荧光信号在PSMA-positive肿瘤完整的动物在24 h,留下最小的非特异性背景信号。

在细胞水平上,是内化PSMA从其住所通过clathrin-coated坑在细胞表面,随后回收的表面reexpose PSMA [23,34]。我们的细胞分析证实,800年YC-27 cw成功绑定细胞外,PSMA和荧光显微镜显示大量专门PSMA-positive细胞内化。目标PSMA的内吞作用的内化和回收是一种机制,提供重要的肿瘤敏感性由其他receptor-targeted近红外荧光探针,如IRDye 800 cw EGF (35],因为细胞内的荧光团标签积累而额外的表面受体返回探测器绑定。

YC-27 800连续波快速清除完整的动物,在24小时内产生高tumor-to-background信号。相比之下,抗体是已知长期循环半衰期(11,20.,36,37),这是不足为奇的基于抗体的代理800 cw PSMA没有达到最优间隙。清除配置文件是反映在荧光定量分析的积累在切除器官和组织,这表明更大的信号在所有动物组织接收PSMA 800连续波。YC-27 800连续波荧光肾皮质是最突出的,尤其是在近端小管的刷状缘的住房。在老鼠的肾脏中表达的一些报告发现PSMA38,39),但临床使用的影响是未知的。基底PSMA表达式也在唾腺,大脑,小肠(40]。没有明显的信号检测24小时后注射前列腺地区包括膀胱。这些分布模式支持未来测试YC-27 800连续波敏感和具体区分正常,良性和恶性组织。

绑定YC-27 800连续波在附睾可能归因于识别探针的谷氨酸受体(GluR)。以前,建议GluR可能参与精子发生,精子的运动性,睾丸发展(41,42]。此外,谷氨酸绑定可以部分取代N-methyl-D-aspartate在精囊42]。小分子、YC-27谷氨酸组件迟早会暴露,可用于受体结合。另一个可能的解释是,附睾的信号对所有标签代理、探针,并控制可能导致瓶颈的间隙通过这种高度血管区域与成像时间点。尽管如此,绑定到附睾预计不会在前列腺手术,因为这是有问题的组织通常是在前列腺切除术移除。

有人建议,长时间循环,基于抗体的荧光造影剂可能是有利的,因为需要代理的低剂量(2,11,20.,43]。然而,小分子的剂量依赖性,YC-27 800连续波,表明22 rv1肿瘤检测具有良好使用0.25 nmol tumor-to-background。因此,快速清除目标代理不妥协的功效,当代理为目标,具有较高的亲和力,迅速清除临床工作流将完全兼容。这对翻译有着重要的影响,因为可视化肿瘤的利润率在主站点,明确识别tumor-involved二级网站(12,13,20.,44- - - - - -46,图像引导的实时定位tumor-involved节点或残余组织切除后(14,47可能长期病人的结果。

目前,^111年In-capromab pendetide (Prostascint),抗体能识别PSMA的胞内抗原决定基,用作SPECT显像剂。这些扫描有助于早期诊断或参与,但可能是一个缺点在接触电离辐射的操作套件病人和外科医生可能会发生。NIR-labeled光学显像剂也获得关注各种癌症的肿瘤切除11,13,20.,48,49]。由于临床试验的成本,单代理与广泛的反应对许多癌症是有价值的,因为这种方法可以减少临床前毒性工作和开发新的GMP生产和制定过程个人代理(50]。PSMA neovasculature广泛表达的许多实体肿瘤(3,4,21,51),因此代理商针对这种蛋白质都非常适合临床翻译(21,22),它可能价值800 YC-27 cw添加到工具箱。使用近红外光谱fluorophore-labeled PSMA针对代理生产PSMA-positive肿瘤切除无残余积极利润率100%的动物,支持这种方法的使用前列腺肿瘤切除术(15]。未来的研究将需要定义的广泛的肿瘤疗效YC-27-based代理实体肿瘤。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

引用

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